一种根瘤菌及其应用

1.一种根瘤菌的应用，其特征在于：将根瘤菌培养于YMA液体培养基至对数生长期，所得菌液喷洒在田菁种子表面，而后种植于黄河三角洲的盐碱地中的应用；
所述根瘤菌(Ensifer sp.)YIC4027，已于2015年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号），其保藏编号为CGMCC No.10994。

一种根瘤菌及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及改良盐碱地的技术，具体的说是一种根瘤菌及其应用。\n背景技术\n[0002] 根瘤菌是一类能与豆科植物形成根瘤或茎瘤行共生固氮的革兰氏阴性细菌。当根瘤菌与相匹配的豆科植物共生时，形成有效的共生组织—根瘤或茎瘤，在根瘤或茎瘤中根瘤菌将空气中的氮气转化为氨，提供给宿主植物作为氮源，而豆科植物则供给根瘤菌碳源和营养物质，两者形成很好的互利共生关系。\n[0003] 由于根瘤菌与豆科植物在互作过程中需要经历一系列互动式分子对话，且这种共生过程又会受到环境因素的影响，因而土著高效固氮根瘤菌将更好的适应当地环境，与当地豆科植物形成高效共生固氮体系。\n[0004] 田菁是一种耐盐、抗旱、耐涝、耐贫瘠能力很强的的豆科牧草，它在盐碱地改良中起着非常重要的作用。其茎叶不仅是很好的绿肥，还能做牛羊的饲料，茎部木质化的秸秆是造纸的好材料，其种子可以榨取田菁胶，用于油田采油。\n[0005] 田菁常用于盐碱地的改良，而盐碱地不仅盐碱含量高，而且面临缺少肥源。而根瘤菌可以与田菁共生，为田菁提供氮源，促进田菁健康成长，提升土壤肥力，在种植田菁改良盐碱地中发挥其重要作用。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的是提供一种根瘤菌及其在种植田菁改良盐碱地中的应用。\n[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：\n[0008] 一种根瘤菌，根瘤菌(Ensifer sp.)YIC4027，已于2015年6月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院\n3号)，其保藏编号为CGMCC No.10994。\n[0009] 所述根瘤菌由黄河三角洲盐碱土壤种植的田菁根瘤中分离筛选获得，其是一株高效固氮、耐盐碱能力强的快生型根瘤菌。对分离所得的菌株进行持家基因recA序列进行分析，并通过在GenBank中结果发现，本发明根瘤菌的recA基因与Ensifer sojae CCBAU \n05684T似性最高，为93.8％。从而确定分离出来的根瘤菌YIC4027为Ensifer的潜在新种，并命名为Ensifer sp.YIC4027。\n[0010] 根瘤菌的应用，所述根瘤菌在改良盐碱地中的应用。\n[0011] 进一步的是，所述根瘤菌在改良种植田菁的盐碱地中的应用。\n[0012] 再进一步的是，将所述根瘤菌培养于液体培养基培养中所得菌液喷洒在田菁种子表面，而后种植于黄河三角洲的盐碱地中的应用。\n[0013] 更进一步的是，将所述根瘤菌培养于YMA液体培养基至对数生长期，所得菌液喷洒在田菁种子表面，而后种植于黄河三角洲的盐碱地中的应用。\n[0014] 本发明所具有优点：\n[0015] 1.本发明的根瘤菌YIC4027具有高效结瘤固氮促生特性，接种该菌能够显著提高田菁生物量的33.86％，促生效果显著，能够达到增产目的；\n[0016] 2.接种本发明根瘤菌种植田菁后，田菁根周土壤盐浓度降低20％，土壤速效氮增加11.9％，速效磷增加17.72，速效钾增加18.52％，能够有效改良盐碱地；\n[0017] 3.本发明的根瘤菌YIC4027适用于种植田菁改良黄河三角洲盐碱化土壤，有很大的应用推广价值。\n附图说明\n[0018] 图1为本发明实施例提供的菌株YIC4027的菌落照片。\n[0019] 图2为本发明实施例提供的接种菌株YIC4027种植田菁的田间小区试验中促进田菁地上地下部分生物量增加效果。\n[0020] 图3为本发明实施例提供的接种菌株YIC4027种植田菁的小区试验中促进田菁茎粗度增加效果。\n[0021] 图4为本发明实施例提供的接种菌株YIC4027种植田菁的小区试验中对田菁主根侧根生长的增加效果。\n具体实施方式\n[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。\n[0023] 实施例1：根瘤菌的获得\n[0024] 从黄河三角洲盐碱化土壤种植地选取地上、地下部生长旺盛的田菁，采集根瘤，对根瘤进行表面消毒后，将根瘤捣碎，并将浸出液涂布于YMA平板上，28℃倒置培养3-5天，待长出边缘整齐、乳白色半透明、胞外多糖较多的圆形菌落时，挑取单菌落并反复划线直至纯化(参见图1)。\n[0025] YMA固体培养基(酵母提取物甘露醇琼脂培养基)配方为：甘露醇10g/L，酵母提取物3g/L，K2HPO4 0.25g/L，KH2PO4 0.25g/L，MgSO4 0.2g/L，CaCO3 3g/L，NaCl 0.1g/L，去离子水定容止1000mL，并分别分装至三角瓶中，每瓶加入终浓度为20g/L的琼脂粉。