β人绒毛膜促性腺激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

1.β人绒毛膜促性腺激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1)β-hCG校准品；将β-hCG纯品用含50％牛血清的校准品稀释液配制成校准品浓储液，以企业校准品进行定标，用校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0，5，25，100，250，
1000mIU/mL；
2)偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径1～2um；制备过程为取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液3.5μL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定容至1L即可；
3)生物素标记的β-hCG抗体；制备方法是取0.5mgβ-hCG抗体，用硼酸盐缓冲液在
2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25μg生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10％，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250μL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；
4)β-hCG抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；制备方法是采用高碘酸钠氧化法将β-hCG抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4000，并加入5-20％酶稳定剂，储存于2～8℃；
5)β-hCG质控品，所述的β-hCG质控品包括低值质控品和高值质控品；低值质控品的浓度为8mIU/mL和高值质控品的浓度为600mIU/mL；将β-hCG抗原用含有50％牛血清的校准品稀释液稀释配成浓储液，以企业校准品对其定值后，用校准品稀释液分别稀释至8mIU/mL和600mIU/mL；
6)化学发光液A液和B液；所述的A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；
7)20倍浓缩洗液；20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L Tween-20和1‰Proclin300；
8)反应管；所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、透明聚乙烯、透明聚丙烯或透明玻璃。
2.一种制备所述权利要求1的试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)β-hCG校准品的配制：
将β-hCG纯品用含50％牛血清的校准品稀释液配制成校准品浓储液，以企业校准品进行定标，用校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0，5，25，100，250，1000mIU/mL；
(2)β-hCG质控品的配制：
将β-hCG抗原用含有50％牛血清的校准品稀释液稀释配成浓储液，以企业校准品对其定值后，用校准品稀释液分别稀释至8mIU/mL和600mIU/mL；
(3)磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：
取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液3.5μL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用
0.01mol/LPBS定容至1L即可；
(4)生物素标记的β-hCG抗体的制备
取0.5mgβ-hCG抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25μg生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10％，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250μL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01mol/L PBS溶液在
2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；
(5)β-hCG抗体酶结合物的制备
采用高碘酸钠氧化法将β-hCG抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4000，并加入5-20％酶稳定剂，储存于2～8℃；
(6)20倍浓缩洗液的配制
20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L Tween-20和1‰Proclin300；
(7)化学发光液A液和B液的配制
A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；
(8)组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；
(9)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

β人绒毛膜促性腺激素磁微粒化学发光免疫定量检测试\n剂盒及其制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种β人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。\n背景技术\n[0002] 人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin，HCG）是一种胎盘成滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，特异在孕期分泌，成滋养层细胞病变和某些不完全分化的肿瘤也会分泌。其生理作用在于延缓卵巢黄体的退化，从而维持孕酮的生理水平，在妊娠初期起着重要的作用。HCG还影响孕期免疫耐受，保证胎儿不受母体免疫系统攻击。此外，HCG还被报道与胚胎着床和早孕反应有关。\n[0003] HCG是目前广泛应用的早期妊娠检测指标，用于指示是否存在着床的胚胎。在怀孕的第一周，HCG水平就开始急剧升高，并持续升高约8周的时间，随后开始下降，至20周左右达到稳定水平，维持至分娩后消失。\n[0004] 人绒毛膜促性腺激素由α，β两个不同亚基组成，α亚基与垂体分泌的FSH（卵泡刺激素）、LH（黄体生成素）和TSH（促甲状腺激素）等基本相似，相互间能发生交叉反应，而β亚基的结构各不相似。β-HCG于β-LH结构相近，但最后24个氨基酸延长部分在β-LH中不存在。所以特异性更强的β亚基成为检测中的首选靶点，总β-hCG可以在很大程度上替代总HCG的指示作用。