一种胶原蛋白酶酶活的测定方法

1.一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的测定方法包括如下步骤：
①试剂准备：准备浓度为0.1mol/LpH7.5的Tris·Cl缓冲液、体积分数10%的三氯乙酸溶液、0.6~0.8mol/L的邻苯二甲醛溶液、0.3mmol/L的羟脯氨酸标准液、2mol/L的乙酸缓冲液、茚三酮显色液、体积分数60%的醇溶液；
②羟脯氨酸样品制备：分别移取羟脯氨酸标准液适量于比色管中稀释定容至同一体积，制成浓度为0.03~0.3μmol/mL的若干羟脯氨酸样品，取与羟脯氨酸样品相同体积的蒸馏水于比色管中作为参照样品；
③羟脯氨酸样品测定：向参照样品和各羟脯氨酸样品中分别加入与羟脯氨酸样品体积相等的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，充分混合，密封后于100~105℃水浴加热15~20min，冷却，放置10min，然后加入羟脯氨酸样品体积3倍的醇溶液稀释，以参照样品为参比溶液，在
520nm处测各羟脯氨酸样品的吸光值，根据羟脯氨酸样品的浓度C和吸光值A作出C-A标准曲线，并拟合出标准曲线公式；
④待测酶解液制备：称取0.8~1.2mg胶原底物，加入0.4~0.6mlTris·Cl缓冲液，于
35~40℃预热8~12min，加入0.1ml待测酶液，所述待测酶液体积记为V2，于35~40℃酶解反应Tmin，所述T的值为25~35，然后加入0.5~0.7ml三氯乙酸溶液摇匀，接着加入0.5~0.7ml的邻苯二甲醛溶液摇匀，最后加入0.4~0.6g硅胶，搅匀后静置5~8min，离心得上清液，该上清液体积记为V1，将所述上清液稀释至浓度0.03~0.3μmol/mL作为待测酶解液，稀释倍数记为N；
⑤空白液制备：称取0.8~1.2mg胶原底物，加入0.4~0.6ml Tris·Cl缓冲液，于
35~40℃预热8~12min，加入0.5~0.7ml三氯乙酸溶液摇匀，然后加入0.1ml待测酶液，于
35~40℃酶解反应25~35min，再加入0.5~0.7ml的邻苯二甲醛溶液摇匀，最后加入0.4~0.6g硅胶，搅匀后静置5~8min，离心得上清液，所述上清液稀释N倍后作为空白液；
⑥酶活力的测定：取待测酶解液和空白液适量于比色管中，体积记为V3，分别加入V3体积的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，充分混合，密封后于100~105℃水浴加热15~20min，冷却，放置10min，然后加入3倍V3体积的醇溶液稀释，以空白液为参比溶液，测待测酶解液在
520nm处的吸光值；
⑦测出待测酶解液吸光值A后，代入步骤③得到的标准曲线公式中得到对应的待测酶解液中的羟脯氨酸浓度C；
⑧胶原蛋白酶酶活的计算：计算公式如下：
其中，C为待测酶解液中羟脯氨酸的浓度；V1为上清液体积；MW为羟脯氨酸分子量；N为上清液稀释倍数；V2为待测酶液体积；T为酶解反应时间。
2.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，步骤②中所述适量是指0.1~1.0ml，所述同一体积是指1ml，所述浓度为0.03~0.3μmol/mL的羟脯氨酸样品的数量为6个、7个或8个。
3.根据权利要求2所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述6个羟脯氨酸样品的递增浓度依次为0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.30μmol/mL；所述7个羟脯氨酸样品的递增浓度依次为0.03、0.06、0.12、0.15、0.18、0.24、0.30μmol/mL；所述8个羟脯氨酸样品的递增浓度依次为0.03、0.06、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.30μmol/mL。
