一种固氮菌和含有该固氮菌的生物肥料

1.一种联合固氮菌，其特征在于，所述的联合固氮菌是日勾维肠 杆菌(Enterobacter gergoviae)57-7，其保藏号为：CGMCC No.0510。
2.一种生物肥料，它含有权利要求1所述的固氮菌。
3.按照权利要求2所述的生物肥料，它还含有草炭。

本发明涉及一种固氮菌和含有该固氮菌的生物肥料。\n自1976年巴西Dobereiner实验室报道从禾本科植物根际分离得固 氮螺菌(Azospirillum spp)，并测定固氮螺菌对宿主的氮素供应达2KgN一 ha-1 d-1(后来的研究表明由于测定方法的问题，此数值偏高)。激起世 界范围的研究热。各研究组相继从禾本科作物根际分离多种固氮菌(统称 联合固氮菌)包括肠杆菌科、固氮菌科、芽孢杆菌科、假单孢菌科、螺菌 科的细菌。但研究最多的还是固氮螺菌，大量的文献报导固氮螺菌的生 理，生化及遗传特性并用固氮螺菌在田间做了大量的接种实验。目前国 际上固氮微生物制剂商业产品中最主要的是根瘤菌。以联合固氮菌 Azospirillum为主要商业产品只有法国的Azogreen TM，意大利、法国、 比利时联合生产的Zea-Net TM，美国的Azo-Green墨西哥的Biofertilizone para Maiz.这些产品商业规模都不大。1993年在乌拉圭召开以固氮螺菌 的农业应用为题的国际研讨会总结了20年来用固氮螺菌的田间接种实 验，由此研讨会总结的资料可反映出联合固氮菌在田间接种的概况。20 年的实验表明在不同地区和气侯条件下接种联合固氮菌对农业上一些重 要作物如玉米、水稻、小麦是有增产作用的，虽然很难精确估计接种实 验成功的百分数，用统计学上有意义的增产率5-30％计算，实验的成 功率在60-70％(有些失败的试验未报道)。但至今接种实验所用的菌株 都是野生型菌株。在中国用野生型联合固氮菌研制的菌剂产品名目繁 多，良莠参杂，据统计生产生物菌肥的厂家不下300家。应用菌株主要 是肠杆菌科的联合固氮菌Klebsiella pneumoniae，芽胞杆菌及根瘤菌。生 产量最多并形成产品的有保定微生物所生产的小麦根际联合固氮菌剂， 玉米根际联合固氮菌剂，推广面积达几百万亩，但由于增产效果不稳定 已停产。\n田间接种成功受很多因素影响，它依赖于起始细菌的特性，植物品 种、土壤类型、接种量和环境条件，而要更好的发挥接种微生物的作用， 其中一个重要环节是研究接种剂的配方，(包括菌和载体)以提供一个 合适的微环境以保证在产品贮存、运输、施用到土壤后，接种微生物的 存活率。联合固氮菌多数是非芽胞杆菌在土壤中存活率低对菌剂中保持 菌种存活率的条件要求亦更高。以草炭作为接种剂载体10年前在根瘤 菌制剂上已得到成功，并广泛得到应用。由于草炭是一不确定的复杂有 机物，使制造、贮存，应用过程有很大变异性，近10年有很多关于新 的合成聚合物和天然聚合物用作为微生物包裹剂，用这些聚合物包裹的 细菌细胞制成新型的微生物制剂，改进了传统草炭菌剂的缺点，大大提 高了微生物接种剂的在土壤中存活率，抗干旱能力和生物效益，是很有 潜力的，如法国的Azogreen TM但这类产品仍存在价格高，制作难度大， 对产业化设备要求高的问题。同时很多研究亦表明混合接种剂(多种微 生物组合)对植物的效应优于单一菌种，这也是微生物菌剂生产的一种 趋势。\n本发明的一个目的是筛选一种新的具有更好的固氮效果的固氮菌。\n本发明的另一个目的是提供一种含有本发明的新的固氮菌的生物肥 料。\n本发明人筛选到一种新的联合固氮菌，日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)57-7，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 进行了保藏(保藏中心地址：中国，北京，中关村，邮政编码：100080)， 保藏号为：CGMCC No.0510。保藏日为2000年11月28日。\nEnterobacter gergoviae 57-7特性：\nEnterobacter gergoviae  57-7属肠杆菌科肠杆菌属 (Enterrobacteriaceae)革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，E.gergoviae 57-7是 从四川灌县玉米根分离到的183株在无氮培养基中能生长的菌株中固氮 活性最高(用乙炔还原法测定)的菌株，分类位置是由中科院微生物所 分类室周慧玲先生鉴定并命名。\nE.gergoviae 57-7为革兰氏阴性发酵型固氮菌。细胞呈短杆状，周 生鞭毛，运动，利用葡萄糖，乳酸产气。从粘液酸不产酸，脲酶(+)，鸟 氨酸脱羧酶(+)，赖氨酸脱羧酶(+)，苯丙氨酸脱羧酶(-)，脱氨酸脱 羧酶(-)，吲哚(-)精氨酸双水解酶(-)，脱氧核糖核酸酶(-)，甲基 红(-)，VP试验(+)，在10℃生长，利用柠檬酸盐生长。经Rep-PCR 基因组指纹图谱分析得到E57-7的特征图谱。\nE.gergoviae 57-7在无机盐无氮培养基上生长良好，生长PH范围为 5-8.0生长最适温度30℃，35℃以上生长受明显抑制。在改良的KP培 养中E.gergoviae57-7固氮活性在培养15小时后达到高峰。活性可达8354 n mol C2H4/mg蛋白小时，随菌体生长培养基变酸，NH4+抑制固氮酶合 成，但固氮酶形成后固氮酶活性不受NH4+抑制，表明E.gergoviae 57-7中 不存在固氮酶的翻译后修饰机制。\nE.gergoviae 57-7含有一分子量300Kb的大质粒。