一种枯草芽孢杆菌及其在防治设施蔬菜连作障碍中的应用

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一种枯草芽孢杆菌及其在防治设施蔬菜连作障碍中的应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物技术和农业病害防治技术领域，具体地说，它涉及一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis及其在防治设施蔬菜连作障碍中的应用。\n背景技术\n[0002] 据联合国粮农组织调查资料显示，全球每年被病虫害夺去的农作物占收成的\n20％～30％，由此造成的经济损失达1200亿美元。目前主要是通过喷洒化学试剂来防治。\n但是由于大量使用化学农药，造成了空气、水源、土壤和食物不同程度的污染，甚至出现毒物逐渐积累在家畜和人类体内引起中毒的现象。全世界每年约有200万人因化学农药而中毒，其中大约有4万人死亡。而且，长期使用某些化学农药也会使害虫产生抗药性，椐公开的统计资料表明具有抗药性的害虫目前已有417种。近年来，在农业生产中，应用生物农药取代化学农药已逐渐成为一种趋势。世界各国针对化学农药的种种弊端，已研制出一系列选择性强、效率高、成本低、无污染、对人畜无害的生物制剂。我国也将逐步用生物农药取代化学农药，特别是在蔬菜的生产上将尽早使用生物农药。\n[0003] 2008年我国设施蔬菜栽培面积超过了200万公顷，现已成为世界设施园艺面积最大的国家。设施蔬菜已成为我国农业生产中最有活力的新兴产业，为我国菜篮子工程的建设起到了巨大作用。但设施蔬菜具有高度集约化、复种指数高和种类单一的特点，多年连作，出现了土壤环境恶化、蔬菜病虫害严重、产量降低、蔬菜品质变劣等一系列不良现象，严重威胁设施蔬菜生产的可持续发展，连作造成的障碍已经成为蔬菜栽培生产中亟待解决的一大技术难题。\n[0004] 引起作物包括设施蔬菜连作障碍的原因是复杂的，是作物—土壤两个系统内部诸多因素综合作用结果的外在表现。不同作物产生连作障碍的原因可能是不同的。1983年日本将产生连作障碍的原因归纳为五大因子：(1)土壤养分亏缺；(2)土壤反应异常(毒素)；\n(3)土壤物理性状恶化；(4)来自植物的有害物质；(5)土壤微生物变化。同时强调：在这五大因子中，土壤微生物区系的变化是连作障碍的主要因子，其它为辅助因子。近几年来国内外对根分泌物的研究成为揭示连作障碍机制的热点。\n[0005] 据公开的研究资料表明：无论大棚或露地，土壤中微生物的种类均是繁多的。在各类群微生物中，一般都以细菌数量为最多，其次是放线菌，真菌数量居第3位；大棚中上述微生物数量及微生物活性均高于露地。真菌中以青霉菌、曲霉菌、小克银汉霉菌为主，兼性寄生菌长孺孢菌、粉孢霉等病原真菌在大棚、露地土壤中都有存在。因此，这些真菌引起的病害并不是设施温室、大棚土壤特有的障碍因子。从种植年限看，细菌数量无明显变化，而种植年限长的大棚中真菌、放线菌数量较种植年限短的大棚中少、这种状况的产生可能与大棚内较高的湿度及较高含盐量对其抑制有关。\n[0006] 公开的研究资料还表明：土传病虫害是引起连作障碍因子中最主要的因子，有关连作障碍原因的调查结果表明，引起蔬菜连作障碍的70％左右的地块是由于土壤传染性病虫害所引起的。连作提供了根系病害赖以生存的寄主和繁殖的场所，使得土壤中的病原菌数量不断增加，特别是近年来由于过多的使用化肥所带来土壤中病原拮抗菌的减少，更加重了土传病虫害的发生。\n[0007] 根际微生物种类繁多且活跃，其中能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量的微生物被称为促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，简称PGPR)。它们和植物间是互生关系，与植物根系相互作用、相互促进。微生物大量聚集在根系周围，将有机物转变为无机物，为植物提供有效的养料；同时，微生物还能分泌维生素，生长刺激素等，促进植物生长。在植物生长过程中，死亡的根系和根的脱落物(根毛、表皮细胞、根冠等)，以及根系向根外分泌的无机物和有机物是微生物重要的营养来源和能量来源；由于根系的穿插，使根际的通气条件和水分状况优于根际外，从而形成利于微生物的生态环境。\n[0008] PGPR可以抑制土壤中有害病原微生物的繁殖，并可以产生有益植物生长的代谢产物，从而可以用来防治连作障碍，促进植物的生长发育、改善蔬菜的品质，其研究和产业化前途光明、催人奋进，事实证明PGPR产业化是今后国内外农业生物技术领域发展的重要领域和方向。\n发明内容\n[0009] 本发明的目的在于针对设施农业连作障碍日益严重的技术问题，而提供一种枯草芽孢杆菌及其在防治设施蔬菜连作障碍中的应用。