一株露湿漆斑菌及其应用

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一株露湿漆斑菌及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及微生物防治技术领域，特别涉及一株露湿漆斑菌，还涉及所述露湿漆斑菌的应用。\n背景技术\n[0002] 农田杂草根系发达,吸收水分和养分的能力强,与田间农作物争夺水分、养分、光照和空间等条件，严重危害农田作物的产量安全。我国现有杂草1,400余种,其中对我国粮食、蔬菜等作物安全造成重要影响的有60多种。据统计，我国每年由杂草危害而导致的粮食损失达到2亿吨，占到我国农业总产量的11％左右。但是，另一方面，近些年来随着高效化学除草剂研发和使用，虽然在一定程度上缓解了杂草对农业生产的危害。但是化学药剂的持续广泛使用也导致了高抗性杂草的产生，例如抗二氯喹啉酸的稗草种群，抗烟嘧磺隆的播娘蒿种群，抗苯磺隆的荠菜种群等抗性杂草的迅速产生已经严重影响了我国水稻的安全生产。因此，低毒且对抗性杂草具有同样防效的生物源除草剂的研发已经越来越受到关注。\n[0003] 稗草(Echinochloa crusgalli(L.)Beauv.)是分布广泛的世界性恶性杂草之一，也是我国粮食作物田的主要杂草之一，对我国粮食安全造成重要影响。目前，对农田杂草的防除主要通过以下三种途径：第一，通过人工或机械作用进行防除，该方法费时费力，成本较高且效果不理想，当前使用范围较小；第二，化学防治，该方法简单易行，成本低，见效快，是目前解决杂草危害的最主要方法。但是，化学除草剂的长期使用不仅造成环境污染，更会引起高抗性杂草的产生，从而使得化学药剂的使用陷入使用单纯剂量逐渐增加的恶性循环。第三，生物防治，杂草生物防治菌株多采集自自然界，毒性低，具有可多次继代长效防治的特点，是减少化学药品大量使用的有效手段，但是杂草生物防治起步较晚，且见效慢，成本较高。同时目前能够用来进行杂草生物防除的菌种资源较少，且大多研究集中在实验室内，真正大规模产业化应用的较少。\n发明内容\n[0004] 本发明以苹果园感病稗草为材料，从中分离了一株对稗草具有良好防效的露湿漆斑菌菌株BC-1，并进一步对其生防效果进行了探索，发现其对玉米、小麦、水稻等作物安全，同时对稗草防治效果较好，对马唐、狗尾草等杂草也具有一定的生物防治作用。\n[0005] 本发明是通过以下步骤得到的：\n[0006] 本发明提供了一株露湿漆斑菌BC-1(Myrothecium roridum)，其保藏编号为CGMCC No.11393。\n[0007] 本发明还提供了露湿漆斑菌BC-1的分生孢子。\n[0008] 一种制备露湿漆斑菌BC-1分生孢子的方法：\n[0009] 用PDA培养基培养露湿漆斑菌BC-1，培养的温度为22℃-28℃，培养的条件为黑暗培养，培养的时间为10-14天，得到露湿漆斑菌BC-1的孢子；所述培养的温度具体为22℃，25℃或28℃，所述培养的时间具体为14天。\n[0010] 本发明的另一个目的是提供一种培养露湿漆斑菌BC-1CGMCC No.11393的方法：\n[0011] 用PDA培养基培养露湿漆斑菌BC-1CGMCC No.11393，培养的温度为22℃-28℃，培养的光照条件为黑暗培养，培养的时间为10-14天；所述培养的温度具体为22℃，25℃或28℃，所述培养的时间具体为10、11、12、13、14天。\n[0012] 一种露湿漆斑菌BC-1和/或其培养液和/或露湿漆斑菌BC-1的分生孢子在生物防除杂草中的应用。\n[0013] 优选所述生物除草剂的作用对象为稗草，其次为马唐、狗尾草等杂草。\n[0014] 上述生物除草剂具体由露湿漆斑菌BC-1的分生孢子、表面活性剂和无菌水组成；\n优选所述生物除草剂中含有孢子1×107-1×108个/mL和表面活性剂。\n[0015] 优选所述表面活性剂在所述生物制剂中的质量浓度为0.05％-0.1％。\n[0016] 优选所述表面活性剂为吐温20和吐温80。\n[0017] 本发明的生物除草剂对稗草具有强烈、快速的致病力，将本发明菌株的分生孢子喷洒到两叶一心期的稗草叶片上，2天后即出现病状斑点，7天后稗草叶片出现枯死症状，两周后稗草的死亡率达到60％，感病率达到100％，3周后对稗草的鲜重抑制率达到91％。\n[0018] 本发明的生物型除草剂BC-1对玉米、小麦、水稻等作物安全。\n[0019] 本发明的有益效果：\n[0020] 1)本发明的露湿漆斑菌BC-1由发明人分离自山东省齐河县焦庙镇苹果园自然发病的稗草叶片，未经任何基因修饰，因此将它们释放到自然界中不会造成任何生态的、环境的隐患，是绝对安全的生物防治介体；\n[0021] 2)本发明中露湿漆斑菌BC-1对玉米、小麦和水稻等作物安全，同时对稗草防治效果较好，对马唐、狗尾草等杂草也具有一定的生物防治作用，显示出该菌有较大的潜力开发成商品化生物除草剂，具有极为显著的经济和社会效益。\n[0022] 菌种保藏信息\n[0023] 保藏时间：2015年10月12日，\n[0024] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，\n[0025] 保藏编号：CGMCC No.11393，\n[0026] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101\n[0027] 分类命名：露湿漆斑菌Myrothecium roridum。\n具体实施方式\n[0028] 以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明。