一种氨基甲酸酯类农药半抗原的新制备法

1、一种制备氨基甲酸酯类农药半抗原的方法，其特征在于包括以下步骤：
(a)把含羟基官能团的化合物A-OH溶于有机溶剂，以弱碱为反应的缚酸剂，滴加入 一定量溶于有机溶剂的对硝基苯卤甲酸酯，整个过程温度控制在-10℃-50℃，反应得到对硝 基苯碳酸酯类化合物；
(b)把对硝基苯碳酸酯类化合物溶于有机溶剂，在碱性条件下，与结构为 NH2-(CH2)n-COOH的有机物反应，合成氨基甲酸酯类农药的半抗原，
其中，n是从1-10的整数，A表示为(1)-(4)中的基团：

R1-R5为相同的或不同的氢原子、氯原子、烷基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷羰基、氯 代烷氧基、N，N-二烷基取代氨基、N，N-二链烯基取代氨基、N，N-烷基炔基取代氨基、 N，N-二烷基氨基取代亚氨基、二氧戊环基和烷基取代二氧戊环基；

R6-R10为氢原子或烷基；

R11-R18为相同的或不同的氢原子、烷基、苯基、N，N-二烷基取代氨基、N，N-二烷基取 代氨基甲酰基；

R19-R20为氢原子、烷基、烷硫基、烷基磺酰基、N，N-二烷基取代氨基甲酰基、腈基取 代烷基、腈基取代烷硫基。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的对硝基苯卤甲酸酯的结构式为：
其中X为Cl、Br或者为I。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的对硝基苯碳酸酯的结构式为：

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的有机溶剂保持无水状态，其用量为 反应物的溶解量；所述的碱为吡啶或者三乙胺，其摩尔用量为对硝基苯卤甲酸酯的 摩尔量的1-10倍；所述的含羟基官能团的化合物与对硝基苯卤甲酸酯的摩尔比为 1∶8-8∶1；整个过程温度为：滴加温度为-4℃-10℃，反应温度为0℃-50℃；整个体系 保持无水状态。
5、如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的有机溶剂是无水的二氯甲烷，其用 量为反应物的溶解量；所述的碱为吡啶，其摩尔用量为对硝基苯卤甲酸酯的摩尔量 的1-5倍；所述的含羟基官能团的化合物与对硝基苯卤甲酸酯的摩尔比为1∶4-4∶1； 整个过程温度为：滴加温度为-4℃-6℃，反应温度为10℃-40℃。
6、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的氨基甲酸酯类农药的半抗原的结构 式为：
其中n是从1-10的整数。
7、如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤b中的反应条件为，对硝基苯碳 酸酯溶于溶解量的四氢呋喃中，NH2-(CH2)n-COOH溶于溶解量的碳酸氢钠水溶液 中，将两种溶液混合后，4℃-40℃条件下发应，其中n是从1-10的整数。

技术领域\n本发明属于农药残留检测领域，涉及一种氨基甲酸酯类农药半抗原的新制备法。\n背景技术\n农药大量使用所造成的环境毒性问题，已经引起人们的高度重视。氨基甲酸酯类杀虫 剂是农药化学领域的一个重要分枝，与有机磷类、拟除虫菊酯类一起，成为杀虫剂的主 体。其商品化品种大约有40余种，其中吨位较大的约有10余种。1989年在世界杀虫剂市 场中，氨基甲酸酯类杀虫剂销售额占总杀虫剂销售额的21％，仅次于有机磷类，居第二位[1]。 近几年来，由于有机氯农药受到禁用，抗有机磷杀虫剂的昆虫品种增多，这就使得氨 基甲酸酯的用量逐年增加，因而环境、食品中的氨基甲酸酯类农药的残留情况备受关注， 其检测方法也日渐发展。由于氨基甲酸酯类农药不稳定，传统的分析方法很难快速、方 便、准确地检测，农药免疫分析方法的兴起[2-3]，为氨基甲酸酯类农药的免疫检测提供了新 思路。