\n[0005] 目前常用的检测β-hCG的方法有放射免疫分析技术（RIA）和酶联免疫分析法（ELISA），但是RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；随着标记免疫技术的迅速发展，各种新的检测方法层出不穷，其中化学发光免疫分析（CLIA）是将化学发光和酶免疫分析结合在此技术上发展起来的，是当今最为敏感的微量免疫测定法，但是检测的的灵敏度和准确度还是不高。\n[0006] 磁微粒具有超顺磁性，在磁场下具磁场响应性，将磁微粒应用于免疫检测的固相，将大大提高反应的表面积，更容易进行固相、液相分离，可提高检测的灵敏度。采用微小的磁微粒作为固相可增加包被表面积，从而增加抗原或抗体的吸附量，既加快了反应速度，也使清洗和分离更简便。\n[0007] 磁分离-酶标记-化学发光技术是酶标记免疫技术的新发展，该技术以微米级磁微粒为载体，利用表面有机物提供的羧基活性基团与蛋白质氨基共价结合，采用抗体进行“搭桥”成免疫磁微粒，可进行抗原、抗体反应。该技术的新颖之处有：(1)利用顺磁铁微粒为固相载体，外包被单克隆抗体，增加抗原、抗体的接触面积及底物发光面积，提高反应的灵敏度，并采用旋转磁场使磁微粒起搅拌作用及分离结合抗原-抗体与游离抗体的作用。(2)在液相反应中，使用发光增强剂，将水分子从发光底物的发光位点排开，同时还可缩短发光的达峰时间。(3)单克隆抗体，提高了反应的特异性。\n[0008] 现有国外化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。\n尤其是还没有关于β人绒毛膜促性腺激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒广泛用于医疗领域。\n发明内容\n[0009] 本发明要解决的问题是提供β-hCG的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。\n[0010] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：β人绒毛膜促性腺激素磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：β-hCG校准品；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；\n生物素标记的β-hCG抗体；β-hCG抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；β-hCG质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。\n[0011] 进一步，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；\nB液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。\n[0012] 进一步，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径\n1-2um。\n[0013] 进一步，所述的β-hCG质控品包括低值质控品和高值质控品。\n[0014] 进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。\n[0015] 试剂盒的制备方法，包括以下步骤：\n[0016] （1）β-hCG校准品的配制：\n[0017] 将β-hCG抗原用含50%牛血清的校准品稀释液配制成校准品浓储液，以企业校准品进行定标，用含50%牛血清的校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0，5，25，100，250，\n1000mIU/mL；\n[0018] 上述β-hCG企业标准品的配制方法：将β-hCG抗原用含50%牛血清的校准品稀释液配成校准品浓储液，由国家标准品为其定值，按照国家标准品标定值将校准品浓储液用含50%牛血清的校准品稀释液稀释成工作浓度各点，再将工作浓度各点用国家标准品标定；分装，贴标签，储存于-20℃。β-hCG国家标准品批号为：150535，规格为：0.21IU/支。\n[0019] （2）β-hCG质控品的配制：\n[0020] 将β-hCG抗原用含有50%牛血清的校准品稀释液稀释配成浓储液，以企业校准品对其定值后，用校准品稀释液分别稀释至8～12mIU/mL和400～600mIU/mL。\n[0021] （3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：\n[0022] 取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和\n3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL \n0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。\n[0023] （4）生物素标记的β-hCG抗体的制备\n[0024] 取0.5mgβ-hCG抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01mol/L PBS溶液在\n2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；\n[0025] （5）β-hCG抗体酶结合物的制备\n[0026] 采用高碘酸钠氧化法将β-hCG抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4000，并加入5-20%酶稳定剂，储存于2~8℃；酶稳定剂是一种可以保持蛋白质在冻干或溶液下保持天然折叠构想的试剂，有利于抗原或抗体的保存，避免外界因素如温度、pH、盐、金属离子及其他污染物影响其稳定性。\n[0027] （6）20倍浓缩洗液的配制\n[0028] 20浓缩洗液包括58gL磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；\n[0029] （7）化学发光液A液和B液的配制\n[0030] A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；\n[0031] （8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；\n[0032] （9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。\n[0033] 本发明的原理是，本试剂盒采用夹心法原理测定血清或血浆中的β-hCG，在亲和素-磁微粒悬浮液中加入生物素-β-hCG抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-β-hCG抗体复合物，加入样本和酶后，会通过抗原抗体反应，形成了磁微粒-亲和素-生物素-β-hCG抗体-β-hCG-β-hCG抗体-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值RLU。样本的RLU与样本β-hCG浓度呈正相关。样本中的β-hCG浓度依据由校准品β-hCG浓度和对应的RLU建立的LogX-LogY数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的β-hCG含量。