一种生物功能化的金纳米棒分子探针及其制备方法和应用

1.一种生物功能化的金纳米棒分子探针，其特征在于所述分子探针是用胱胺二盐酸盐取代金纳米棒上的CTAB，然后用生物交联剂偶联特异性生物分子得到的；
所述特异性生物分子为叶酸、转铁蛋白或抗体分子；所述生物交联剂为EDC/NHS；
所述金纳米棒的长径比为4:1。
2.权利要求1所述生物功能化的金纳米棒分子探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：合成金纳米棒，用胱胺二盐酸盐取代金纳米棒上的CTAB，使金纳米棒表面氨基化，然后用EDC/NHS通过化学偶联方法与特异性生物分子上的羧基偶联，得到生物功能化金纳米棒分子探针。
3.根据权利要求1所述生物功能化的金纳米棒分子探针，其特征在于所述金纳米棒分子探针的制备方法包括如下步骤：
-4
（1）金纳米棒的制备：取5.0mL 5.0×10 mol/L氯金酸加入到5.0mL 0.20mol/-2
L CTAB溶液中，然后加入0.60mL 1.0×10 mol/L NaBH4，搅拌得到晶种；将3.0~15.0mL -3 -3
1.0×10 mol/L氯 金酸 加 入 到 含50~350μL 4.0×10 mol/L AgNO3和 3.0~15.0mL -1 -2
2.0×10 mol/L CTAB的溶液中，加入50~80μL 7.88×10 mol/L抗坏血酸，最后加入12μL晶种，恒温搅拌得到金纳米棒原液；
（2）用胱胺二盐酸盐取代金纳米棒上的CTAB：取金纳米棒原液5.0~20.0mL，离心-2
10~30min后重新分散在高纯水中，加入0.3~1.5mL，3.0×10 mol/L的胱胺二盐酸盐，在
30~60℃中超声2~5h后，离心10~30min，除掉CTAB和多余的胱胺二盐酸盐；
（3）步骤（2）所得用胱胺二盐酸盐取代CTAB的金纳米棒用叶酸偶联，得到叶酸生物功能化的金纳米棒分子探针。
4.根据权利要求3所述生物功能化的金纳米棒分子探针，其特征在于所述步骤（3）中，叶酸偶联的步骤如下：将5.0~20.0mL步骤（2）得到的用胱胺二盐酸盐取代CTAB的金-4
纳米棒分散在1.0~6.0mL浓度为5.0×10 mol/L的叶酸溶液中，加入10~60μL 0.10mol/L的EDC和 NHS的混合液，混匀后在4℃中反应1.5~4h，离心10~30min后分散在水中，超声
10~20min。
5.权利要求1、3~4中任意一条权利要求所述生物功能化的金纳米棒分子探针在分子标记物中的应用，其特征在于所述生物功能化的金纳米棒分子探针代替荧光染料，用于生物标记；
所述生物标记为细胞标记；
所述细胞标记为对细胞进行多色标记；
所述细胞为人肝癌细胞。
6.根据权利要求5所述生物功能化的金纳米棒分子探针的应用，其特征在于所述生物功能化的金纳米棒分子探针用于标记细胞时，当被488nm的激发波长激发，发出绿色荧光；
当被633nm的激发波长激发，发出红色荧光。

一种生物功能化的金纳米棒分子探针及其制备方法和应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及生物纳米材料的应用领域，具体涉及一种生物功能化的金纳米棒分子探针及其制备方法和应用。\n背景技术\n[0002] 随着荧光分析检测技术的发展，荧光染料在基因重组检测、流式细胞仪、DNA杂交测试、免疫检测、肿瘤细胞早期诊断等方面得到广泛应用。传统的荧光探针主要是有机荧光染料，存在诸多缺点，如容易光漂白，荧光稳定性较差，激发光谱窄，发射光谱宽；同时不同荧光染料分子需多个激发波长，不同颜色荧光分子的光谱容易相互重叠，使用两种以上的荧光分子进行多色标记操作繁琐；且一般荧光染料都在紫外可见区激发，使生物样品产生自发荧光，背景干扰大。量子点虽然能够克服以上局限，但量子点的细胞毒性较大，且合成困难，成本高，在其表面进行功能化复杂。