4.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的醇溶液为乙醇溶液或异丙醇溶液。
5.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的胶原底物是指不溶性胶原蛋白或明胶。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的待测酶液是由成品胶原蛋白酶配制成的0.2mg/L的酶液。
7.根据权利要求1或2或3或4或5所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，所述的硅胶为细孔硅胶。
8.根据权利要求1或2或3或4或5所述的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，其特征是，步骤④中上清液稀释至浓度0.12~0.24 μmol/mL作为待测酶解液。

一种胶原蛋白酶酶活的测定方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种蛋白酶酶活测定方法，尤其涉及一种胶原蛋白酶酶活的测定方法。\n背景技术\n[0002] 胶原蛋白（Collagen）是由动物细胞合成的一种相对分子量在30万以上的生物高分子，广泛存在于动物骨骼、肌腱、软骨、皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白的1/3，骨骼与肌键中总蛋白的90%以上，皮肤中总蛋白的50%以上，胶原蛋白具有独特的三螺旋结构，很难被一般的蛋白酶水解，只能被胶原蛋白酶特异性水解。胶原蛋白酶（collagenase），是一种以水解不溶性胶原蛋白蛋白为特征的蛋白水解酶，在多个蛋白酶家族，如金属蛋白酶家族和丝氨酸蛋白酶家族中均有存在，目前，胶原蛋白酶已广泛应用于医药、食品等领域：在工业开发中应用于胶原分级降解以获得胶原多肽；在医学研究中用于治疗椎间盘突出症等；实验室研究中作为工具酶应用于细胞和器官的分离；基础研究中应用于胶原结构的研究。\n[0003] 李陈（《胶原蛋白酶活性的测定方法》，中国皮革，2008，37(11):24-25）等人综述了胶原蛋白酶活性测定方法：以酪蛋白作为底物，反应体系为：0.1mL酶液，1mL0.6%酪蛋白溶液，50mmol/L pH7.5 Tris-HC1，4mmol/L CaC12，30℃水浴10min，然后用10%的三氯乙酸终止反应，水解释放出来的酸性肽在273nm下测定吸光值，酶活力定义为：每分钟每毫克蛋白产生相当于等量酪氨酸微摩尔数为一个酶活力单位。现有技术存在的问题是：酶活定义的标准不统一，存在底物差异性，酶活数据不一致，测量精度不高，从而影响了胶原蛋白酶及其相关产品的应用和推广。\n发明内容\n[0004] 本发明是为了克服现有技术的胶原蛋白酶酶活检测标准不统一、存在底物差异性、酶活数据不一致的不足，提供了一种标准统一、克服底物差异性、酶活数据一致、测量精度高的胶原蛋白酶酶活的测定方法。\n[0005] 本发明采用以下技术方案：\n[0006] 本发明的一种胶原蛋白酶酶活的测定方法，包括如下步骤：\n[0007] ①试剂准备：准备浓度为0.1mol/LpH7.5的Tris·Cl缓冲液、体积分数10%的三氯乙酸溶液、0.6~0.8mol/L的邻苯二甲醛溶液、0.3mmol/L的羟脯氨酸标准液、2mol/L的乙酸缓冲液、茚三酮显色液、体积分数60%的醇溶液；\n[0008] ②羟脯氨酸样品制备：分别移取羟脯氨酸标准液适量于比色管中稀释定容至同一体积，制成浓度在0.03~0.3μmol/mL递增的若干羟脯氨酸样品，取与羟脯氨酸样品相同体积的蒸馏水于比色管中作为参照样品；\n[0009] ③羟脯氨酸样品测定：向参照样品和各羟脯氨酸样品中分别加入与羟脯