\n[0034] 本专利发明的β人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒，具有以下优点：（1）反应快速，可在40分钟内判断检测结果；操作简便，无污染。（2）灵敏度高，本试剂盒的分析灵敏度不高于2mIU/mL。（3）特异性强，与促甲状腺激素（TSH）、促黄体生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）的交叉反应系数小于1%。（4）精密度良好，精密度不高于10%。（5）稳定性良好，本产品在37℃可存放7天以上，在2～8℃可存放1年。（6）成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有临床应用价值。\n附图说明\n[0035] 图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定β-hCG与放免试剂盒测定β-hCG的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的β-hCG值，横坐标为放免试剂盒测定β-hCG值，两种方法相关系数（r）=0.9891，直线方程y=0.9393x-24.714。\n具体实施方式\n[0036] 实施例1：制备β人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅰ\n[0037] （1）β-hCG校准品的配制：\n[0038] 将β-hCG抗原用含50%牛血清的校准品稀释液配制成校准品浓储液，以企业校准品进行定标，用校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0，5，25，100，250，1000mIU/mL；\n[0039] 上述β-hCG企业标准品的配制方法：将β-hCG抗原用50%牛血清的校准品稀释液配成校准品浓储液，由国家标准品为其定值，按照国家标准品标定值将校准品浓储液用校准品稀释液稀释成工作浓度各点，再将工作浓度各点用国家标准品标定；分装，贴标签，储存于-20℃。β-hCG国家标准品批号为：150535，规格为：0.21IU/支。\n[0040] （2）β-hCG质控品的配制：\n[0041] 将β-hCG抗原用含有50%牛血清的校准品稀释液稀释配成浓储液，以企业校准品对其定值后，用校准品稀释液分别稀释至8mIU/mL的低值质控品和600mIU/mL的高值质控品。\n[0042] （3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：\n[0043] 取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和\n3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL \n0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。\n[0044] （4）生物素标记的β-hCG抗体的制备\n[0045] 取0.5mgβ-hCG抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1h；将透析后的抗体加入\n25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应60min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3次；\n[0046] （5）β-hCG抗体酶结合物的制备\n[0047] 采用高碘酸钠氧化法将β-hCG抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4000，并加入20%酶稳定剂储存于2~8℃；酶稳定剂使用SurModics In Vitro Technologies的蛋白稳定剂产品。\n[0048] （6）20倍浓缩洗液的配制\n[0049] 20浓缩洗液包括58gL磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；\n[0050] （7）化学发光液A液和B液的配制\n[0051] A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；\n[0052] （8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；\n[0053] （9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。\n[0054] 说明：\n[0055] （1）物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。\n[0056] （2）准确性：试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行（t检验，|t|<2.447）；以β-hCG企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在0.90~1.10范围内。\n[0057] （3）剂量-反应曲线的线性：用双读数数学模型拟合，剂量-反应曲线在\n0-1000mIU/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于0.9900。\n[0058] （4）分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于2mIU/mL。\n[0059] （5）精密度：10孔平行测定高值和低值质控品，计算测定结果的平均浓度 与标准差（SD），批内不精密度 使用3批产品进行3次试验，计算测\n定结果的平均浓度 与标准差（SD），批间不精密度 结果应符\n合精密度（CV%）应不高于10%。\n[0060] （6）质控品的测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Log(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为8～12mIU/mL和\n400～600mIU/mL。\n[0061] （7）特异性：\n[0062] 交叉反应符合下表要求：\n[0063] \n[0064] （8.）稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述各项要求。\n[0065] 实施例2：制备β人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅱ\n[0066] （1）β-hCG校准品的配制：\n[0067] 同实施例1β-hCG校准品的配制。\n[0068] （2）β-hCG质控品的配制：\n[0069] 将β-hCG抗原用含有50%牛血清的校准品稀释液稀释配成浓储液，以企业校准品对其定值后，用校准品稀释液分别稀释至10mIU/mL的低值质控品和500mIU/mL的高值质控品。