\n[0010] 本发明涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M-2菌株，于2007年11月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.2271。\n[0011] 所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M-2 CGMCC No.2271，是从海洋红树植物中分离得到，经培养基富集后通过抑菌圈试验筛选获得。\n[0012] 所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M-2 CGMCC No.2271的细胞形态特征：革兰氏阳性菌，杆状，大小为0.5～1.0μm×3.5～6.0μm，芽孢端生或次端生，周生鞭毛，能运动。\n[0013] 所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M-2 CGMCC No.2271的生理生化特征：生长温度27℃～45℃，pH4～9，NaCL耐受性2％～6％，触酶试验、H2S试验、淀粉水解试验、纤维素水解试验和MR试验均为阳性，苯丙氨酸脱氨试验、脲酶试验、氧化酶试验、明胶液化试验、酪氨酸降解试验和V-P试验均为阴性，产酸利用甘露醇，不能利用阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，蔗糖，肌糖和柠檬酸盐。\n[0014] 所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)M-2 CGMCC No.2271的16S rRNA的核苷酸具有如序列表所示序列。\n[0015] 所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271在防治设施蔬菜连作障碍中的应用。\n[0016] 所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株的应用方法是发酵培养→稀释→喷洒→效果测定。\n[0017] 所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株的发酵培养基组成为g/L：葡萄糖10，酵母膏10，牛肉膏4，蛋白胨4，NaCl 25，pH7.2～7.4。\n[0018] 本发明涉及的菌株，参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及16S rRNA基因序列结果，经多相分类鉴定是一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为M-2。\n[0019] 本发明提供的M-2CGMCC No.2271株菌，是一种优良的根际促生菌(PGPR)，对设施蔬菜连作障碍中的真菌病害具有很强的抑制作用，可以抑制多种致病真菌的生长，特别是防治黄瓜枯萎病、棉花枯萎病、立枯病和各种腐霉和疫霉引起的植物病害。对于促进植物的生长，具有高效、无污染等突出优点。\n附图说明\n[0020] 附图1是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株的显微照片。\n[0021] 附图2是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株对连作土壤中真菌作用结果测定图。\n[0022] 附图3是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株发酵液不同稀释倍数对幼苗生根生长促进效果比对照片。\n[0023] 附图4是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株对棉花枯萎病病菌的抑制作用比对照片，其中A为作用后，B为作用前。\n[0024] 附图5是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株接种后对绿豆生长影响的照片，其中A为作用后，B为作用前。\n[0025] 附图6是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株接种后对白菜幼苗生长影响的照片，其中A为作用后，B为作用前。\n具体实施方式\n[0026] 下面结合实施例及其附图进一步说明本发明。\n[0027] 实施例1：\n[0028] 本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2菌株的筛选和育种。\n[0029] 将海洋红树植物的根部浸渍在大量无菌水中约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分土即为根际土样。