游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位磁微粒化学发光法定量测定试剂盒及其制备方法

1.一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位磁微粒化学发光定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1）游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位系列校准品；2）抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体包被的磁微粒溶液；3）异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液；4）碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液；5）碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液；6）清洗液浓缩液；以及7）反应管。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒的反应管所使用的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯或者聚丙烯。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液是摩尔浓度为0.1～0.3M ，pH值为8～10的Tris-HCl缓冲液，其包含0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗液浓缩液为摩尔浓度为0.1～
0.2M，pH值为8～9的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量百分浓度为0.01～0.04%的吐温
20和质量百分浓度为15～20%的氯化钠。
5.一种制备权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于以下步骤：
1）游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位系列校准品的制备：用新生牛血清将人绒毛膜促性腺激素β亚单位纯品稀释为系列校准品，其校准品浓度范围为0～200ng/mL；
2）抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液的制备：将粒径为0.7～3μm的磁微粒加磁场，静置10～20min,倒出上清液，用pH=4.7的25mM的MES缓冲液清洗3次，并用该缓冲液进行悬浮，浓度为50mg/mL;每mL悬浮液中加入抗FITC多克隆抗体1～3 mg，在室温条件下混合均匀；用去离子水配制浓度为10mg/ mL的EDC溶液，每mL磁微粒悬浮液中加入1mL浓度为10mg/ mL的EDC溶液，在室温条件下搅拌反应4小时后，加磁场，静置10～20min,倒出上清液，用pH值为8.0、含有质量百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分浓度为
0.2%的叠氮化钠防腐剂的摩尔浓度为0.05~0.2M 的Tris-HCl缓冲液清洗3～5次，得到包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒，并用该缓冲液将包被抗FITC多克隆抗体的磁微粒配制成浓度为0.5～2μg/mL的抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液；
3）异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液的制备：将游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体置于透析袋，在pH=9.0，摩尔浓度为
0.2M的碳酸盐缓冲液中过夜透析；用摩尔浓度为0.2M的pH=9.0的NaHCO3溶液配制浓度为
0.5mg/mL的FITC溶液，每mg抗体加入0.15mL浓度为0.5mg/mL的FITC溶液，混合均匀，室温下反应20-24小时后，在pH=9.0，摩尔浓度为0.2M的碳酸盐缓冲液中过夜透析，即得Tris-HCl缓冲液稀释得到的异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体，得到浓度为0.25～0.5μg/mL的异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液；
4）碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体的制备：用去离子水配制13.76mg/mL 的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，取游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体预先装在尖底试管里，加入试管体积1/100的13.76 mg/mL 的2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液，混匀，在在室温下放置30分钟；计算所需要的碱性磷酸酶的量，即抗体的量乘以1；用无水N,N-二甲基甲酰胺配制6.69mg/mL 的Sulfo-SMCC溶液，在含有碱性磷酸酶的反应管中加入试管体积1/20的Sulfo-SMCC溶液溶液，混匀，在在室温下放置15分钟；
将上述活化后的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体中加入试管体积1/500的
1M MgCl2溶液，再加入活化后的碱性磷酸酶溶液，将试管放在4℃条件下14-16小时；安装蛋白质纯化系统,使用Superdex 20或类似制备柱，使用pH=7.0去离子水配制的质量百分浓度为2%的三乙醇胺溶液进行平衡，流速1ml/min，收集各洗脱峰流分，测定各洗脱峰流分的280nm处吸光值,收集280nm处吸光值大于0.02的流份，计算蛋白浓度(ABS1.0=0.6mg/ml)；用含质量百分浓度为0.5%的牛血清白蛋白和质量百分浓度为0.2%的叠氮化钠防腐剂的摩尔浓度为0.1M 的Tris-HCl缓冲液稀释上述得到的流份，得到浓度为0.25～0.5μg/mL的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液；
5）制备碱性磷酸酶所作用的法学发光底物液：向摩尔浓度为0.1～0.3M，pH值为8～
10的Tris-HCl缓冲液添加二氧杂环乙烷化合物(APCL)得到二氧杂环乙烷化合物的浓度为
0.2～0.4mg/mL的化学发光底物液；
6）清洗液浓缩液的配制：向摩尔浓度为0.1～0.2M、pH值为8～9的Tris-HCl缓冲液中加入吐温20和氯化钠，其中清洗液浓缩液中吐温20的质量百分浓度为0.01～0.04%，氯化钠的质量百分浓度为15～20%；
7）分装上述游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位系列校准品、抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒溶液、异硫氰酸荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液、碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体溶液、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液、清洗液浓缩液和反应管；
8）组装为成品。
6.根据权利5所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中:所述的磁微粒为0.7～3μm粒径、内核为四氧化三铁、表面包裹着含有羧基的聚合物，所述的抗体包被磁微粒是通过EDC一步法以抗FITC多克隆抗体包被的磁微粒。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤4）中，采用2-亚氨基硫羟烷盐酸盐溶液活化游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体；采用Sulfo-SMCC溶液活化碱性磷酸酶；使用蛋白质纯化系统, Superdex 200或类似制备柱纯化碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位单克隆抗体；使用pH=7.0去离子水配制的质量百分浓度为2%的三乙醇胺溶液作为流动相。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中，Tris-HCl缓冲液的摩尔浓度为0.2M， pH值为9.3，二氧杂环乙烷化合物(APCL)的终浓度为0.3mg/mL。

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