一种增强免疫力的保健食品及其制备工艺

1. 一种增强免疫力的保健食品，其特征在于配方含有下列重量份的原料：
蜂胶50-60份，灵芝提取物30-40份，虫草菌丝体5-15份；
其中灵芝提取物是通过下列方法制备得到的：灵芝经切片后加入8-12倍量水，提 取2-3次，每次4-6小时，合并提取液，浓缩后喷雾干燥；灵芝提取物的质量要求为： 多糖≥8.0％，水分≤8.0％，灰分≤10.0％。
2. 根据权利要求1所述的保健食品，其特征在于其制剂是药学上允许的任意一种 剂型。
3. 根据权利要求2所述的保健食品，其特征在于其剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、 口服液、糖浆剂或丸剂。
4. 如权利要求1所述的保健食品的制备工艺，其特征在于包含下列步骤：
按配方取虫草菌丝体粉碎，过80目筛，与灵芝提取物混合均匀，110-130℃干热灭 菌1-2小时，再加入经粉碎过80目筛的蜂胶，混合均匀，常规工艺制成所需制剂。

技术领域\n本发明属于保健食品领域，涉及一种增强免疫力的保健食品，本发明还涉及该保健 食品的制备工艺。\n背景技术\n蜂胶是蜜蜂从植物的树芽、树皮等部位采集的树脂，再混以蜜蜂舌腺、蜡腺等腺体 的分泌物，经蜜蜂加工转化而成的一种胶状物质。蜜蜂将这些物质涂布在整个蜂巢的表 面，一方面起防腐、抗氧化作用，另一方面来粘合蜂巢，堵塞缝隙等，使众多病菌无法 在蜂巢内滋生。蜂胶能起到全面调理，平衡机体免疫功能的作用，据《中华本草》记载： 蜂胶对糖尿病、高血脂、高血压、肿瘤、息肉、多种炎症、病菌引起的疾病等有很好的 辅助治疗作用。\n灵芝[Ganoderma Lucidum(Leyss ex Fr)kast]又称为瑞草、灵芝草，李时珍认为灵芝“主 治耳聋，利关节，保神，益精气，坚筋骨，好颜色，久服轻身不老，延年，疗虚劳，治 痔”。\n近40年来，对灵芝进行了大量科研及临床应用工作，已确认的灵芝成分有多糖， 主要有免疫调节的功能，并且有解毒、保肝等作用。\n灵芝对人体有扶正固本的效果，有多方面的药理活性，从历代名医用药和近代医疗 临床都可佐证，凡是与血液循环不畅、机体虚弱、抗病力下降有关的疾病，灵芝对其皆 有一定的治疗效果。本配方选用灵芝提取物为原料，其富含多糖等功效成分，具有增强 免疫力的功能。\n虫草菌丝体补肺益肾，填精益气、镇咳平喘、止血、化痰。对体弱多病、年老体弱、 过度疲劳有强力补益作用，能提高人体的免疫作用。\n蜂胶加灵芝提取物及虫草菌丝体，具有增强免疫力的功效，而且，由于蜂胶的抵菌 作用，对产品的保质也起到一定的作用。\n目前尚没有采用此三种原料组方制备的提高机体免疫力的保健食品。\n发明内容\n本发明的目的是提供一种增强免疫力的保健食品。\n本发明还有一个目的是提供上述保健食品的制备工艺。\n本发明的目的是通过下列技术措施实现的：\n一种增强免疫力的保健食品，其配方含有下列重量份的原料：\n蜂胶50-60份，灵芝提取物30-40份，虫草菌丝体5-15份。\n所述的保健食品，其中灵芝提取物是通过下列方法制备得到的：灵芝经切片后加入 8-12倍量水，提取2-3次，每次4-6小时，合并提取液，浓缩后喷雾干燥；灵芝提取物 的质量要求为：多糖≥8.0％，水分≤8.0％，灰分≤10.0％。灵芝提取物的外观为深棕色 粉末，干燥，无杂质，具有灵芝固有香味。\n本发明所述的具有增强免疫力作用的保健食品可以添加药学上允许的任意一种辅 料，其制剂可以是药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、 口服液、糖浆剂、丸剂等，本发明保健食品中还可以添加其他不减弱本发明保健食品功 效的物质制成复合功能的保健食品。\n所述的保健食品的制备工艺，包含下列步骤：\n按配方取虫草菌丝体粉碎，过80目筛，与灵芝提取物混合均匀，110-130℃干热灭 菌1-2小时，再加入经粉碎过80目筛的蜂胶，混合均匀，常规工艺制成所需制剂。\n本发明的有益效果：\n本发明动物实验：\n一、材料和方法\n1、样品：虫草蜂灵胶囊，0.25g/粒，人体推荐摄入量为内容物净重1000mg/人/日， 由南京中科生化技术有限公司提供，批号20040518。\n2、实验动物：\nI组：18.9-23.7g ICR健康雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，进行二硝基 氟苯诱导小鼠DTH试验；\nII组：18.5-23.4g健康雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，进行小鼠腹腔 巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验；\nIII组：18.3-23.5g健康雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，进行小鼠碳廓 清试验；\nIV组：20.0-23.9g健康雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，进行小鼠抗体 生成细胞及半数溶血值(HC50)试验；\nV组：20.3-23.9g BALB/C健康雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只，进行 小鼠ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化、NK细胞活性试验。