氨酸样品体积相等的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，充分混合，密封后于100~105℃水浴加热\n15~20min，冷却，放置10min，然后加入羟脯氨酸样品体积3倍的醇溶液稀释，以参照样品为参比溶液，在520nm处测各羟脯氨酸样品的吸光值，根据羟脯氨酸样品的浓度C和吸光值A作出C-A标准曲线，并拟合出标准曲线公式；\n[0010] ④待测酶解液制备：称取0.8~1.2mg胶原底物，加入0.4~0.6mlTris·Cl缓冲液，于35~40℃预热8~12min，加入0.1ml待测酶液，所述待测酶液体积记为V2，于35~40℃酶解反应Tmin，所述T的值为25~35，然后加入0.5~0.7ml三氯乙酸溶液摇匀，接着加入\n0.5~0.7ml的邻苯二甲醛溶液摇匀，最后加入0.4~0.6g硅胶，搅匀后静置5~8min，离心得上清液，该上清液体积记为V1，所述上清液稀释N倍后作为待测酶解液；\n[0011] ⑤空白液制备：称取0.8~1.2mg胶原底物，加入0.4~0.6ml Tris·Cl缓冲液，于\n35~40℃预热8~12min，加入0.5~0.7ml三氯乙酸溶液摇匀，然后加入0.1ml待测酶液，于\n35~40℃酶解反应25~35min，再加入0.5~0.7ml的邻苯二甲醛溶液摇匀，最后加入0.4~0.6g硅胶，搅匀后静置5~8min，离心得上清液，所述上清液稀释N倍后作为空白液，其中N的值与步骤④中的N值相同；\n[0012] ⑥酶活力的测定：取待测酶解液和空白液各一定体积于比色管中，所述体积记为V3，分别加入V3体积的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，充分混合，密封后于100~105℃水浴加热15~20min，冷却，放置10min，然后加入3倍V3体积的醇溶液稀释，以空白液为参比溶液，测待测酶解液在520nm处的吸光值；\n[0013] ⑦测出待测酶解液吸光值A后，代入步骤③得到的标准曲线公式中得到对应的待测酶解液中的羟脯氨酸浓度C；\n[0014] ⑧胶原蛋白酶酶活的计算：计算公式如下：\n[0015] \n[0016] 其中，C 为待测酶解液中羟脯氨酸的浓度；V1为上清液体积；MW 为羟脯氨酸分子量；N为上清液稀释倍数；V2为待测酶液体积；T 为酶解反应时间。\n[0017] 本发明中胶原蛋白酶酶活的定义为：在35~40℃，pH7.5条件下，每分钟每毫升酶液水解胶原蛋白产生相当于1ug羟脯氨酸的酶量为1个酶活力单位（U），本发明中待测酶液是指由成品胶原蛋白酶配制成的浓度为0.2mg/L的酶液。\n[0018] 本发明的原理如下：在酸性条件下，羟脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在波长520nm处有最大吸收峰，在一定范围内，羟脯氨酸的浓度与其吸光值成正比，羟脯氨酸是胶原蛋白中的特异性氨基酸，含量稳定，以羟脯氨酸为标准测得的胶原蛋白酶酶活克服了底物差异性，本发明中采用邻苯二甲醛与待测酶解液中的羟脯氨酸以外的其它氨基酸发生衍生反应，衍生反应物采用硅胶吸附，离心后上清液中只有羟脯氨酸，排除了其它氨基酸的干扰，测量精度高。\n[0019] 酶解上清液稀释N倍至羟脯氨酸浓度为0.03~0.3μmol/mL是指测出的吸光值A带入标准曲线公式得到的羟脯氨酸浓度控制在0.03~0.3μmol/mL内，不在\n0.03~0.3μmol/mL的范围内时，调整稀释倍数N，以使测得的羟脯氨酸浓度控制在此范围内，提高测量精度。\n[0020] 作为优选，步骤②中所述适量是指0.1~1.0ml，所述同一体积是指1ml，所述浓度为0.03~0.3μmol/mL的羟脯氨酸样品的数量为6个、7个或8个。