\n农药的免疫检测的基本原理是：脊椎动物机体具有免疫系统，在受到进入体内异源大 分子量物质刺激的时候能发生保护性应答(免疫应答)，产生特异性的保护物质(免疫球 蛋白——抗体)来识别该异源物质(抗原或免疫原)，并与之结合，从而“钝化”该物质以 排除其干扰。对于农药小分子化合物一般不具备免疫原性，即不能刺激动物的免疫应答反 应而产生抗体，但其具有反应原性，即能与相应抗体发生特异性结合反应。可以将农药小 分子以半抗原的形式通过一定碳链长度的连接分子(又称间隔臂)与分子量大的载体(蛋 白质)以共价键相偶联制备人工抗原，连接在载体蛋白质上的农药小分子便成为特定的抗 原决定簇。接下来以人工抗原免疫动物，产生对该农药分子具特异性的抗体。利用农药分 子的反应原性和抗体(或抗原)上标记物的生物放大或物理、化学放大作用，可对样本中 超微量农药残留进行定性定量检测。由于抗原抗体反应的特异性，大大简化甚至省去复杂 的样品前处理过程，避免了大量使用溶剂对实验人员的健康造成不良的影响和对环境的污 染，加快了分析速度。免疫分析一般不需要贵重仪器，具有便携性，对使用人员的专门技 术要求也不高，便于推广。由于小分子化合物免疫分析特异性强、灵敏度高、方便快捷、 安全廉价、适应性强，在超微量农药残留分析方面显示出独到的优势，被列为90年代优先 研究开发的新分析技术的第一位。\n在免疫分析中要获得对农药分子具高特异性和亲和力的抗体，首先制备具有高免疫原 性和特异性的人工抗原，人工抗原的制备包括两步：(1)合成保留农药分子结构且带活性 基团的半抗原。(2)使半抗原的活性基团与白蛋白、卵清蛋白等反应，得到抗原。所以成 功合成半抗原是免疫分析中最关键的步骤，一般从以下三个方面加以注意：(1)为增强免 疫反应时抗体对半抗原的免疫识别，减少二者相互作用时的空间障碍常需在半抗原与载体 蛋白之间插入4-6个碳链长的间隔臂(或连接分子)。间隔臂应尽量避免连结在目标分子的 官能团处或靠近官能团处，最好在位于重要的特征性官能团的远端，否则会减少抗体与目 标分子的识别和结合位点。(2)对某些不具备反应活性基团的则必须进行人工化学修饰， 将反应活性基团引入半抗原分子中，使之成为衍生物，然后才能与载体蛋白进行偶联反 应。反应活性基团包括羧基、羟基、氨基和疏基等。(3)保留农药分子结构，以增强抗体 对目标分子的特异性与亲和力。\n对于氨基甲酸酯类农药的免疫分析，国内外曾做过一些研究[4-8]。其中在氨基甲酸酯类 农药半抗原的合成中保留农药分子结构的方法通常是采用光气的方法，即将酚类物质与碱 反应生成酚盐，接着通入过量光气，形成氯甲酸萘酯的结构。这种合成方法使用了大量的 光气，而光气是一种毒性很大的气体，在操作的时候一定要避免泄漏，这增大了操作的难 度，也增加了生产中的危险性，并且极易造成环境的污染。实际这种方法也是传统的氨基 甲酸酯类农药的一种生产路线[9-10]。本合成方法在半抗原的设计中避开了光气的使用，采 用对硝基苯卤甲酸酯合成对硝基苯碳酸酯的结构。该发明避免了与光气的直接接触，增加 了生产的安全性，减少了对环境的污染，同时也取得了较好的产率。\n发明内容\n本发明提供了一种氨基甲酸酯类农药免疫分析中半抗原制备的新方法。所述方法如 下：(1)把含羟基官能团的化合物A-OH溶于有机溶剂，以弱碱为反应的缚酸剂，滴加入 一定量溶于有机溶剂的对硝基苯卤甲酸酯，整个过程温度控制在-10℃-50℃，反应得到对 硝基苯碳酸酯类化合物。(2)把对硝基苯碳酸酯类化合物溶于有机溶剂，在碱性条件下， 与结构为NH2-(CH2)n-COOH(n是从1-10的整数)的有机物反应，合成氨基甲酸酯类农药 的半抗原。\n上述制备方法中，含羟基官能团的化合物A-OH的A表示(1)-(4)的基团。\n\nR1-R5为相同的或不同的氢原子、氯原子、烷基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷羰基、氯 代烷氧基、N，N-二烷基取代氨基、N，N-二链烯基取代氨基、N，N-烷基炔基取代氨基、N，N- 二烷基氨基取代亚氨基、二氧戊环基和烷基取代二氧戊环基。