\n[0070] （3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：\n[0071] 取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和\n3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL \n0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。\n[0072] （4）生物素标记的β-hCG抗体的制备\n[0073] 取0.5mgβ-hCG抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析2h；将透析后的抗体加入\n25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应50min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液4次；\n[0074] （5）β-hCG抗体酶结合物的制备\n[0075] 采用高碘酸钠氧化法将β-hCG抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4000，并加入5%酶稳定剂储存于2~8℃；酶稳定剂使用SurModics In Vitro Technologies的蛋白稳定剂产品。\n[0076] （6）20倍浓缩洗液的配制\n[0077] 20浓缩洗液包括58gL磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；\n[0078] （7）化学发光液A液和B液的配制\n[0079] A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；\n[0080] （8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；\n[0081] （9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。\n[0082] 实施例3：制备β人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅲ\n[0083] （1）β-hCG校准品的配制：\n[0084] 同实施例1β-hCG校准品的配制\n[0085] （2）β-hCG质控品的配制：\n[0086] 将β-hCG抗原用含有50%牛血清的校准品稀释液稀释配成浓储液，以企业校准品对其定值后，用校准品稀释液分别稀释至12mIU/mL的低值质控品和400mIU/mL的高值质控品。\n[0087] （3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：\n[0088] 取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和\n3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL \n0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。\n[0089] （4）生物素标记的β-hCG抗体的制备\n[0090] 取0.5mgβ-hCG抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析3h；将透析后的抗体加入\n25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液5次；\n[0091] （5）β-hCG抗体酶结合物的制备\n[0092] 采用高碘酸钠氧化法将β-hCG抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:4000，并加入15%酶稳定剂储存于2~8℃；酶稳定剂使用SurModics In Vitro Technologies的蛋白稳定剂产品。\n[0093] （6）20倍浓缩洗液的配制\n[0094] 20浓缩洗液包括58gL磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；\n[0095] （7）化学发光液A液和B液的配制\n[0096] A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；\n[0097] （8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；\n[0098] （9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。\n[0099] 实施例4：本发明试剂盒的使用方法\n[0100] 1将待检试剂盒在室温（18~25℃）下平衡30分钟。\n[0101] 2配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。\n[0102] 3配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。\n[0103] 4将反应管编号，向试管中依次加入10-50uL校准品或血清标本、100uL磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液、100uL生物素-β-hCG抗体结合物、100uLβ-hCG酶结合物，37℃下振荡反应10-30min，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上清液，加入500uL洗液，充分混匀后，于磁分离器上分离，倒出洗液，重复3次，在各管中加入化学发光底物液\n200-400uL，充分混匀，暗置5min，在管式化学发光仪上测定各管的发光值（RLU），以校准品浓度的Log值为横坐标，以发光值的Log为纵坐标，绘制标准曲线，根据血清标本的发光值即可计算出β-hCG的浓度。\n[0104] 实施例5：本试剂盒的方法学评价结果\n[0105] \n[0106] \n[0107] 实施例6：本试剂盒的临床对比实验\n[0108] 本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数120例，先以β-hCG放射性免疫试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定，结果表明，直线方程为y=0.9393x+-24.714，相关系数为R2=0.9783。可见本方法制备的试剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验（检验水准α=0.05），P<0.001，两种方法测定的β-hCG值的相关密切程度是显著性的，可见两种方法测定的β-hCG值密切相关。灵敏度（真阳性率）为97.32%、特异性（真阴性率）为96.52%，都较高；而假阳性率（误诊率）为3.20%、假阴性率（漏诊率）为2.69%，都较低，可见本试剂盒的测量值与实际值（原测值）的符合程度良好。粗一致性反映试剂盒诊断病人与非病人的能力，本试剂盒的粗一致性为98.12%，接近于1，说明试剂盒的诊断能力较强。\n[0109] 为了确定本试剂盒的临床参考值，对475份正常人血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测，结果表明本试剂盒的参考值（参考范围）为0~5.0mIU/mL。