将水样收集于100mL干净、灭菌的广口塑料瓶中，震荡均匀后取15mL，无菌接种于100mLZoBell培养基中(培养基组成：\n蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸铁0.1g，陈海水1000mL，pH7.6～7.8)，36℃震荡培养6天。在LB平板上观察，培养一天的菌落直径3～5mm，呈圆形，边缘整齐，表面湿润。将培养6天富集培养液混匀后，取0.1mL涂布于营养琼脂培养基中，36℃恒温培养2天，根据菌落形态进行编号，将所有分离到的微生物以白色粘球菌为指示菌，通过抑菌圈法进行筛选，最终获得如图1所示的抑菌效果最好的M-2菌株。\n[0030] 实施例2：\n[0031] 本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2菌株的形态特征和生理生化特征的鉴定。\n[0032] 参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的试验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，pH范围。NaCL耐受性。触酶、H2S试验、淀粉水解、纤维素水解、MR试验，苯丙氨酸脱氨、脲酶试验、氧化酶、明胶液化、酪氨酸降解、V-P试验，以及利用甘露醇，阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，蔗糖，肌糖和柠檬酸盐试验。\n[0033] 结果表明，该菌为革兰氏阳性，杆状，大小为0.5μm～1.0μm×3.5μm～6.0μm，芽孢端生或次端生，周生鞭毛，能运动(见图1)。生长温度27～45℃，pH4～9，NaCL耐受性0～2％。触酶、H2S试验、淀粉水解、纤维素水解、MR试验均为阳性，苯丙氨酸脱氨、脲酶试验、氧化酶、明胶液化、酪氨酸降解、、V-P试验均为阴性，能够利用甘露醇，不能利用阿拉伯糖，半乳糖，木糖，鼠李糖，蔗糖，肌糖和柠檬酸盐。\n[0034] 实施例3：\n[0035] 本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定。\n[0036] 将该菌株接种于LB培养基，120rpm，37℃震荡培养10小时，离心收集菌体，悬浮后加入溶菌酶和SDS破壁，采用酚—氯仿法提取基因组DNA，用正相引物\n27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1541R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，对其16S rRNA基因进行PCR扩增，将扩增的产物由北京三博公司进行测序。PCR条件为：\n94℃，10min；94℃，45s；55℃45s；72℃，90s；30个循环，4℃保存。16S rRNA基因序列长度为1543bp，在GenBank中的登陆号为EU333948，与Bacillus subtilis(AB110598)相似性为99％。其结果如序列表所示。\n[0037] 实施例4：\n[0038] 本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2菌株的发酵培养。\n[0039] 将M-2菌株接种在LB培养基上，36℃下活化24小时，然后将活化的M-2菌株转接到基础培养基中进行摇瓶发酵，温度为30～36℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为72小时。其中发酵培养基组成为g/L：葡萄糖10，酵母膏10，牛肉膏4，蛋白胨4，NaCl 25，pH7.2～7.4。\n[0040] 实施例5：\n[0041] 采用稀释平板法，分别对连作土壤和接种M-2菌株后土壤的真菌数量进行测定，培养基为马丁氏培养基，每皿加1滴氯霉素抑制细菌防治。置于28℃的恒温箱中培养3天，计数。结果表明，海洋细菌M-2能够有效抑制连作土壤中致害菌生长，接种20周后的作用结果如图2所示真菌数量降为对照土壤的30％。\n[0042] 实施例6：\n[0043] 本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2菌株对各种真菌菌丝的抑制作用试验。\n[0044] 采用含毒介质法，在20mLPDA培养基中加入2mL M-2的发酵液，倒PDA平板，用打孔器取直径为5mm的病原真菌菌丝块，移入平板中心处，28℃培养24h、48h、72h和96h测量菌丝生长直径(mm)，重复3次，计算各处理浓度下的抑菌率。\n[0045] 抑菌率＝[(对照菌丝生长直径-试验处理菌丝生长直径)/对照菌丝生长直径]×100％。