研究认为理想的荧光探针应易于合成，荧光性质稳定，生物相容性好，表面功能化过程简单；具有近红外吸收和荧光发射功能，能够减少背景干扰，同时近红外光易于穿透组织实现深层组织的生物成像；在不同波长激发下，能够发出不同的荧光，从而能够用于细胞的多色标记，这是目前医用成像领域的研究热点。\n[0003] 金纳米棒是一种胶囊状的金纳米颗粒，其具有独特的表面等离子共振特性以及合成方法简单，成本低，生物相容性好，易于在其表面进行功能化修饰等优点。通过改变金纳米棒的长径比，其表面等离子共振吸收峰可从可见光区向近红外光区调控。近些年来陆续出现了利用双光子成像技术对金纳米棒标记的血管、组织和细胞进行成像的报道。但利用近红外光激发的双光子成像技术对金纳米棒标记的细胞进行成像时，易导致金纳米棒熔蚀和细胞的损伤。目前未见利用金纳米棒的荧光特性对细胞进行多色标记的报道。\n发明内容\n[0004] 本发明的目的在于根据传统有机荧光染料存在的缺陷，提供一种荧光性质稳定，生物相容性好，表面功能过程化简单，具有近红外吸收和荧光发射功能，同时能够用于细胞多色标记的表面生物功能化的金纳米棒分子探针。\n[0005] 本发明另一目的在于提供上述生物功能化的金纳米棒分子探针的制备方法。\n[0006] 本发明还有一个目的在于提供上述生物功能化的金纳米棒分子探针的应用。\n[0007] 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：\n[0008] 一种生物功能化的金纳米棒分子探针，所述分子探针是用胱胺二盐酸盐取代金纳米棒上的CTAB，然后用生物交联剂偶联特异性生物分子得到的。\n[0009] 作为一种优选方案，上述生物功能化的金纳米棒分子探针中，所述特异性生物分子为叶酸、转铁蛋白或抗体分子；所述生物交联剂为EDC/NHS。\n[0010] 本发明生物功能化的金纳米棒分子探针的制备方法包括如下步骤：合成金纳米棒，用胱胺二盐酸盐取代金纳米棒上的CTAB，使金纳米棒表面氨基化，然后用EDC/NHS通过化学偶联方法与特异性生物分子上的羧基偶联，得到生物功能化金纳米棒分子探针。\n[0011] 以下以特异性生物分子是叶酸为例，所述金纳米棒分子探针的制备方法包括如下步骤：\n[0012] (1)金纳米棒的制备：取5.0mL 5.0×10-4mol/L氯金酸加入到5.0mL0.20mol/-2\nL CTAB溶液中，然后加入0.60mL 1.0×10 mol/L NaBH4，搅拌得到晶种；将3.0～15.0mL -3 -3\n1.0×10 mol/L氯金酸加入到含50～350μL 4.0×10 mol/LAgNO3和3.0～15.0mL -1 -2\n2.0×10 mol/L CTAB的溶液中，加入50～80μL7.88×10 mol/L抗坏血酸，最后加入\n12μL晶种，恒温搅拌得到金纳米棒原液；\n[0013] (2)用胱胺二盐酸盐取代金纳米棒上的CTAB：取金纳米棒原液5.0～20.0mL，离-2\n心10～30min后重新分散在高纯水中，加入0.3～1.5mL，3.0×10 mol/L的胱胺二盐酸盐，在30～60℃中超声2～5h后，离心10～30min，除掉CTAB和多余的胱胺二盐酸盐；\n[0014] (3)步骤(2)所得用胱胺二盐酸盐取代CTAB的金纳米棒用叶酸偶联，得到叶酸生物功能化的金纳米棒分子探针。\n[0015] 作为一种优选方案，上述制备方法中，所述步骤(3)中，叶酸偶联的步骤如下：将\n5.0～20.0mL步骤(2)得到的用胱胺二盐酸盐取代CTAB的金纳米棒分散在1.0～6.0mL-4\n浓度为5.0×10 mol/L的叶酸溶液中，加入10～60μL 0.10mol/L的EDC和NHS的混合液，混匀后在4℃中反应1.5～4h，离心10～30min后分散在水中，超声10～20min。