而固氮基因簇定 位于染色体。DNA杂交及nifH：lacz活性测定表明E.gergoviae57-7含有 与模式菌K.pneunoniae相似的nifHDK及nifA基因，E.gergoviae 57-7 nifA 基因活化nifH：lacz的能力与NH4+和氧有关。\nE.gergoviae 57-7中类似nifA基因的产物对nifH：lacZ融合子表达 的影响 菌株 宿主基 因型 质粒特性       β-半乳糖苷酶活性单位       -O2        +O2(80r.p.m   +NH4+ -NH4+   +NH4+ -NH4+ E.gergoviae 57-7 E.gergoviae 57-7 (pSF2) K.pneumoniae Msal K.pneumoniae Msal (pSF2) 野生型 野生型 野生型 野生型 ----- K.p nifH：lacZ Tcr Ampr ----- K.p nifH：lacZ Tcr Ampr     24     13        5       14     61     6586      22     7992     17     16        16     15     34     2588      24     652\nE.gergoviae57-7能分泌IAA、GA等植物激素 Enterobacter gergoviae 57-7及E7分泌植物激素(kp液体培养基) 菌株                   植物激素分泌量(μg/ml.OD660＝1.0) Enterobacter gergoviae   吲哚乙酸IAA     赤霉素GA3      玉米素Z 野生型57-7                  0.027          0.023          0.057 工程菌E7                    0.023          0.023          0.044\n用扫描电镜观察及用标记基因gfp标记E.gergoviae57-7，在荧光显 微镜下观察E.gergoviae57-7在玉米根部的定殖表明，E.gergoviae57-7主 要定殖在根毛区及次生根裂隙处，显微镜观察免疫金银染色的石蜡切片 发现E.gergoviae57-7能侵入玉米根内在根皮层细胞间隙甚至木质部导 管内定殖。E.gergoviae57-7依靠植物根分泌的营养物繁延，随根系的生 长而扩展，亦能定殖于根际土壤依靠植物的残片生存。可以在土壤中运 动和通过流水或尘土传播。在55℃高温或0℃以下低温细菌容易死亡。 E.gergoviae亦可在动物粪便、污水、土壤中找到，是正常的肠道宿居 菌。经中国预防科学院流行病学微生物学研究所检验E.gergoviae 57-7 为非致病性病原体(表4)。肠杆菌科肠杆菌属的固氮细菌在世界各地不 同生态环境均有分布，并有不少利用这类固氮菌为研究材料的报道，但 用日勾维肠杆菌作研究材料的报道仅限本实验室和中国医科大学协和医 学院临床实验室。本实验室首次报导E.gergoviae的固氮能力及应用。 中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所对E.gergoviae57-7进行 致病性检测，检测结论：本检测菌株为非致病性病原体。中科院遗传所动 物实验中心用E.gergoviae 57-7活菌和死菌从肌肉和静脉注射大白免证 明E.gergoviae 57-7无致死和致病性。\n本发明还提供了一种生物肥料，它含有本发明的日勾维肠杆菌。这 种生物肥料所使用的载体可以是草炭。\n实施例    \n菌剂制备及接种方式\n用KP培养基培养E57-7，固体平板培养基含1.5％琼脂，种子罐及大 罐培养基含50mmoles NH4+ 30℃培养16-18小时菌数达8×109CFU/ml， 用草炭作载体与菌液混合(7∶3)制备菌剂，使菌数达1-2×109CFU/克菌 剂。\nKP培养基配方：\nNa2HPO4.12H2O       32g/L\nKH2PO4               0.68g/L PH8.0\n柠檬酸铁               36mg/L\nMgSO4                 30mg/L\nCaCl2.2H2O           26mg/L\nMnSO4                 0.3mg/L\nNa2MoO4.2H2O        7.6mg/L\n蔗糖                   20g/L\n酵母粉                 0.5g/L\n草炭菌剂采用拌种，做底肥或拌种加底肥，三种施用方法在正常施肥 条件下三种施用方法皆比无菌对照有增产作用。按增产幅度计算拌种 加做底肥＞做底肥＞拌种。施用量为1kg/666.7m2，5×107CFU/种子。\n接种E.gergoviae57-7对玉米的影响\n以1997年宝泉岭农场试验为例，在砂壤土的田间小区接种试验结果 表明，玉米接种野生型菌和无菌载体相比，在不同生育期地上部分、地 下部分干重皆有增加，这种效应在苗期比较明显。\n在土壤肥力较低的白浆土，砂壤土及黑土、黑钙土中接种E57-7对 玉米产量的影响皆优于无菌载体，但增产的幅度与土质有明显相关性。 在土壤肥力较低的白浆土、砂壤土中，不论施用化肥量为16.8kg/666.7m2 或20kg/666.7m2，接种E57-7比无菌载体增产平均幅度达到4.2％，在黑土 及黑钙土试验田，接种E57-7比无菌载体增产平均幅度达到9.2％。