\n[0029] 实施例1:露湿漆斑菌BC-1的分离与鉴定\n[0030] 1.1菌株的分离\n[0031] 野外采集自然感病的稗草叶片，用无菌水冲洗2次，剪下病叶的病、健结合部位，用\n5％ (v/v)次氯酸钠溶液进行表面消毒2分钟，之后用70％(v/v)酒精表面消毒1分钟，用无菌水漂洗后将这些组织转移到空的灭菌培养皿内，超净台内吹干。将吹干后的叶片组织铺于PDA 培养基表面，置于28℃培养箱培养，待长出菌落后转移至一新的PDA培养皿内，产孢并经过单孢子分离、纯化得到纯培养菌菌株BC-1。将BC-1菌株以滤纸片法保存于-20℃冰箱内。\n[0032] 1.2菌株的鉴定\n[0033] 1.2.1形态鉴定\n[0034] 方法：将菌株BC-1在PDA平板上培养10天，期间观察并记录其菌落形态。同时用无菌水将培养基表面的分生孢子洗下，制成分生孢子悬浮液，调节浓度至1×104个孢子/ml左右。显微镜下观察菌株BC-1的分生孢子形态；对照真菌鉴定手册，对菌株BC-1进行形态学鉴定。\n[0035] 1.2.2分子鉴定\n[0036] CTAB法提取菌株BC-1的基因组DNA，用引物ITS4(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) 和ITS5(5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’)进行PCR扩增，将PCR产物回收并送上海生物工程有限公司进行PCR产物测序\n[0037] 将测得序列提交到NCBI(National Center forBiotechnology information，美国生物信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的GeneBank进行BLAST分析。\n[0038] 1.3孢子液的制备\n[0039] 将露湿漆斑菌BC-1接种于PDA平板培养基，在28℃，黑暗条件下培养14天，培养基表面即存在菌株产生的大量分生孢子。加入占总质量为0.05％的吐温80，用棉棒轻轻刷下培养基表面生长的分生孢子，收集孢子液，单层擦镜纸过滤除去多余菌丝，显微镜下用血球计数板计数并调整分生孢子液浓度至1×108个/mL。制取的孢子悬浮液直接用于稗草等杂草的生物防治。\n[0040] 1.4BC-1菌株对稗草的致病性测定\n[0041] 参照1.3的方法制备孢子悬浮液，喷施2叶期稗草、马唐和狗尾草等杂草植株上，2天后，观察菌株的致病特性，喷洒BC-1菌株孢子液的稗草叶片在2天后出现病斑，喷施7天后稗草叶片枯黄死亡。喷施21天后收集地上部分，称量鲜重，并统计致死率和鲜重抑制率。\n[0042] 1.5结果\n[0043] BC-1菌株在PDA培养基上培养10天后，菌落直径约7厘米，白色，菌落产生漆黑色粘孢子团。显微观察显示，BC-1菌株分生孢子杆状，两端顿圆，无色。结合ITS测序分析结果，表明BC-1菌株为露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)。\n[0044] 该菌株已于2015年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编 \n100101),保藏号CGMCC No.11393，分类命名为露湿漆斑菌Myrothecium roridum，菌株名称为BC-1。\n[0045] 实施例2：菌株BC-1寄主范围的测定\n[0046] 参照1.3的方法制备孢子悬浮液，并喷施2-3叶期玉米、小麦和水稻植株上，7天后，观察菌株对供试玉米、小麦和水稻的安全性。21天后收集作物地上部分，称量鲜重，并统计鲜重抑制率。\n[0047] 经寄主范围测定明确，菌株BC-1对玉米、小麦和水稻等作物安全；对稗草具有良好的生防效果，两周后的鲜重抑制率在91％左右。对马唐和狗尾草等杂草具有一定生防效果。\n[0048] 本实验中的各植物均是非常常见和常用的植物。\n[0049] 具体方法为：温室中种植各植物，在各植株生长至2-3叶期，对每种植物的植株进行孢子液喷雾；接种后21天，进行结果统计。\n[0050] 结果统计包括以下方面：在喷雾接菌后的第2、第7和第21天，目测各植株在接种BC-1 之后的症状并记录；其中接菌21天后，剪取各处理植株的地上部分,立即称取植株鲜重,计算鲜重抑制率。\n[0051] 鲜重抑制率的计算公式:鲜重抑制率＝(对照平均鲜重-处理平均鲜重)/对照平均鲜重×100％。\n[0052] 结果具体如下:\n[0053] 表1 BC-1菌株孢子液对不同杂草生物防效和作物安全性比较\n[0054]\n[0055]\n[0056] 注:表中数据均为平均值±标准误\n[0057] 杂草生防实验结果表明，BC-1菌株孢子液对稗草生防效果最佳，接菌21天后稗草发病率为100％，鲜重抑制率达到93.7％；对马唐、狗尾草、麦蒿和反枝苋的生防效果较差，鲜重抑制率仅为33.7％、28.3％、-3.2、16.8。\n[0058] 选用小麦品种为：济麦22；玉米品种为：鲁单981；水稻品种为：郑旱6号，以上作物种子均是购自种子公司，进行安全性试验。\n[0059]\n[0060] 注:表中数据均为平均值±标准误\n[0061] 作物安全性试验结果表明，在喷雾7天后，玉米、小麦和水稻叶片没有明显病斑；接菌 21天后，玉米、小麦和水稻等作物鲜重没有明显的抑制，表现为安全。\n[0062] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。