一种有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留胆碱酯酶免疫层析速测卡

1.一种有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留胆碱酯酶免疫层析速测卡，其特征在于，所述速测卡包括底板(1)和封盖板(9)；所述底板(1)上包括若干组缓冲垫(2)，每个缓冲垫(2)上横跨若干个样品垫(3)，紧接着样品垫(3)还依次排列有酶垫(4)、检测膜(5)和吸水垫(8)；所述样品垫(3)、酶垫(4)、检测膜(5)和吸水垫(8)依次粘贴在底板(1)上；所述封盖板(9)上包括若干个加样孔(10)和若干个可视窗(11)；其中，所述检测膜(5)上表面并列包被有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物和抗生物酶抗体IgG；所述检测膜(5)上包被有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物作为检测线(6)，包被1条抗生物酶抗体IgG线作为质控线(7)；所述酶垫吸附有胶体金或量子点标记的胆碱酯酶；所述有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物的结构如下：
。
2.根据权利要求1所述有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留胆碱酯酶免疫层析速测卡，其特征在于，所述抗生物酶抗体IgG中的生物酶为来源于家蚕并通过基因改造的重组乙酰胆碱酯酶。
3.根据权利要求1所述有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留胆碱酯酶免疫层析速测卡，其特征在于，所述抗生物酶抗体IgG为兔多克隆抗体，其制备方法为将生物酶乳化后免疫新西兰大白兔，经过筛选获得的兔抗血清。
4.根据权利要求1所述有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留胆碱酯酶免疫层析速测卡，其特征在于，所述缓冲垫(2)和样品垫(3)的制备方法均为：将玻璃纤维纸或滤纸浸入pH 
6.4～7.2的Tris-HCl中或0.1mol/L、pH6.4～7.2的PBS缓冲液中，处理3～10min，取出干燥后即得；
所述酶垫(4)的制备方法为：采用滤纸作为材料，将滤纸浸入含有胆碱酯酶和稳定剂的溶液中，在15～25℃下搅拌浸泡25～50min，然后晾干，干燥10～15h。
5.根据权利要求1所述有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留胆碱酯酶免疫层析速测卡，其特征在于，所述加样孔(10)与缓冲垫(2)的数量相同，可视窗(11)与检测膜(5)的数量相同；当封盖板(9)与底板(1)结合形成检测卡后，加样孔(10)正对着缓冲垫(2)的正中间，可视窗(11)分别正对着检测膜(5)。
6.权利要求1所述速测卡在检测有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留方面的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述有机磷及氨基甲酸酯类农药为敌敌畏、蝇毒磷、仲丁威、对硫磷、呋喃丹、辛硫磷、杀扑磷、除线磷、喹硫磷、三唑磷、乙基谷硫磷、伏杀硫磷、速灭磷、氧乐果、异氯磷、恶虫威、杀螟腈、西维因、甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷、伐灭磷、碘硫磷、甲基毒死蜱或乙拌磷。

一种有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留胆碱酯酶免疫层析速\n测卡\n技术领域\n[0001] 本发明属于农药检测技术领域。更具体地，涉及一种有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留胆碱酯酶免疫层析速测卡。\n背景技术\n[0002] 农药是农业生产中用来防治病虫危害的重要农业生产资料，广泛用于果品、蔬菜以及粮食的生产中。农药在保证农副产品的丰收方面发挥了十分重要的作用。但是，近年来农药的滥用也给环境和人类的身体健康带来了巨大的威胁。越来越多的国家逐渐高度重视农药的滥用。由于农药种类繁多且复配使用现象普遍，建立可同时检测多个对象的多残留检测方法十分必要。