\n[0026] 1)根瘤菌的鉴定\n[0027] 革兰氏染色及形态鉴定：将上述纯化获得菌株经革兰氏染色结果为阴性，不产生芽孢，能运动，菌落湿润，中间隆起，边缘整齐；胞外多糖含量较高，为典型的根瘤菌特征。\n[0028] 分子鉴定：为了确定本实施根瘤菌菌株YIC4027的系统进化地位，对其持家基因recA的序列进行测序分析。\n[0029] 首先提取该菌株的总DNA，然后使用持家基因recA的通用引物recA41F/recA640R进行PCR扩增，并将PCR产物进行分析。序列如列表的序列1所示，其与Ensifer sojae CCBAU05684T相似性最高相似性为93.8％，从而确定菌株YIC4027为Ensifer的潜在新种。\n[0030] Ensifer sp.YIC4027的recA序列：\n[0031]\n[0032] 综合以上鉴定结果，将菌株YIC4027定名为Ensifer sp；Ensifer sp.YIC4027，已于2015年6月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.10994。Ensifer sp.YIC4027，简称菌株YIC4027。将上述根据温室种植田菁接种根瘤菌的筛选鉴定，将高效结瘤固氮菌株命名为YIC4027。\n[0033] 上述的根瘤菌菌株YIC4027与田菁共生结瘤固氮能力强、未进行遗传改造。当菌体被释放入自然环境后，对人、动植物无害，不污染环境，并能显著促进田菁的生长。\n[0034] 所得Ensifer sp.YIC4027根瘤菌菌株的实验室保藏方式：\n[0035] 短期保藏方式为，接种至YMA固体斜面，待菌株长好后保藏于4℃冰箱内，此保藏方式不超过3个月；\n[0036] 长期保藏方式为：将根瘤菌菌体加入终浓度为20％甘油中混匀并保藏至-80℃冰箱中，此保藏方式大约可保藏10年。\n[0037] 2)菌株YIC4027的耐盐碱能力分析\n[0038] 将菌株YIC4027培养至不同盐浓度梯度的培养基中测定该菌的的耐盐能进行实验分析，结果表明该菌能够耐受5％及以下的盐浓度；在pH为6-10培养基中生长良好。因此该菌有着较强的耐盐碱能力。\n[0039] 实施例2菌株YIC4027的菌剂制备应用\n[0040] 1)菌株活化\n[0041] 用灭菌后的接种环挑取YIC4027菌落，并在YMA固体培养基上划线，28℃倒置培养\n2-3天直至菌落长好。\n[0042] 2)扩大培养\n[0043] 用灭菌后的接种环挑取一到两环菌体，接种至200mL灭菌后的液体YMA液体培养基中，28℃、160转/分钟振荡培养24～48小时，培养至OD600≥1.5,即为待用菌剂。将菌剂放至\n4℃冰箱中，可保存1周。\n[0044] 3)根瘤菌的应用\n[0045] 实验时间为5月中下旬至10月上旬。平整土地，并起垄，垄间距约1.6m。\n[0046] 挑取健康、饱满、颗粒大小均匀的田菁种子，置于干净塑料盆中。\n[0047] 在阴凉无阳光处用小喷雾器将上述获得菌剂喷洒于田菁种子表面，并用铁铲或其他工具搅拌均匀，却保每粒种子上都粘上足够的菌剂。\n[0048] 粘有根瘤菌剂的种子要在阴凉处晾至不粘连为好以利于播种，不宜至阳光下暴晒，否则根瘤菌会被阳光中的紫外线杀死。\n[0049] 4.播种\n[0050] 实验组将喷洒有根瘤菌剂的种子均匀播种至整理好的试验田中，行间距为30cm，株距10cm，播种深度为5cm。\n[0051] 实验对照组不喷施根瘤菌剂，直接将种子播种至整理好的试验田中，行距、株距、种植深度都与实验组相同。\n[0052] 种完后，立即用大水漫灌，原因是田菁种皮较厚，需要大水浇灌才能促使其发芽，若事先将种子用温水泡胀后再种，可仅保持土壤湿润即可。\n[0053] 5.田间管理\n[0054] 田菁耐受土壤贫瘠能力较强，一般不需要施肥。耐病虫害，一般不需要打农药。苗期注意拔除杂草，田菁抗旱、耐涝能力较强，在黄河三角洲种植时一般不再需要浇水，在夏季，黄河三角洲有明显的雨季，田菁能够很好的耐受降雨的影响。小区试验结果显示菌株YIC4027在黄河三角洲试验田中占瘤率为100％，有很强的竞争结瘤能力。对种植田菁在收获季节10月上旬分别对田菁和根周5cm左右土壤进行取样分析(参见表1以及图2,3,4)。\n[0055] 表1土壤理化性质\n[0056]\n[0057] 对田菁地上部分株高、茎粗、地上部分干重、叶绿素含量及地下部分的干重、主侧根长度进行统计分析，试验结果如图1,2,3及表1所示，相比不接种根瘤菌的田菁，接种根瘤菌后田菁的地上部分生物量干重增加33.86％、茎粗度增加36.79％；此外接种菌株YIC4027后田菁的根系更加发达，根部重量增加72.73％、主根长度增加17.98％，侧根长度增加\n10.06％，如表1所示，相比不接种根瘤菌的田菁，接种菌株YIC4027后田菁根周5cm左右土壤营养元素显著增加，速效氮增加11.9％、速效磷增加17.72％、速效钾增加18.52％，土壤盐浓度降低20％。因此，菌株YIC4027在黄河三角洲种植田菁改良盐碱地应用中能够显著促进田菁的生长及生物量的提高，从而显著起到增产的目的；此外，盐碱地的盐浓度显著降低，土壤肥力显著提升。因而在黄河三角洲种植田菁改良盐碱化土壤过程中接种YIC4027可作为常规栽培措施之一。