\n3、剂量：\n根据每人(按60kg体重计)每日推荐摄入量为1000mg，相当于16.7mg/d/kg·bw， 分别按人体推荐摄入量5倍、10倍、30倍设计低(84mg/kg·bw)、中(167mg/kg·bw)、 高(500mg/kg·bw)三个剂量组，另设对照组(0mg/kg·bw)以无菌水代替受试物。 经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，连续灌胃30天后测各项增强免疫力功能指 标。小鼠灌胃量为10ml/kg·bw。\n4、主要试剂：二硝基氟苯(DNFB)、绵羊红细胞(SRBC)、豚鼠血清、印度墨汁、 RPMI1640、ConA、MTT、异丙醇、SA缓冲液、都氏试剂、YAC-1细胞、LDH基质液。\n5、主要仪器：打孔器、T1000型电子动物秤、JA2003型电子天平、722型分光光 度计、超净工作台、酶标仪、二氧化碳培养箱。\n6、试验方法：按《保健食品检验与评价技术规范-2003版》之增强免疫力功能检验 方法进行。\n6.1 ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)：\n各组动物连续灌胃30天，颈椎脱臼处死动物，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s 液的小平皿中，研磨脾脏，制成单个细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank’s液洗3 次，每次离心10min(1000r/min)，然后将细胞悬浮于1ml RPMI1640完全培养液中，台 酚蓝染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为3×106个/ml。将细胞悬液分 两孔加入24培养板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液，另一孔作对照，置5％CO2 37℃ 孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血 清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/ml)50μl/孔，继续培养4h。培养结束后， 每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。将溶解液移入96孔培养 板中，波长570nm，酶标仪测定光密度计值。\n6.2二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发性变态反应(DTH)(耳肿胀法)：\n各剂量组连续灌胃30天，每鼠用剪刀将腹部毛剪去，范围约3cm×3cm，用1％DNFB 溶液50μl均匀涂抹致敏。5日后用1％DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳(两面) 进行攻击，同时用不含DNFB的溶液10μl均匀涂抹于小鼠左耳(两面)作对照。攻击 后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8mm耳片，称重。同时 取小鼠脾脏、胸腺并称重，计算脏/体比值。\n6.3血清溶血素测定：\n各剂量组连续灌胃30天，制备2％(v/v)的绵羊红细胞(SRBC)悬液，每只鼠腹 腔注射0.2ml进行免疫，4天后摘除眼球取血于离心管内，放置1h，2000r/min离心10min， 分离并收集血清。血清200倍稀释后，按检验方法测定样品管及SRBC半数溶血时的光 密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示。\n6.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)：\n各组动物连续灌胃30天，每只鼠腹腔注射2％(v/v)的绵羊红细胞(SRBC)悬液 0.2ml进行免疫，4天后小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有适量无菌Hank’s液的 小平皿中，研磨脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000r/min)10min， 用Hank’s液洗2次，最后将细胞悬浮于5ml RPMI1640培养液中，计数细胞数，调整细 胞浓度为5×106个/ml。