一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽及其制备方法和用途

1.一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽，其特征在于该抗氧化胶原肽的氨基酸序列为Phe-Ile-Gly-Pro-Trp，ESI-MS检测给出分子量为618.75 Da。

一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽及其制备方法和用途\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种生物活性肽及其制备方法和用途，尤其涉及一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽及其制备方法和用途。\n背景技术\n[0002] 马面鲀是我国的一种常见鱼类。马面鲀皮较厚且硬，故捕捞后，若时间允许，即就地扒皮，其肉入库冷藏，待食用，其皮就地扔掉，造成资源的浪费和环境污染。目前，已有研究利用马面鱼皮用于制革工业、制备胶原蛋白，以及分离纯化精氨酸和脯氨酸。而以马面鲀鱼皮为原料，利用酶解技术进行胶原肽的开发，也将为马面鲀鱼皮的高值化利用奠定基础。\n[0003] 但是，申请人发现，以马面鲀鱼皮为原料，利用酶解技术制备马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性鱼肉抗氧化肽及其应用更是未见报道。\n发明内容\n[0004] 本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽，该多肽抗氧化活性强，可有效清除自由基和抑制脂质过氧化作用。\n[0005] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽的制备方法。\n[0006] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽的应用。\n[0007] 本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽，其特征在于该抗氧化胶原肽的氨基酸序列为Phe-Ile-Gly-Pro-Trp（SEQ No ID:\n1），ESI-MS检测给出分子量为618.75 Da（[M+H]+ 619.63 Da）。\n[0008] 本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：\n[0009] 1）鱼皮预处理：将马面鲀鱼皮绞碎，按照料液比1 g:3 5 mL加异丙醇，于4℃下浸~\n泡4 8 h，每2 h换异丙醇一次，得脱脂鱼皮；脱脂鱼皮于35 40℃充分干燥后，按照料液比1 ~ ~\ng: 5 10 mL加入0.5 mol/L EDTA-2Na溶液（pH 7.4），于4℃下浸泡3 5天，每天更换1次~ ~\nEDTA-2Na溶液，得脱脂、脱钙鱼皮；脱脂、脱钙鱼皮35 40℃充分干燥后按照料液比1 g:15~ ~\n20 mL加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡4 6 h，每2 h换NaOH溶液一次，得脱脂、脱钙和脱~\n非胶原蛋白鱼皮，于35 40℃充分干燥；\n~\n[0010] 2）酶解：将充分干燥的脱脂、脱钙和脱非胶原蛋白马面鲀鱼皮按照料液比1 g:8~\n12 mL加入到缓冲液中，调pH值至9. 0 10.0，于45 55℃保温10 15 min，按照鱼皮质量的2~ ~ ~ ~\n3%加入蛋白酶，于45 55℃酶解4 6 h；\n~ ~\n[0011] 3）抗氧化胶原肽的制备：将酶解液于沸水浴中灭活10 15 min，10000 12000 r/~ ~\nmin离心15 20 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化胶原肽。\n~\n[0012] 作为优选，所述步骤1）中的马面鲀为绿鳍马面鲀（Navodon septentrionalis）。\n[0013] 作为优选，所述步骤2）中的缓冲液为甘氨酸-NaOH缓冲液（0.05 mol/L，pH 9.6）。\n[0014] 作为优选，所述步骤2）中的蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥1.9×105 U/g。\n[0015] 作为改进，所述步骤3）的超滤和层析的具体过程为：\n[0016] 超滤：将上清液调至pH 6.5 7.5，用截留分子量为5 kDa和1 kDa的超滤膜进行超~\n滤处理，收集分子量小于1 kDa组分，得超滤酶解物；\n[0017] 层析：将上述超滤酶解物用双蒸水配成30 50 mg/mL的溶液，经过DEAE-52 纤维素~\n阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.45 0.55 mol/L和0.90 1.10 mol/L NaCl溶液进行洗~ ~\n脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成20 30 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝~\n胶G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成90 100 ~\nμg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据抗氧化活性得1个高活性抗氧化胶原肽Phe-Ile-Gly-Pro-Trp。\n[0018] 优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15 25 μL；色谱柱为Zorbax SB C-18 column ~\n（4.6 × 250 mm）；柱温为25 30 ℃；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脱：0~ ~\n30 min乙腈浓度从0匀速升至50%；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长280 nm。