\n\nR6-R10为氢原子或烷基。\n\nR11-R18为相同的或不同的氢原子、烷基、苯基、N，N-二烷基取代氨基、N，N-二烷基取 代氨基甲酰基。\n\nR19-R20为氢原子、烷基、烷硫基、烷基磺酰基、N，N-二烷基取代氨基甲酰基、腈基 取代烷基、腈基取代烷硫基，R19和R20也可以相互结合形成杂环。\n上述制备方法中，所述的对硝基苯卤甲酸酯的结构式为：\n(X为：Cl、Br、I)。所述的对硝基苯碳酸酯 的结构式为： 所述的合成得到的氨基甲酸酯类农药的半抗原。其结构 式为：\n上述制备方法中，对硝基苯卤甲酸酯活化含羟基官能团的化合物的反应条件为：\n(1)有机溶剂保持无水状态，更优选的为无水的二氯甲烷，其用量为反应物的溶解量。\n(2)碱为吡啶、三乙胺等有机碱，更优选为吡啶，其摩尔用量为对硝基苯卤甲酸酯的摩尔 量的1-10倍，更优选的为1-5倍。(3)含羟基官能团的化合物与对硝基苯卤甲酸酯的摩 尔比为1∶8-8∶1，更优选的为1∶4-4∶1。(4)整个过程温度为：滴加温度为-4℃-10℃，更优 选的为-4℃-6℃，反应温度为0℃-50℃，更优选的为10℃-40℃。整个体系保持无水状态。\n具体实施方案：\n(1)将含羟基官能团的化合物溶于有机溶剂，与弱碱混合，对硝基苯卤甲酸酯溶于有 机溶剂，磁力搅拌溶解后，把对硝基苯卤甲酸酯的溶液向含有羟基官能团的化合物和弱碱 的混合溶液中滴加，滴加过程保持-4℃-6℃。整个操作过程用氮气保护保持无水状态。薄 板层析跟踪反应，室温下反应进行1-5个小时结束。用乙醚和二氯甲烷对产品进行重结 晶，得到纯品对硝基苯碳酸酯。\n(2)把所得对硝基苯碳酸酯溶于四氢呋喃中，NH2-(CH2)n-COOH(n是从1-10的整数) 溶于碱性水溶液中，可选择溶解量的碳酸氢钠水溶液作为碱性水溶液，把四氢呋喃溶液滴 加入碱性水溶液中进行反应，薄板层析跟踪反应，确定反应结束时间。反应结束后，调节 反应液为酸性环境，用乙酸乙酯提取，提取液加无水Na2SO4干燥。产品用硅胶柱常压层析 纯化。得到氨基甲酸酯类半抗原。\n附图说明\n图11-萘基-4-硝基苯基碳酸酯的红外光谱图。从谱图中可以看出1770cm-1羰基(C＝O) 的特征吸收峰，1343cm-1和1521cm-1的硝基(-NO2)特征吸收峰。\n图21-萘基-4-硝基苯基碳酸酯的核磁共振氢谱图。从谱图中可以看出芳环氢原子7.2-8.4 的化学位移。\n图3牛血清蛋白(BSA)、牛血清蛋白和西维因半抗原的偶联物(BSA-CNH)的红外光 谱对比图。从谱图中可以看出：蛋白BSA有蛋白质类共有的3306cm-1、1653cm-1、 1538cm-1吸收峰。偶联产物BSA-CNH显示出了蛋白BSA 3306cm-1、1653cm-1和 1538cm-1的特征吸收外，还出现了1720cm-1处的氨基甲酸酯的羰基吸收峰，1225 cm-1处的半抗原中C-O-C的特征吸收峰。所以BSA-CNH兼有BSA和CNH的吸收 峰。\n上述方法将通过下面的实例进一步描述，但是提供的实例不能作为对此方法的限制。\n实施例1\n将0.8g萘酚溶于20ml无水二氯甲烷后，加入0.58ml无水吡啶形成混合溶液，向此混 合溶液中滴加溶有1g对硝基苯氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶液15ml，整个体系保持在-4℃-6 ℃。反应用氮气保护，保持无水状态。用薄板层析法(TLC)跟踪反应，确定反应时间。 用二氯甲烷和乙醚重结晶。得到淡黄色的1-萘基对硝基苯基碳酸酯晶体，收率为80％。通 过红外光谱表征，有羰基和硝基的特征峰(附图1)。通过核磁共振氢谱进一步证明所得 产物结构的正确性。(附图2)\n把上步制得的1-萘基对硝基苯基碳酸酯1.2mmol溶于四氢呋喃中，0.16g 6-氨基己酸 溶于碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持-4℃-4℃， TLC跟踪反应，确定反应时间。