将表层培养基加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2-7.4、 2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50μl 10％(v/v，用 SA液配制)SRBC，20μl脾细胞悬液(5×106个/ml)，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖 薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入CO2培养箱中孵育1.5h， 然后将制备好的补体1∶10稀释后加入到玻片架凹槽内，继续孵育1.5h后，计数溶血空 斑数。\n6.5小鼠碳廓清试验：\n各剂量组连续灌胃30天，每鼠尾静脉注入3倍稀释的印度墨汁(0.1ml/10g·bw)， 待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2min及10min分别从眼内眦静脉丛取血20μl，并 将其加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中，用722分光光度计在600nm波长处测光密度值。\n6.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)：\n各组动物连续灌胃30天，制备20％(v/v)的鸡红细胞悬液，每只鼠腹腔注射1ml， 间隔30min，颈椎脱臼处死小鼠，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔 注入生理盐水2ml，转动鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上， 放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃温箱孵育30min，然后于生理盐水中漂洗，晾干， 以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗 晾干，光镜下观察。\n6.7 NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶测定法)：\n各组动物连续灌胃30天，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s 液的小平皿中，研磨脾脏，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次， 每次离心(1000r/min)10min，弃上清交将细胞浆弹起，加入0.5ml灭菌水洗20秒， 裂解红细胞后再加入0.5ml 2倍Hank’s液及8ml Hank’s液，离心(1000r/min)10min， 用1ml含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰乙酸稀释后计数，台酚 蓝染色计数活细胞数(应在95％以上)，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107 个/ml。\n试验前24h将靶细胞(YAC-1细胞)传代培养，应用前以Hank’s液洗3次，用 RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml。取YAC-1细胞和脾细胞各100μl (效靶比50∶1)加入U型96孔培养板中，YAC-1细胞自然释放孔加YAC-1细胞和培 养液各100μl，YAC-1细胞最大释放孔加YAC-1细胞和1％NP40各100μl，上述各项 均设三个平行孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min 离心5min，每孔吸取上清液100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl， 反应5min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值。\n7、饲养条件：小鼠在温度为18-22℃、相对湿度为40-70％的屏障系统中饲养。\n8、数据分析：用SPSS10.0软件对各实验原始数据进行方差齐性检验，满足方差齐 要求的数据资料用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较 方法进行统计处理；对非正态分布或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，待满足 正态方差齐要求后，用转换所得的数据进行统计处理。\n二、结果：\n1、虫草蜂灵胶囊对小鼠体重的影响\n由表1可见，小鼠的初始体重在低、中、高三个剂量组与对照组相比较，差异均无 显著性。小鼠的初始体重在各组间较为均衡。经口给予小鼠不同剂量的虫草蜂灵胶囊30 天，各剂量组体重进行方差齐性检验，满足方差齐性的要求，用单因素方差分析方法和 多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行了统计处理。