\n[0016] 本发明的基本技术原理为：采用胱胺二盐酸盐取代纳米金棒上的CTAB；将特异性生物分子偶联在纳米金棒的表面，利用特异性生物分子和癌细胞表面高度表达的受体分子间特异性结合来特异性标记癌细胞，同时利用金纳米棒独特的光学性质，实现对癌细胞的多色标记。用胱胺二盐酸盐取代纳米金棒上的CTAB，以降低金纳米棒的生物毒性。以叶酸为模型特异性生物分子，将特异性生物分子偶联在金纳米棒表面，有助于提高金纳米棒对细胞的特异性标记作用。通过调控金纳米棒激发波长使金纳米棒发出不同颜色荧光应用于细胞的多色标记。\n[0017] 本发明生物功能化的金纳米棒分子探针可替代荧光染料，作为分子标记物用于分子标记。\n[0018] 作为一种优选方案，所述生物标记为细胞标记或组织标记；所述细胞标记为对细胞进行单色标记或对细胞进行多色标记。\n[0019] 本发明生物功能化的金纳米棒分子探针用于标记细胞时，当被488nm的激发波长激发，发出绿色荧光；当被633nm的激发波长激发，发出红色荧光。\n[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：\n[0021] (1)本发明用胱胺二盐酸盐取代纳米金棒上的CTAB；采用生物偶联剂将胱胺二盐酸盐上的活性氨基和具有特异性识别功能的生物分子上的活性羧基偶联生成生物功能化的金纳米棒分子探针，从而实现对细胞的特异性标记。该生物功能化的金纳米棒分子探针，荧光稳定性好生物相容性好，表面功能化过程简单，具有近红外吸收和荧光发射功能，同时能够用于细胞的多色标记；\n[0022] (2)激光共聚焦显微镜成像结果表明本发明的生物功能化金纳米棒分子探针能够特异性标记HepG2人肝癌细胞。分别调控不同激发波长可发出绿色或红色荧光，表明将金纳米棒作为荧光探针标记细胞以及金纳米棒代替传统荧光染料进行细胞的多色标记是可行的。\n附图说明\n[0023] 图1为本发明所制备的金纳米棒的透射电镜图，所制得的金纳米棒的长径比约为\n4∶1；\n[0024] 图2为叶酸偶联前后金纳米棒的吸收光谱，结果表明叶酸分子偶联至金纳米棒表面；\n[0025] 图3为叶酸偶联前后金纳米棒的红外光谱，结果表明叶酸分子偶联至金纳米棒表面；\n[0026] 图4为金纳米棒的荧光光谱图，结果表明金纳米棒可作为一种应用于多色标记的荧光探针；\n[0027] 图5为金纳米棒的倒置荧光显微镜成像，结果表明金纳米棒可作为一种应用于多色标记的荧光探针，左图显示为绿色荧光，右图显示为红色荧光；\n[0028] 图6为金纳米棒与荧光染料罗丹明B的荧光稳定性比较，结果表明金纳米棒比荧光染料罗丹明B具有更好的光稳定性；\n[0029] 图7为叶酸表面功能化的金纳米棒标记HepG2人肝癌细胞的激光共聚焦显微镜成像，结果表明通过调控不同的激发波长，可以使金纳米棒发射出不同颜色的荧光，金纳米棒可作为一种荧光探针用于细胞的标记，并可代替荧光染料应用于细胞的多色标记；左图为绿色荧光，中图为红色荧光，右图为左图和中图的重叠。\n具体实施方式\n[0030] 以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。\n[0031] 实施例1表面生物功能化的金纳米棒分子探针及其制备方法和应用[0032] (1)一定长径比的金纳米棒的制备：\n[0033] 取5.0mL 5.0×10-4mol/L的氯金酸加入到5.0mL 0.20mol/LCTAB溶液中，然-2 -3\n后加入0.60mL 1.0×10 mol/LNaBH4，搅拌得到晶种；将3.0mL1.0×10 mol/L氯金酸加-3 -1\n入到含50μL 4.0×10 mol/LAgNO3，3.0mL 2.0×10 mol/L CTAB的溶液中，加入50μL -2\n7.88×10 mol/L抗坏血酸，最后加入12μL晶种，恒温搅拌得到金纳米棒原液。金纳米棒的长径比约为4∶1(图1)。