圆斑星鲽精子冷冻保存方法

1、圆斑星鲽精子冷冻保存方法，其特征在于：选择能挤出乳白色精液的雄 性圆斑星鲽，获取精液后，添加抗冻液在0～4℃预冷9～11分钟，分段降温至-180℃ 投入液氮中保存；所述抗冻液是以平衡盐溶液Hank’s为基液，其中含有体积含量 10％的二甲基亚砜和体积含量5％的甘油二种抗冻剂；所述分段降温是指0～-80℃， 降温速度为20℃/min；-80℃时平衡2分钟；-80～-180℃，降温速度为20℃/min。

技术领域\n本发明涉及鱼类增加精量及精子的冷冻保存，具体地说是海洋鱼类圆斑星鲽 增加精子量及精子冷冻保存方法，对雄性圆斑星鲽通过注射激素，把精子降温。 液氮保存及解冻，获取具有受精能力精子的过程。\n背景技术\n圆斑星鲽分布于我国北部的黄渤海、日本中部以南和韩国西南部的沿海海域。 圆斑星鲽体形较大，生长速度较快，骨刺少、内脏团小，可食部分多，是优良养 殖品种。由于圆斑星鲽自然资源匮乏，捕获量没形成规模，而且是本土自然种类， 资源可持续利用发展，其养殖前景广阔。目前我国已有部分单位进行圆斑星鲽的 养殖及人工繁殖尝试。\n圆斑星鲽在室内培育，雌、雄亲鱼性成熟不同步；圆斑星鲽不易在室内自然 产卵，而且在人工饲育下排卵周期不稳定，卵巢腔内常常过熟，受精率显著下降； 雄性圆斑星鲽精量少，一般自然成熟的精量0.7ml左右，很难采集，达不到人工 繁殖生产时所需的精液量。由于上述几个原因，严重制约着圆斑星鲽人工繁殖技 术的提高。采用激素处理方法，使雄性圆斑星鲽增加精液量；冷冻保存圆斑星鲽 精子，保证其质量，具备受精能力，才能确保圆斑星鲽人工繁殖顺利进行。\n发明内容\n本发明的目的在于提供一种增加海洋鱼类圆斑星鲽人工繁殖精液量及精子冷 冻保存方法。\n为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：\n选择雄性成熟圆斑星鲽，对其进行激素诱导；采精后，添加抗冻液在0～4℃ 预冷9-11分钟，分段降温至-180℃后投入液氮中保存。\n所述雄性成熟圆斑星鲽是能挤出乳白色精液的雄鱼，对其进行激素诱导增加 精量。诱导激素为绒毛膜促性腺激素(HCG)，将HCG以150IU/kg注射到腹腔， 每间隔2天注射一次，连续注射三次，7天后采精。抗冻液是以平衡盐溶液Hank’s 为基液，其中含有体积含量10％(V/V)的二甲基亚砜(DMSO)和体积含量5％ (V/V)的甘油(Gly)二种抗冻剂；分段降温是指0～-80℃降温速度为20℃/分钟， -80℃时平衡2分钟，-80～-180℃降温速度为20℃/分钟。精液与抗冻液的体积比 为1∶2。\n所述保存后的圆斑星鲽精液解冻时，放入43℃水温解冻至微融化后室温解 冻。\n本发明具有如下优点：\n1、诱导性成熟雄性圆斑星鲽增加精量，时间短，诱导效果好，便于生产实 践中操作。\n2、以150IU/kg的HCG进行三次诱导，对圆斑星鲽损伤程度小，促进其性腺 正常发育。\n3、DMSO和Gly二种抗冻剂混合使用，减轻毒性作用。\n4、以20℃/分钟速度快速降温，使冷冻精子安全快速度过“危险温度区”， 降低胞内冰晶的冷冻损伤。\n5、冷冻精子从液氮中取出后，直接放入43℃中水温解冻，快速度过重结晶 区，减少重结晶对精子的损伤。\n本发明的圆斑星鲽增精及冷冻保存对于圆斑星鲽这种海水名贵鱼类的育种、 种质保存、遗传多样性及可持续养殖等方面有着重要意义。\n具体实施方式\n实施例：\n(1)挑选体重1kg能挤出乳白色精液的雄鱼进行激素诱导，水温是12℃， 光照每天14小时，腹腔注射HCG150IU/kg，每隔二天注射一次，连续三次，7 天后获取6ml精液。\n(2)按精液与抗冻液体积比1∶2，将精液放入体积含量为DMSO10％+Gly5％ 以平衡盐溶液Hank’s为基液的抗冻液中，在0～4℃冰箱中平衡10分钟，从冰箱 中取3个2ml的冻存管，各吸取2ml抗冻液，快速放入程序降温仪，开始降温。\n(3)降温程序为：0～-80℃，降温速度为20℃/min；-80℃平衡2分钟；-80～-180 ℃，降温速度为20℃/min；降至-180℃时，迅速将冻存管投入液氮罐中保存。\n(4)保存4个月后取出冻存管，迅速放入43℃水温锅中解冻，微融化后室 温解冻。\n(5)解冻后，用海水激活进行镜检，精子复活率大于90％。\n(6)用精子动(静)态图像分析系统(CASA)分析冻精活力情况，检测分 析结果：冻精活动率为92.38％，其中快速向前运动的占50.00％，冻精平均曲线运 动速度(VCL)为63.68(微米/秒)，平均直线运动速度(VSL)为42.45(微米/ 秒)，平均路径速度(VAP)为46.69(微米/秒)。