反应结束后，加HCl调反应液的pH为酸性，用乙酸乙酯 提取三次，提取液加无水Na2SO4干燥。然后浓缩至大约5ml，所得的溶液用硅胶柱常压层 析纯化。收集目标组分，减压蒸除溶剂得到白色晶体为氨基甲酸酯类农药西维因的半抗 原。收率在90％以上。\n实施例2\n将0.6g 3-甲基苯酚溶于15ml无水二氯甲烷后，加入0.58ml无水吡啶形成混合溶液， 向此混合溶液中滴加溶有1g对硝基苯氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶液15ml，整个体系保持 在-4℃-6℃。反应用氮气保护，保持无水状态。用TLC跟踪反应，确定反应时间。用二氯 甲烷和乙醚重结晶。得到淡黄色的3-甲基苯基对硝基苯碳酸酯晶体，收率为87％。通过红 外光谱表征，有羰基和硝基的特征峰，通过核磁共振氢谱进一步证明所得产物结构的正确 性。\n把上步制得的3-甲基苯基对硝基苯碳酸酯1.2mmol溶于四氢呋喃中，0.16g 6-氨基己 酸溶于碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持-4℃-6 ℃，TLC跟踪反应，确定反应时间。反应结束后，加HCl调反应液的pH为酸性，用乙酸 乙酯提取三次，提取液加无水Na2SO4干燥。然后浓缩至大约5ml，所得的溶液用硅胶柱常 压层析纯化。收集目标组分，减压蒸除溶剂得到白色晶体为氨基甲酸酯类农药速灭威的半 抗原。收率在90％以上。\n实施例3\n将0.8g 3，4-二甲基苯酚溶于无水15ml二氯甲烷后，加入0.58ml无水吡啶形成混合溶 液，向此混合溶液中滴加溶有1g对硝基苯氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶液15ml，整个体系 保持在-4℃-6℃。反应用氮气保护，保持无水状态。用TLC跟踪反应，确定反应时间。用 二氯甲烷和乙醚重结晶。得到淡黄色的3，4-二甲基苯基对硝基苯碳酸酯晶体，收率为85 ％。通过红外光谱表征，有羰基和硝基的特征峰，通过核磁共振氢谱进一步证明所得产物 结构的正确性。\n把上步制得的3，4-二甲基苯基对硝基苯碳酸酯1.2mmol溶于四氢呋喃中，0.16g 6-氨 基己酸溶于碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持-4℃- 4℃，TLC跟踪反应，确定反应时间。反应结束后，加HCl调反应液的pH为酸性，用乙酸 乙酯提取三次，提取液加无水Na2SO4干燥。然后浓缩至大约5ml，所得的溶液用硅胶柱常 压层析纯化。收集目标组分，减压蒸除溶剂得到白色晶体为氨基甲酸酯类农药巴沙的半抗 原。收率在90％以上。\n实施例4\n将0.9g2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃酚溶于15ml无水二氯甲烷后，加入0.58ml 无水吡啶形成混合溶液，向此混合溶液中滴加溶有1g对硝基苯氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶 液15ml，整个体系保持在-4℃-6℃。反应用氮气保护，保持无水状态。用TLC跟踪反应， 确定反应时间。用二氯甲烷和乙醚重结晶。得到淡黄色的呋喃酚对硝基苯基碳酸酯晶体， 收率为87％。通过红外光谱表征，有羰基和硝基的特征峰，通过核磁共振氢谱进一步证明 所得产物结构的正确性。\n把上步制得的呋喃酚对硝基苯基碳酸酯1.2mmol溶于四氢呋喃中，0.16g 6-氨基己酸溶 于碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持-4℃-6℃， TLC跟踪反应，确定反应时间。反应结束后，加HCl调反应液的pH为酸性，用乙酸乙酯 提取三次，提取液加无水Na2SO4干燥。然后浓缩至大约5ml，所得的溶液用硅胶柱常压层 析纯化。收集目标组分，减压蒸除溶剂得到白色晶体为氨基甲酸酯类农药呋喃丹的半抗 原。