由表2结果可见低、 中、高三个剂量组与对照组相比较，差异均无显著性。即虫草蜂灵胶囊对小鼠体重增长 无影响。\n表1各组小鼠的初始体重(n＝10，x±SD)\n  免疫I组   免疫II组   免疫III组   免疫IV组   免疫V组   对照组   20.9±1.6   20.9±1.6   21.0±1.7   22.1±1.1   22.1±1.0   低剂量组   20.9±1.6   20.9±1.6   21.0±1.6   22.1±1.1   22.1±1.0   中剂量组   20.9±1.6   20.9±1.6   20.9±1.6   22.1±1.1   22.1±1.0   高剂量组   20.9±1.7   20.9±1.6   20.9±1.6   22.1±1.2   22.1±1.1\n注：各组P值均为1.000。\n表2虫草蜂灵胶囊对小鼠体重的影响(n＝10，x±SD)\n  免疫I组   免疫II组   免疫III组   免疫IV组   免疫V组   对照组   28.8±4.7   28.5±3.7   30.1±5.5   29.4±2.5   29.5±2.0   低剂量组   29.0±3.7   30.1±3.8   29.9±4.7   30.6±1.7   30.1±1.1   中剂量组   28.2±4.2   29.3±4.9   31.5±4.1   29.7±1.7   29.2±2.9   高剂量组   26.3±4.2   31.8±4.4   29.8±5.8   29.6±2.7   30.2±1.8\n注：各组P＞0.05。\n2、虫草蜂灵胶囊对胸腺、脾脏器官的影响\n经口给予小鼠不同剂量的虫草蜂灵胶囊30天，所测定的胸/体比、脾/体比值进行正 态分布、方差齐性检验，满足正态分布、方差齐性的要求，用单因素方差分析方法和多 个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行了统计处理。由表3结果可见低、中、 高三个剂量组与对照组相比较，差异均无显著性。\n表3虫草蜂灵胶囊对胸腺、脾脏器官的影响(n＝10，x±SD)\n  组别   胸腺/体重(mg/g)   P   脾脏/体重(mg/g)   P   对照组   1.41±0.69   5.43±1.49   低剂量组   1.00±0.23   0.099   6.06±1.38   0.674   中剂量组   1.11±0.37   0.300   6.45±1.68   0.316   高剂量组   1.03±0.28   0.143   6.00±1.46   0.736\n3、虫草蜂灵胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响\n经口给予小鼠不同剂量的虫草蜂灵胶囊30天，所测定值进行方差齐性检验，满足 方差齐性要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方 法进行了统计处理。由表4结果可见低、中、高三个剂量组小鼠加ConA孔与不加ConA 孔吸光度的差值显著高于对照组。\n表4虫草蜂灵胶囊对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的影响(n＝10，x±SD)\n  组别   加ConA孔与不加ConA孔吸光度的差值   P   对照组   0.029±0.016   低剂量组   0.062±0.035   0.015   中剂量组   0.072±0.025   0.001   高剂量组   0.068±0018   0.004\n4、虫草蜂灵胶囊对DNFB诱导小鼠DTH的影响\n经口给予小鼠不同剂量的虫草蜂灵胶囊30天，所测定值进行方差齐性检验，满足 方差齐性要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方 法进行了统计处理。由表5结果可见高剂量组小鼠耳壳增重显著高于对照组。\n表5虫草蜂灵胶囊对DNFB诱导小鼠DTH的影响(n＝10，x±SD)\n  组别   耳壳增重   P   对照组   5.0±3.2   低剂量组   5.8±2.2   0.871   中剂量组   7.6±2.9   0.129   高剂量组   9.6±3.2   0.003\n5、虫草蜂灵胶囊对小鼠血清溶血素形成的影响\n经口给予小鼠不同剂量的虫草蜂灵胶囊30天，所测定值进行方差齐性检验，满足 方差齐性要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方 法进行了统计处理。由表6结果可见高剂量组小鼠血清溶血素含量显著高于对照组。\n表6虫草蜂灵胶囊对小鼠血清溶血素形成的影响(n＝10，x±SD)\n  组别  HC50   P   对照组  56±43   低剂量组  107±54   0.082   中剂量组  108±57   0.076   高剂量组  123±50   0.017\n6、虫草蜂灵胶囊对抗体生成细胞(溶血空斑数)的影响\n经口给予小鼠不同剂量的虫草蜂灵胶囊30天，所测定值进行正态分布、方差齐性 检验，满足正态分布要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的 两两比较方法进行了统计处理。