\n[0019] 本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽的用途，其特征在于Phe-Ile-Gly-Pro-Trp对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Phe-Ile-Gly-Pro-Trp亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Phe-Ile-Gly-Pro-Trp具有显著的抗氧化活性，可用作药品、保健食品或食品添加剂。\n[0020] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明选用碱性蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，制得的胶原肽具有显著的抗氧化活性，且具有易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作药品、保健食品或食品添加剂。\n附图说明\n[0021] 图1是本发明的马面鲀鱼皮超滤分段组分（BSH-III）的阴离子交换树脂DEAE-52 纤维素层析图；\n[0022] 图2是本发明的阴离子交换层析分离组分（BSH-III-4）的葡聚糖凝胶G-15层析图；\n[0023] 图3是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备酶解物（Fr.3）的RP-HPLC图；\n[0024] 图4是本发明的Phe-Ile-Gly-Pro-Trp的质谱（ESI-MS）图和结构式；\n[0025] 图5是本发明的Phe-Ile-Gly-Pro-Trp的脂质过氧化抑制作用。\n具体实施方式\n[0026] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。\n[0027] 一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽的制备方法，制备工艺流程如下：马面鲀鱼皮"脱钙、脱脂、脱非胶原蛋白"酶解"超滤"离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"抗氧化胶原肽。\n[0028] 实施例1：\n[0029] 1）鱼皮预处理：将绿鳍马面鲀鱼皮绞碎，按照料液比1 g:5 mL加异丙醇，于4℃下浸泡6 h，每2 h换异丙醇一次，得脱脂鱼皮；脱脂鱼皮40℃充分干燥后，按照料液比1 g:8 mL加入0.5 mol/L EDTA-2Na溶液（pH 7.4），于4℃下浸泡4天，每天更换1次EDTA-2Na溶液，得脱脂、脱钙鱼皮；脱脂、脱钙鱼皮40℃充分干燥后按照料液比1 g:15 mL加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡6 h，每2 h换NaOH溶液一次，得脱脂、脱钙和脱非胶原蛋白鱼皮，40℃充分干燥。\n[0030] 2）酶解：将脱脂、脱钙和脱非胶原蛋白马面鲀鱼皮按照料液比1 g:10 mL加入到甘氨酸-NaOH缓冲液（0.05 mol/L、pH 9.6）中，调pH值至9.5，于50℃保温10 min，按照鱼皮质量的2%加入碱性蛋白酶（酶活力≥1.9×105 U/g），于50℃酶解5 h。\n[0031] 3）抗氧化胶原肽的制备：将酶解液于沸水浴中灭活10 min，12000 r/min离心15 min，取上清液；上清液依次经超滤和层析，得到抗氧化胶原肽。\n[0032] ①超滤：将酶解上清液调至pH 7.0，采用截留分子量为5 kDa和1 kDa的超滤膜进行超滤处理，根据自由基清除活性，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解物（BSH-III）（表1）；\n[0033] ②DEAE-52纤维素阴离子交换层析：将上述超滤酶解物（BSH-III）用双蒸水配成50 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用双蒸水、0.50 mol/L和1. 0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物（BSH-III-4）（表1和图1）；\n[0034] ③凝胶层析：将上述离子交换层析酶解物（BSH-III-4）用双蒸水配成25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物（Fr.3）（表1和图2）；\n[0035] ④高效液相色谱精制：将上述凝胶制备酶解物（Fr.3）用双蒸水配成100 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化（条件：进样量20 μL；色谱柱为Zorbax SB C-18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱温为25℃；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脱：0-30 min乙腈浓度从0匀速升至50%；紫外检测波长280 nm，根据自由基清除活性得1个高活性抗氧化胶原肽（表1和图3）。\n[0036] ⑤结构检测：收集自由基清除活性最高的1个抗氧化肽，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Phe-Ile-Gly-Pro-Trp，ESI-MS检测给出分子量为618.75 Da（[M+H]+ \n619.63 Da）（图4）。\n[0037] 将上述制得的马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽Phe-Ile-Gly-Pro-Trp进行DPPH自由基清除实验、羟基自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验。实验结果表明：Phe-Ile-Gly-Pro-Trp对DPPH 自由基 (EC50 0.078 mg/mL)、羟基自由基（EC50 \n0.064 mg/mL）和超氧阴离子自由基(EC50 0.228 mg/mL)具有良好的清除作用；同时，Phe-Ile-Gly-Pro-Trp亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用（图5）。\n[0038] 表1. 马面鲀鱼皮酶解物及其分段部位自由基清除活性（EC50为自由基清除率为\n50%时样品的浓度）\n[0039]\n[0040] 最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。