仪器分析方法可以实现多残留检测，但是需要昂贵的仪器设备及专业操作人员，且样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足高通量、快速、在线检测的需要。\n[0003] 目前，发展快速多残留检测方法成为弥补仪器分析法之不足的重要手段。从20世纪80年起，基于有机磷和氨基甲酸酯类农药抑制胆碱酯酶活性原理而建立的“酶抑制法”开始被广泛应用于农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的快速筛查，由于其简便快速的特性而迅速得到十分广泛的应用。然而由于其灵敏度及稳定性较差已经逐步退出市场，目前仅韩国等少数发展中国家仍在使用。基于抗原抗体特异性结合反应的免疫分析法也能够用于部分农药的检测，但由于抗体制备困难，费用昂贵，并且不稳定，目前只能对某一种或一小类农药可以检测。发展具有更广谱性和稳定性的快速检测方法迫在眉睫。\n发明内容\n[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种农药多残留生物酶法速测卡，可以实现同时、简便、快速地检测食品和环境中的有机磷及氨基甲酸酯类农药，可应用水果、蔬菜及环境水样中多种农药残留的快速检测。\n[0005] 本发明的目的是提供一种有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留胆碱酯酶免疫层析速测卡。\n[0006] 本发明另一目的是提供所述速测卡在检测有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留方面的应用。\n[0007] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：\n[0008] 一种有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留胆碱酯酶免疫层析速测卡，所述速测卡包括底板 1和封盖板9；所述底板 1上包括若干组缓冲垫2，每个缓冲垫2上横跨若干个样品垫\n3（所述缓冲垫2一面粘贴在底板1上，缓冲垫2另一面粘贴样品垫3），紧接着样品垫3还依次排列有酶垫4、检测膜5和吸水垫8；所述样品垫3、酶垫4、检测膜5和吸水垫8依次粘贴在底板\n1上；所述封盖板9上包括若干个加样孔10和若干个可视窗11；其中，所述检测膜5上表面并列包被有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物（检测线6）和抗生物酶抗体IgG（质控线7）。\n[0009] 进一步地，所述检测膜5上包被有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物作为检测线6，包被1条抗生物酶抗体IgG线作为质控线7，有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物既可以与胆碱酯酶结合，也可以被抗生物酶抗体IgG识别。\n[0010] 其中，优选地，所述有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物的结构如下：\n[0011]\n[0012] 其中，优选地，所述偶联蛋白为牛血清蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。\n[0013] 优选地，所述抗生物酶抗体IgG中的生物酶为来源于家蚕并通过基因改造的重组乙酰胆碱酯酶。\n[0014] 具体更优选地，所述生物酶的获得方法如下：\n[0015] 本发明根据已知家蚕乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列，加以适当改动，并最大限度地利用了大肠杆菌偏爱的密码子，设计并合成了新的乙酰胆碱酯酶基因bmace片段。具体地，设计的新的乙酰胆碱酯酶基因bmace片段的序列如下所示：\n[0016]\nATGATCAACTACTGATCCTAGGCTGATCCTAATAGATTCTGATCCTATTGATCCTAAGGTACCCTATACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCTATCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCCCTATACTAGCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCGTGATCCTATGATCCTATGATCGATCTTGATCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCTAAGGATGATCCTACTTACGTAGCTATTGATCCTAGGATGATCCTATATGACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTTGATCCTATGATGATCCTATCCTACCTAGGCCGTATGACGTAGCTAGTACGTGATCCTAACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTCGATCTGATCCCTACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTCCTATACTAGGTGATCCTATGACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTCCTATGATCACCTATACTAGGTGATCCTATGACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTCCTATGATCCTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTGATCCTACTAGATTGATCCTACGACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCGTAGTAGCTGATCCTACTAGCTAGCTAGCTTCCCTTGATCCTATAGCTGATTGATCCTACTATAGTGATCCTACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCGATCTGATCCTGATCCTATGATCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCTATGATCCTATATTGCTTTG。\n[0017] 然后将该设计的新的乙酰胆碱酯酶基因bmace重组到融合表达载体（优选地，所用的融合表达载体可以是pET28(a)，pUC118或pEZZ318等）中，并转化到大肠杆菌中，通过大肠杆菌的培养获得了具有与天然乙酰胆碱酯酶相同生物活性的表达产物重组乙酰胆碱酯酶。\n[0018] 更具体地，上述重组乙酰胆碱酯酶的制备步骤如下：\n[0019] （1）序列设计：如上所述，设计好新的乙酰胆碱酯酶基因bmace片段；\n[0020] （2）构建重组表达载体：用NdeⅠ、BamHⅠ将新的乙酰胆碱酯酶基因bmace片段从重组质粒pUC118-CM中切下，插入到用NdeⅠ、Bam HⅠ消化的载体pET28(a)中，转化大肠杆菌BL21，得到的重组质粒命名为pET28(a)-CM；\n[0021] （3）转化大肠杆菌：借助NdeⅠ、Bam HⅠ消化载体pET28(a)的作用，将重组质粒pET28(a)-CM转化大肠杆菌BL21；\n[0022] （4）培养大肠杆菌获得重组乙酰胆碱酯酶：重组质粒pET28(a)-CM转化大肠杆菌BL21后，乙酰胆碱酯酶在T7启动子控制下，与一个分子量仅2000的小肽融合表达，最终获得重组乙酰胆碱酯酶。\n[0023] 另外，优选地，所述抗生物酶抗体IgG为兔多克隆抗体，其制备方法为将生物酶乳化后免疫新西兰大白兔，经过筛选获得的兔抗血清。\n[0024] 另外，优选地，所述底板1为一面涂有不干胶且不吸水的塑料板，起固定支持速测卡其他组成部分的作用并与封盖板9合并成速测卡。\n[0025] 优选地，所述缓冲垫2和样品垫3的制备方法均为：将玻璃纤维纸或滤纸浸入pH \n6.4～7.2的Tris-HCl中或0.1mol/L、pH6.4～7.2的PBS缓冲液中，处理3～10min（优选\n5min），取出干燥后即得。\n[0026] 优选地，所述干燥为于50～70℃（优选60℃）烘干、真空干燥或其他方式干燥。\n[0027] 所述的缓冲垫2和样品垫3在检测时起吸收样品溶液的作用，样品溶液通过缓冲垫\n2平均分到两个样品垫3上，并形成向上移动。\n[0028] 优选地，所述酶垫4的制备方法为：采用滤纸作为材料，将滤纸浸入含有胆碱酯酶和稳定剂的溶液中，在15～25℃（优选20℃）下搅拌浸泡25～50min（优选40min），然后晾干，在真空干燥器里干燥过夜10～15h（优选12h）。\n[0029] 优选地，所述稳定剂为质量分数为60%的蔗糖溶液。\n[0030] 优选地，所述的胆碱酯酶是用酶底物、胶体金或量子点等进行标记的。\n[0031] 所述酶垫4起固定并附着胆碱酯酶的作用。