由表7结果可见中、高二个剂量组小鼠溶血空斑数显著 高于对照组。\n表7虫草蜂灵胶囊对小鼠抗体生成细胞(溶血空斑数)的影响(n＝10，x±SD)\n  组别   溶血空斑数(个/106脾细胞)   P   对照组   119±15   低剂量组   163±53   0.217\n  中剂量组  204±61   0.006   高剂量组  208±80   0.004\n7、虫草蜂灵胶囊对小鼠碳廓清作用的影响\n经口给予小鼠不同剂量的虫草蜂灵胶囊30天，所测定值进行方差齐性检验，满足 方差齐性要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方 法进行了统计处理。由表8结果可见低、中、高三个剂量组与对照组相比较，差异均无 显著性。\n表8虫草蜂灵胶囊对小鼠碳廓清作用的影响(n＝10，x±SD)\n  组别   吞噬指数a   P   对照组   4.48±1.66   低剂量组   4.80±1.22   0.893   中剂量组   4.46±1.26   1.000   高剂量组   4.42±0.64   0.999\n8、虫草蜂灵胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数的影响\n经口给予小鼠不同剂量的虫草蜂灵胶囊30天，所测定吞噬率、吞噬指数进行方差 齐性检验，满足方差齐性要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均 数的两两比较方法进行了统计处理。由表9结果可见低、中、高三个剂量组与对照组相 比较，差异均无显著性。\n表9虫草蜂灵胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数的影响 (n＝10，x±SD)\n  组别   吞噬率(％)   P   吞噬指数   P   对照组   20.3±4.7   0.24±0.07   低剂量组   23.3±9.2   0.617   0.30±0.11   0.322   中剂量组   22.9±5.7   0.710   0.28±0.08   0.587   高剂量组   24.1±5.9   0.438   0.31±0.06   0.174\n9、虫草蜂灵胶囊对小鼠NK细胞活性的影响\n经口给予小鼠不同剂量的虫草蜂灵胶囊30天，所测定值进行方差齐性检验，满足 方差齐性要求，用单因素方差分析方法和多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方 法进行了统计处理。由表10结果可见高剂量组小鼠NK细胞活性显著高于对照组。\n表10虫草蜂灵胶囊对小鼠NK细胞活性的影响(n＝10，x±SD)\n  组别   NK细胞活性(％)   P   对照组   31.1±8.2   低剂量组   35.1±6.8   0.496\n中剂量组 26.1±6.9  0.296 高剂量组 42.1±7.4  0.006\n具体实施方式\n以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。\n实施例中采用的原料来源及质量标准说明：\n灵芝提取物是通过下列方法制备得到的：灵芝经切片后加入8-12倍量水，提取2-3 次，每次4-6小时，合并提取液，浓缩后喷雾干燥；灵芝提取物的质量要求为：多糖≥ 8.0％，水分≤8.0％，灰分≤10.0％。外观为深棕色粉末，干燥，无杂质，具有灵芝固有 香味。\n实施例1\n取蜂胶55g，灵芝提取物35g，虫草菌丝体10g，虫草菌丝体粉碎，过80目筛，与 灵芝提取物混合均匀，110-130℃干热灭菌1-2小时，再加入经粉碎过80目筛的蜂胶， 加入胶囊剂常用辅料，混合均匀，按胶囊剂常规工艺制成1000粒胶囊。\n实施例2\n蜂胶50g，灵芝提取物40g，虫草菌丝体10g，虫草菌丝体粉碎，过80目筛，与灵 芝提取物混合均匀，110-130℃干热灭菌1-2小时，再加入经粉碎过80目筛的蜂胶，加 入片剂常用辅料，混合均匀，按片剂常规工艺制成1000片。\n实施例3\n蜂胶60g，灵芝提取物30g，虫草菌丝体10g，虫草菌丝体粉碎，过80目筛，与灵 芝提取物混合均匀，110-130℃干热灭菌1-2小时，再加入经粉碎过80目筛的蜂胶，加 入颗粒剂常用辅料，混合均匀，按颗粒剂常规工艺制成1000包颗粒。\n实施例4\n蜂胶55g，灵芝提取物30g，虫草菌丝体15g，虫草菌丝体粉碎，过80目筛，与灵 芝提取物混合均匀，110-130℃干热灭菌1-2小时，再加入经粉碎过80目筛的蜂胶，加 入胶囊剂常用辅料，混合均匀，按胶囊剂常规工艺制成1000粒胶囊。\n参考文献：\n1、林志彬，灵芝的现代研究，北京医科大学出版社，2001年3月。\n2、国家中医药管理局，《中华本草》，上海科学技术出版社。