\n[0034] (2)用胱胺二盐酸盐取代金纳米棒上的CTAB的制备：\n[0035] 取金纳米棒原液5.0mL，离心10min后重新分散在高纯水中，加入0.3mL，-2\n3.0×10 mol/L的胱胺二盐酸盐，在30℃中超声2h后，离心10min，离心除掉CTAB和多余的胱胺二盐酸盐。\n[0036] (3)在金纳米棒表面偶联叶酸的制备：\n[0037] 将5.0mL步骤(2)得到的用胱胺二盐酸盐取代CTAB的金纳米棒分散在1.0mL浓-4\n度为5.0×10 mol/L的叶酸溶液中，加入10μL 0.10mol/L的EDC和NHS的混合液，混匀后在4℃中反应1.5h，离心10min后分散在水中，超声10min，得叶酸功能化金纳米棒(表征见图2～3)。\n[0038] (4)金纳米棒的荧光特性：用荧光分光光度计和倒置荧光显微镜研究金纳米棒的荧光特性。实验结果表明(见图4～5)，金纳米棒可作为一种应用于多色标记的荧光探针。\n[0039] (5)金纳米棒的荧光稳定性：用熵灯连续照射，对金纳米棒与荧光染料罗丹明B的荧光稳定性进行比较，结果表明(图6)，金纳米棒比荧光染料罗丹明B具有更好的光稳定性。\n[0040] (6)金纳米棒标记HepG2人肝癌细胞的激光共聚焦显微镜成像：在488nm激发下，检测金纳米棒在530～600nm通道的激光共聚焦图像，在633nm激发下，检测金纳米棒在\n650～720nm通道的激光共聚焦图像。结果表明(图7)，通过调控不同的激发波长，可以使金纳米棒发射出不同颜色的荧光，金纳米棒可作为一种荧光探针用于细胞的标记，并可代替荧光染料应用于细胞的多色标记。\n[0041] 实施例2表面生物功能化的金纳米棒分子探针及其制备方法和应用[0042] (1)一定长径比的金纳米棒的制备：\n[0043] 取5.0mL 5.0×10-4mol/L的氯金酸加入到5.0mL 0.20mol/LCTAB溶液中，然后-2 -3\n加入0.60mL 1.0×10 mol/LNaBH4，搅拌得到晶种；将15.0mL 1.0×10 mol/L氯金酸加入-3 -1\n到含350μL 4.0×10 mol/L AgNO3，15.0mL 2.0×10 mol/L CTAB的溶液中，加入80μL -2\n7.88×10 mol/L抗坏血酸，最后加入12μL晶种，恒温搅拌得到金纳米棒原液。\n[0044] (2)用胱胺二盐酸盐取代金纳米棒上的CTAB的制备：\n[0045] 取金纳米棒原液20.0mL，离心30min后重新分散在高纯水中，加入1.5mL，-2\n3.0×10 mol/L的胱胺二盐酸盐，在60℃中超声5h后，离心30min，离心除掉CTAB和多余的胱胺二盐酸盐。\n[0046] (3)在金纳米棒表面偶联叶酸的制备：\n[0047] 将20.0mL步骤(2)得到的用胱胺二盐酸盐取代CTAB的金纳米棒分散在6.0mL浓-4\n度为5.0×10 mol/L的叶酸溶液中，加入60μL 0.10mol/L的EDC和NHS的混合液，混匀后在4℃中反应4h，离心30min后分散在水中，超声20min，得叶酸功能化金纳米棒。实验结果叶酸已经到金纳米棒表面。\n[0048] (4)金纳米棒的荧光特性：金纳米棒的荧光特性实验方法同实施例1。实验结果表明，金纳米棒可作为一种应用于多色标记的荧光探针。\n[0049] (5)金纳米棒的荧光稳定性：金纳米棒的荧光稳定性实验方法同实施例1，结果表明，金纳米棒比荧光染料罗丹明B具有更好的光稳定性。\n[0050] (6)金纳米棒标记HepG2人肝癌细胞的激光共聚焦显微镜成像：金纳米棒标记HepG2人肝癌细胞的激光共聚焦显微镜成像的方法同实施例1，结果表明，金纳米棒可作为一种荧光探针用于细胞的标记，并可代替荧光染料应用于细胞的多色标记。\n[0051] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。