所述检测膜5粘贴在酶垫上。\n[0032] 另外在上述速测卡上，所述加样孔10与缓冲垫2的数量相同，可视窗11与检测膜5的数量相同；当封盖板9与底板1结合形成检测卡后，加样孔10正对着缓冲垫2的正中间，可视窗11分别正对着检测膜5。\n[0033] 优选地，所述吸水垫8为室温干燥的玻璃纤维纸、滤纸或吸水纸。吸水垫8的主要作用在于将移动上来的样品溶液吸收。\n[0034] 优选地，所述封盖板9为塑料板。\n[0035] 作为一种优选地可实施方案，本发明的速测卡包括一个底板1和一个封盖板9，所述底板 1上包括一个缓冲垫2，缓冲垫2上横跨两个样品垫3，酶垫4、检测膜5和吸水垫8各有两个。即如附图1所示，以底板 1上包括一个缓冲垫2，缓冲垫2上横跨两个样品垫3为例进行说明：所述速测卡包括底板 1和封盖板9；所述底板 1上包括一个缓冲垫2，缓冲垫2上横跨两个样品垫3（所述缓冲垫2一面粘贴在底板1上，缓冲垫2另一面粘贴样品垫3），紧接着每个样品垫3还依次排列有酶垫4、检测膜5和吸水垫8；所述样品垫3、酶垫4、检测膜5和吸水垫8依次粘贴在底板1上；所述封盖板9上包括一个加样孔10和两个可视窗11；其中，所述检测膜\n5上表面并列包被有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物（检测线6）和抗生物酶抗体IgG（质控线7）。\n[0036] 本发明农药速测卡的组装方法如下（以包含一个缓冲垫2为例）：\n[0037] 在底板1上依次粘贴两组样品垫3、酶垫4、检测膜5和吸水垫8，将缓冲垫2横跨在两个样品垫3上，然后将封盖板9盖上，加样孔10对着缓冲垫2正中间，两个可视窗11分别对着两个检测膜5。\n[0038] 另外，上述述速测卡在检测有机磷及氨基甲酸酯类农药多残留方面的应用，也在本发明的保护范围之内。\n[0039] 优选地，所述有机磷及氨基甲酸酯类农药为敌敌畏、蝇毒磷、仲丁威、对硫磷、呋喃丹、辛硫磷、杀扑磷、除线磷、喹硫磷、三唑磷、乙基谷硫磷、伏杀硫磷、速灭磷、氧乐果、异氯磷、恶虫威、杀螟腈、西维因、甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷、伐灭磷、碘硫磷、甲基毒死蜱或乙拌磷等。\n[0040] 另外，本发明的速测卡在应用时，可适用于任意的样本。\n[0041] 优选地，当检测样本为水样时，检测方法即结果的判定为：直接吸取环境水样滴加到加样孔10中，滴加几滴（优选4滴），静置平放3～5min后，若两个检测膜都出现线条，表明样品为阴性，不含有有机磷或氨基甲酸酯类农药，否则为阳性样品。无论样品为阴性或阳性，质控线应该出现线条，若质控线无线条，表明试纸失效。\n[0042] 当检测样本为水果蔬菜时，检测方法即结果的判定为：水果（取皮部分）或蔬菜切成小块，称取少量（优选1g）用少量（优选1mL）0.05mol/L含10%甲醇的PBS溶液提取8～15min（优选10min），3000～5500rpm离心3～10min（优选5000 rpm离心5min），取上清直接检测，方法及判断结果同水样。\n[0043] 本发明速测卡的检测原理为：\n[0044] 通过加样孔加入样品，样品通过缓冲垫到达样品垫，接着上移到酶垫。如果样品中含有有机磷或者氨基甲酸酯类农药，会与酶垫上的胆碱酯酶结合继续上移到检测线，因为酶垫上的胆碱酯酶只有一个结合位点，样品中的多残留农药与之结合之后，检测线上的有机磷及氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物就不能与胆碱酯酶结合，于是检测线（T）无线显现；当样品中没有有机磷和氨基甲酸酯类农药时，胆碱酯酶到达检测线（T）时就会被有机磷或氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物捕获，形成肉眼可见的线条。无论样品中是否含有有机磷或氨甲基氨酸酯类农药质控线（C）都会出现线条。因此，如果样品中只含有有机磷农药，上面检测膜上只出现一条线；如果样品中只含氨基甲酸酯类农药，下面检测膜上只出现一条线，如果两类农药都有时，上面检测膜和下面检测膜都会出现一条线。\n[0045] 从原理上，本发明超越了原有利用有机磷和氨基甲酸酯类农药可以抑制胆碱酯酶活性这一单一的特性来粗略地检测农药，在此基础上结合了免疫学的原理，在层析膜上包被有相应的有机磷及氨甲酸酯类农药蛋白偶联物和抗生物酶抗体IgG，结合物理层析，利用免疫胶体金卡的检测的结构模式，胆碱酯酶替代了原有检测对象的抗体，再运用胆碱酯酶本身作为一种抗原能与抗生物酶抗体IgG结合的原理来检测有害对象，这可以认为是胶体金检测卡同酶抑制法的一种结合。