收率在90％以上。\n实施例5\n将0.86g 2-氯-4，5-二甲基苯酚溶于20ml无水二氯甲烷后，加入0.58ml无水吡啶形成 混合溶液，向此混合溶液中滴加溶有1g对硝基苯氯甲酸酯的无水二氯甲烷溶液15ml，整 个体系保持在-4℃-6℃。反应用氮气保护，保持无水状态。用TLC跟踪反应，确定反应时 间。用二氯甲烷和乙醚重结晶。得到淡黄色的2-氯-4，5-二甲基苯对硝基苯基碳酸酯晶 体，收率为73％。通过红外光谱表征，有羰基和硝基的特征峰，通过核磁共振氢谱进一步 证明所得产物结构的正确性。\n把上步制得的2-氯-4，5-二甲基苯对硝基苯基碳酸酯1.2mmol溶于四氢呋喃中，0.16g 6-氨基己酸溶于碳酸氢钠溶液，把四氢呋喃溶液逐滴加入碳酸氢钠溶液中，滴加过程保持- 4℃-6℃，TLC跟踪反应，确定反应时间。反应结束后，加HCl调反应液的pH为酸性，用 乙酸乙酯提取三次，提取液加无水Na2SO4干燥。然后浓缩至大约5ml，所得的溶液用硅胶 柱常压层析纯化。收集目标组分，减压蒸除溶剂得到白色晶体为氨基甲酸酯类农药氯灭杀 威的半抗原。收率在90％以上。\n实施例6\n称取实施例1制备的西维因的半抗原(CNH)0.43g利0.25g N-羟基琥珀酰亚胺置反应 瓶中，加入四氢呋喃溶解，另取0.59gN，N，-二环己基炭二亚胺溶于四氢呋喃，将此溶液 加入反应瓶中，室温搅拌反应，4小时结束。反应液在4℃条件下密闭静置，过滤，得活 化酯液。称取10mg牛血清蛋白(BSA)溶于1ml 0.05mol/L的碳酸盐缓冲液中，在磁力 搅拌下等量分次地将活化酯溶液滴加到BSA溶液中，反应一个小时结束。将反应液置透析 袋中，用磷酸盐缓冲液透析。所得透析产品即为西维因抗原(BSA-CNH)。通过红外(附 图3)可以鉴定半抗原和蛋白发生偶联反应生成抗原，进一步证明半抗原新合成方法的可 行性。\n参考文献\n[1]Hodgson E P.esticides-Past，Present and Future Rev[J].Pestic.Toxicol.1991，1(1)：3-12.\n[2]Newsome W.H.，Potential and Advantages of Immunochemical Methods for Analysis of Foods，J.ASSOC.OFF.ANAL.CHEM.，1986，69(6)：919-923\n[3]Vmderlaam M.，Stanker L.H.，Watkins B.E.and Roberts D.W.et al，Immunoassays for Trace Chemical Analysis Monitoring Toxic Chemicals in Humans，Food and the Environment， ACS Symposium Series，1991，451.\n[4]Abad A，Moreno M J，Montoya A.Development of Monoclonal Antibody-Based Immunoassays to the N-Methylcarbamate Pesticide Carbofuran[J].J.Agric.Food Chem，1999，47(6)：2475-2485.\n[5]Abad A，Moreno M J，Montoya A.Hapten Synthesis and Production of Monoclonal Antibodies to the N-Methylcarbamate Pesticide Methiocarb[J].J.Agric.Food Chem，1998，46(6)：2417- 2426.\n[6]Abad A，Montoya A.Production of Monoclonal antibodies for carbaryl from a Hapten 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