结果表明，其对苹果腐烂病病菌的抑制率为99.5％，对哈密瓜根腐病病菌的抑制率为99.1％，对棉花枯萎病病菌的抑制率为98.5％，对玉米小斑病病菌的抑制率为\n97.5％，水稻立枯病病菌的抑制率为98.3％，对小麦根腐病病菌的抑制率为96.5％，对烟草赤星病病菌的抑制率为97.5％。如图4所示，该菌可以有效的抑制棉花枯萎病病菌的生长。\n[0046] 实施例7：\n[0047] 本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2菌株对绿豆幼苗根生长的促进作用试验。\n[0048] 取M-2发酵液，离心，取上清夜，将其分别稀释5、10、100、1000和10000倍，设置蒸馏水做对照(Control)，将各稀释液加入到10mL的小试管中，用牛皮纸和封口膜封口，在其中央打一孔，将绿豆苗栽入，每管一棵，培养7天，设置四个重复，结果见表1和图3。\n[0049] 表1 M-2对绿豆幼苗根生长的促进作用\n[0050] \n[0051] 表1说明，M-2菌株可以有效促进幼苗生根生长，其中稀释100倍时效果最好。图\n3中CK、a、b、c、d、e分别为蒸馏水对照、将发酵液稀释5、10、100、1000和10000倍时对绿豆苗根生长的影响，从中可以看出M-2菌株对幼苗生根生长有很好的促进作用。\n[0052] 实施例8：\n[0053] 本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株接种后对绿豆生长的影响。\n[0054] 将绿豆栽入连作后的土壤中，一组接种M-2菌株，另一组不接种做为空白对照(Control)，培养8天后观察绿豆的生长情况。从图5中可以看出接种M-2菌株后可以有效的促进绿豆苗的生长。\n[0055] 实施例9：\n[0056] 本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2 CGMCC No.2271菌株接种后对绿豆生长的影响。\n[0057] 将绿豆栽入连作后的土壤中，一组接种M-2菌株，另一组不接种做为空白对照(Control)，培养8天后观察绿豆的生长情况。从图6中可以看出接种M-2菌株后可以有效的促进绿豆苗的生长。\n[0058] 实施例10：\n[0059] 本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2菌株在黄瓜试验田中的应用试验。\n[0060] 通过发酵液能够抑制黄瓜枯萎病，具体过程为：对菌株M-2进行发酵，发酵液稀释\n1000倍喷雾，黄瓜幼苗移栽成活一周后开始喷药，每次间隔20-25天，连续3-4次。其生防效果可达73％。发酵培养条件为：将M-2菌株接种在LB培养基上，36℃下活化24小时，然后将活化的M-2菌株转接到基础培养基中进行发酵培养，温度为30～36℃，摇床转速为\n200rpm，发酵时间为72小时。其中发酵培养基组成为g/L：葡萄糖10，酵母膏10，牛肉膏4，蛋白胨4，NaCl 25，pH7.2。\n[0061] 实施例11：\n[0062] 本发明提供的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-2菌株在烟草试验田中的应用。\n[0063] 通过发酵液能够抑制烟草赤星病，具体过程为：对菌株M-2进行发酵，发酵液稀释\n1000倍喷雾，苗床十字期第1次叶面喷雾施药，移栽成活后5-7天后施第2次药，以后间隔\n20天施药1次，共3次，整个生育期试药4次。其生防效果可达71％。发酵培养条件为：将M-2菌株接种在LB培养基上，36℃下活化24小时，然后将活化的M-2菌株转接到基础培养基中进行发酵培养，温度为30～36℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为72小时。其中发酵培养基组成为g/L：葡萄糖10，酵母膏10，牛肉膏4，蛋白胨4，NaCl 25，pH7.2。\n[0064] 实施例12：\n[0065] 本发明提供的Bacillus subtilis M-2菌株在烟草试验田中的应用。\n[0066] 通过发酵液能够抑制番茄根腐病，具体过程为：对M-2进行发酵，发酵液稀释1000倍喷雾，苗床十字期第1次叶面喷雾施药，移栽成活后5-7天后施第2次药，以后间隔20天施药1次，共3次，整个生育期试药4次。其生防效果可达70％。发酵培养条件为：将M-2菌株接种在LB培养基上，36℃下活化24小时，然后将活化的M-2菌株转接到基础培养基中进行发酵培养，温度为30～36℃，摇床转速为200rpm，发酵时间为72小时。其中发酵培养基组成为g/L：葡萄糖10，酵母膏10，牛肉膏4，蛋白胨4，NaCl 25，pH7.4。\n[0067] 序列表\n[0068]