\n[0046] 从检测卡的构造上来看，本发明检测卡与现有技术中间接竞争法免疫胶体金检测卡结构类似，但现有技术中包被的是抗体，本发明包被的是胆碱酯酶，现有技术中包被的二抗，本发明包被的是抗生物酶抗体IgG；并且包被胆碱酯酶所用的材料在一定程度上优于酶抑制法所用的材料，因此在稳定性上将会更好。\n[0047] 从检测的效果上来看，本发明要比现有技术中的酶抑制法更准确，更稳定。现有的酶抑制法都只能粗略地检测农药的含量，而本发明结合了免疫检测卡的优点，对很多农药都有较低的检测限，且十分灵敏，同时引入了胆碱酯酶，使检测效果更灵敏。\n[0048] 本发明上述速测卡可同时检测有机磷和氨基甲酸酯类农药多残留，该速测卡包括底板和封盖板，以及至少两组依次粘贴的缓冲垫、样品垫、酶垫、检测膜、吸水垫；所述缓冲垫一面粘贴在底板上，另一面粘贴样品垫，缓冲垫上横跨粘贴至少两个的样品垫，紧接着样品垫依次粘贴酶垫、检测膜、吸水垫；所述封盖板上设有加样孔和可视窗，所述加样孔对着缓冲垫，所述可视窗分别对着检测膜；所述检测膜上表面并列包被农药蛋白偶联物和抗生物酶抗体IgG，分别形成检测线和质控线。该速测卡的原理是利用胆碱酯酶替代金标抗体的物理免疫层析分析方法，具有灵敏度高，适合现场筛选，简单、快速、成本低、样品所需量少、前处理简单方便等优点，用于超微量的农药检测具有极其广阔的市场前景。胆碱酯酶物理免疫层析是利用对有机磷及氨基甲酸酯类农药具有高度敏感性的胆碱酯酶能够直接同检测目标物分子结合的特性，然后再利用免疫层析原理进行测定的方法。其操作简便快速，几分钟即可看到结果，成本也非常低廉，适用于所有的有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测，填补了现有技术中利用胆碱酯酶连同免疫层析方法的农药多残留速测卡在国内外的空白。\n[0049] 本发明具有以下有益效果：\n[0050] （1）操作简单方便：本发明的速测卡操作简便、快速便捷、结果准确，对水果、蔬菜及环境水样品进行简单处理后即可检测，只需要通过辨别线条出现情况就可以判定样品中的农药残留情况。本速测卡不需任何仪器设备，普通非专业人员都可操作，用肉眼即可判读。\n[0051] （2）本发明速测卡的酶垫采用特殊的稳定剂来保持其中药物的稳定性，使其具有很强的抗干扰能力，并且能够长期保持活性。\n[0052] （3）高通量：可实现对有机磷和氨基甲酸酯类农药的同时检测；一张速测卡就可以实现两大类共几十种有毒农药微量残留的快速检出。\n[0053] （4）高灵敏度：本发明速测卡的检测灵敏度为0.008～0.987mg/kg，3～5 分钟即可观察结果，适合于对蔬菜、水果和环境水样中的有机磷及氨基甲酸酯类农药进行快速检测。\n[0054] （5）环保：卡片的制作采用易于降解的生物材料，无毒无害，安全可靠，对环境友好。\n附图说明\n[0055] 图1为本发明速测卡的结构示意图。\n具体实施方式\n[0056] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。\n[0057] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。\n[0058] 实施例1 本发明速测卡的结构\n[0059] 1、本发明速测卡包括底板和封盖板，底板上包括至少两组依次粘贴的缓冲垫、样品垫、酶垫、检测膜、吸水垫；所述缓冲垫一面粘贴在底板上，缓冲垫另一面粘贴样品垫，紧接着样品垫依次粘贴酶垫、检测膜、吸水垫；依次粘贴好后盖上所述封盖板即得所述速测卡；所述封盖板上设有加样孔和可视窗，所述加样孔对着缓冲垫，所述可视窗分别对着检测膜；所述检测膜上表面并列包被有机磷及氨甲酸酯类农药蛋白偶联物和抗生物酶抗体IgG，分别形成检测线和质控线。\n[0060] 进一步地，所述检测膜5上包被有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物作为检测线6，包被1条抗生物酶抗体IgG线作为质控线7，有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物既可以与胆碱酯酶结合，也可以被抗生物酶抗体IgG识别。\n[0061] 2、其中，所述有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物的结构如下：\n[0062]\n[0063] 其中，所述偶联蛋白为牛血清蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。\n[0064] 3、所述抗生物酶抗体IgG中的生物酶为来源于家蚕并通过基因改造的重组乙酰胆碱酯酶。所述生物酶的获得方法如下：\n[0065] 本发明根据已知家蚕乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列，加以适当改动，并最大限度地利用了大肠杆菌偏爱的密码子，设计并合成了新的乙酰胆碱酯酶基因片段。具体地，设计的新的乙酰胆碱酯酶基因bmace片段的序列如下所示：\n[0066]\nATGATCAACTACTGATCCTAGGCTGATCCTAATAGATTCTGATCCTATTGATCCTAAGGTACCCTATACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCTATCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCCCTATACTAGCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCGTGATCCTATGATCCTATGATCGATCTTGATCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCTAAGGATGATCCTACTTACGTAGCTATTGATCCTAGGATGATCCTATATGACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTTGATCCTATGATGATCCTATCCTACCTAGGCCGTATGACGTAGCTAGTACGTGATCCTAACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTCGATCTGATCCCTACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTCCTATACTAGGTGATCCTATGACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTCCTATGATCACCTATACTAGGTGATCCTATGACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTCCTATGATCCTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTGATCCTACTAGATTGATCCTACGACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCTCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCGTAGTAGCTGATCCTACTAGCTAGCTAGCTTCCCTTGATCCTATAGCTGATTGATCCTACTATAGTGATCCTACCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCGATCTGATCCTGATCCTATGATCCTATACTAGGTGATCCTATGATCCTATGATCCTATGATCCTATATTGCTTTG。\n[0067] 然后将该设计的新的乙酰胆碱酯酶基因bmace重组到融合表达载体（优选地，所用的融合表达载体可以是pET28(a)，pUC118或pEZZ318等）中，并转化到大肠杆菌中，通过大肠杆菌的培养获得了具有与天然乙酰胆碱酯酶相同生物活性的表达产物重组乙酰胆碱酯酶。\n[0068] 更具体地，上述重组乙酰胆碱酯酶的制备步骤如下：\n[0069] （1）序列设计：如上所述，设计好新的乙酰胆碱酯酶基因bmace片段；\n[0070] （2）构建重组表达载体：用NdeⅠ、BamHⅠ将新的乙酰胆碱酯酶基因bmace片段从重组质粒pUC118-CM中切下，插入到用NdeⅠ、Bam HⅠ消化的载体pET28(a)中，转化大肠杆菌BL21，得到的重组质粒命名为pET28(a)-CM；\n[0071] （3）转化大肠杆菌：借助NdeⅠ、Bam HⅠ消化载体pET28(a)的作用，将重组质粒pET28(a)-CM转化大肠杆菌BL21；\n[0072] （4）培养大肠杆菌获得重组乙酰胆碱酯酶：重组质粒pET28(a)-CM转化大肠杆菌BL21后，乙酰胆碱酯酶在T7启动子控制下，与一个分子量仅2000的小肽融合表达，最终获得表达产物。\n[0073] 单从表达产物的SDS-PAGE行为来看，含重组质粒和含空载质粒的菌体表达蛋白条带无差异（因二者在分子量6000左右都有一表达条带）。为了进一步鉴定表达产物，还要将表达产物进行活性测定，经过活性测定，获得了重组乙酰胆碱酯酶。\n[0074] 4、所述抗生物酶抗体IgG为兔多克隆抗体，其制备方法为将生物酶乳化后免疫新西兰大白兔，经过筛选获得的兔抗血清。\n[0075] 实施例2 本发明速测卡的结构\n[0076] 1、如附图 1 所示，本发明速测卡包括底板 1和封盖板9。\n[0077] 所述底板 1上包括一个缓冲垫2，以及两组样品垫3、酶垫4、检测膜5和吸水垫8。\n[0078] 其中，所述缓冲垫2为一个整体，横跨两个样品垫3上，所述两组样品垫3、酶垫4、检测膜5和吸水垫8依次粘贴在底板1上；所述检测膜5上表面并列包被有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物（检测线6）和抗生物酶抗体IgG（质控线7）。\n[0079] 所述封盖板9上包括加样孔10和可视窗11。\n[0080] 2、本发明上述速测卡各部分的功能与制备方法描述如下：\n[0081] （1）底板1：为一面涂有不干胶且不吸水的塑料板，起固定支持速测卡其他组成部分的作用并与封盖板9合并成速测卡。\n[0082] （2）缓冲垫2和样品垫3：将玻璃纤维纸浸入pH 6.4～7.2的Tris-HCl中5min，取出，真空干燥，即得缓冲垫2和样品垫3。缓冲垫2和样品垫3在检测时起吸收样品溶液的作用，样品溶液通过缓冲垫2平均分到两个样品垫3上，并形成向上移动。\n[0083] （3）酶垫4：起固定并附着胆碱酯酶的作用。\n[0084] 酶垫处理：将滤纸分别浸入含有胆碱酯酶及稳定剂的溶液中，选择在20℃下搅拌浸泡40min，然后晾干，放在真空干燥器里干燥过夜12h。\n[0085] （4）检测膜5：检测膜5上包被有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物作为检测线\n6，包被1条抗生物酶抗体IgG线作为质控线7，有机磷与氨基甲酸酯类农药蛋白偶联物既可以与胆碱酯酶结合，也可以被抗生物酶抗体IgG识别。\n[0086] （5）吸水垫8：采用室温干燥后的玻璃纤维纸、滤纸或吸水纸作为吸水垫。吸水垫8主要作用在于将移动上来的样品溶液吸收。\n[0087] （6）封盖板9：塑料板上面有加样孔10和可视窗11，加样孔10对着缓冲垫正中间，两个可视窗11分别对着两个检测膜5；封盖板9可以与底板1结合形成检测卡。\n[0088] 3、本发明农药速测卡的组装\n[0089] 如附图1所示，在底板1上依次粘贴两组样品垫3、酶垫4、检测膜5和吸水垫8，将缓冲垫2横跨在两个样品垫3上，然后将封盖板9盖上，加样孔10对着缓冲垫2正中间，两个可视窗11分别对着两个检测膜5。\n[0090] 实施例3 本发明速测卡的应用\n[0091] 1、本实施例的速测卡中酶垫4是吸附了酶底物标记的胆碱酯酶，这是本实施例速测卡的要点所在，其它部分构造与成分与实施例1相同。\n[0092] 2、利用该速测卡，按照本发明提供的检测方法，对几种常见茶叶中有机磷及氨基甲酸酯类农药的最低检测限如下表1所示：\n[0093] 表1 胆碱酯酶免疫层析速测卡对几种常见茶叶中农药的最低检测限（mg/kg）[0094]\n[0095] 实施例4 本发明速测卡的应用\n[0096] 1、环境水样的检测：直接吸取环境水样滴加到加样孔10中，滴加4滴，静置平放3～\n5min后。若两个检测膜都出现线条，表明样品为阴性，不含有有机磷或氨基甲酸酯类农药，否则为阳性样品。无论样品为阴性或阳性，质控线应该出现线条，若质控线无线条，表明试纸失效。\n[0097] 2、水果蔬菜样品的检测：水果（取皮部分）或蔬菜切成小块，称取1g用1mL \n0.05mol/L含10%甲醇的PBS溶液提取10 min，5000 rpm离心5min，取上清直接检测，方法及判断结果同环境水样。\n[0098] 3、本发明对有机磷及氨基甲酸酯类农药的检测限如表2所示。\n[0099] 表 2为本速测卡对有机磷及氨基甲酸酯类农药的检出限（mg/kg）\n[0100]\n[0101] 实施例5 本发明速测卡与市售检测卡的对比\n[0102] 1、选取7个空白样品（其中4个为池塘水样，3个为食品和蔬菜样品）添加适量氧乐果，同时采用本速测卡和市售速测纸片进行测定，并同时采用HPLC-MS/MS 方法进行确证，结果见表3。\n[0103] 表3 本速测卡与市售速测纸片对样品测定对比结果\n[0104]\n[0105] 从表3所示结果可以看出，本速测卡和市售速测纸片都可以较好地测出阴性样品。\n说明本发明速测卡具有更好的灵敏度，优于传统的速测纸片。