\n[0021] 作为优选，所述6个羟脯氨酸样品的递增浓度依次为0.03、0.06、0.12、0.18、\n0.24、0.30μmol/mL；所述7个羟脯氨酸样品的递增浓度依次为0.03、0.06、0.12、0.15、\n0.18、0.24、0.30μmol/mL；所述8个羟脯氨酸样品的递增浓度依次为0.03、0.06、0.12、\n0.15、0.18、0.21、0.24、0.30μmol/mL。\n[0022] 作为优选，所述的醇溶液为乙醇溶液或异丙醇溶液。使用乙醇或异丙醇成本低廉，安全性高。\n[0023] 作为优选，所述的胶原底物为不溶性胶原蛋白或明胶。\n[0024] 作为优选，所述的硅胶为细孔硅胶。比表面积大，吸附性能好，化学稳定性好，使用少量即可满足吸附要求。\n[0025] 作为优选，步骤④中上清液稀释至浓度0.12~0.24μmol/mL作为待测酶解液。羟脯氨酸浓度C的范围在0.12~0.24μmol/mL时，标准曲线中吸光值A与浓度C呈最佳的线性关系，将样品待测液的浓度控制在此范围内，测量精度最高。\n[0026] 因此，本发明的优点是：（1）羟脯氨酸是胶原蛋白中特异性氨基酸、含量稳定，以羟脯氨酸为统一标准，克服了胶原蛋白酶酶活测定的底物差异性；（2）使用邻苯二甲醛作为掩蔽剂和硅胶作为吸附剂，排除了其它氨基酸的干扰，测定精度高；（3）所需仪器简单、操作方便。\n附图说明\n[0027] 图1是本发明的C-A标准曲线图。\n具体实施方式\n[0028] 下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。\n[0029] 各试剂均系分析纯，所配制的试剂溶液适用于下列各实施例，除特别指明外，溶剂均为蒸馏水，各实施例所用仪器与材料如下：\n[0030] （1）分光光度计（UV2000）\n[0031] （2）不溶性胶原蛋白：丝状胶原蛋白（沃辛顿化学公司，WBC）\n[0032] （3）明胶\n[0033] （4）羟脯氨酸，即反式-4-羟基-L-脯氨酸（美国波士顿生物技术公司，BBI）[0034] （5）硅胶\n[0035] 实施例1\n[0036] ①试剂准备\n[0037] （1）0.1mol/L Tris·Cl缓冲液（含50mmol CaCl2，pH7.5）：称取3.15g Tris·Cl溶解于200mL蒸馏水中，加入1.11g氯化钙，充分溶解后用3mol/L NaOH调节pH至7.5；\n[0038] （2）10%三氯乙酸（TCA）溶液：50mL三氯乙酸与450mL蒸馏水混匀；\n[0039] （3）0.6mol/L邻苯二甲醛溶液：0.6mol的邻苯二甲醛用蒸馏水定容至1L；\n[0040] （4）0.3mmol/L羟脯氨酸标准液：称取39.4mg的羟脯氨酸溶于蒸馏水，定容至1L；\n[0041] （5）2mol/L乙酸缓冲液：将2mol的乙酸钠用蒸馏水溶解，定容至1L，2mol的乙酸用蒸馏水定容至1L，然后将上述乙酸钠溶液和乙酸溶液按体积比43:7混合，pH为5.4；\n[0042] （6）茚三酮显色液：取 85mg 水合茚三酮和15mg还原茚三酮混合，然后用 10ml 乙二醇甲醚溶解，4℃避光保存，所述还原茚三酮制备方法如下：称取0.5g茚三酮，用\n12.5ml沸蒸馏水溶解，得黄色溶液，将0.5g维生素C用25ml温蒸馏水溶解，然后边搅拌边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀，滴加完毕后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤，沉淀用冷水洗涤3次，真空干燥得还原茚三酮；\n[0043] （7）60%乙醇或异丙醇：300mL 乙醇或异丙醇溶于200mL蒸馏水。\n[0044] ②羟脯氨酸样品制备：分别移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的羟脯氨酸标准液于25ml比色管中，用蒸馏水补齐定容至1mL，稀释成浓度分别为0.03、0.06、0.12、0.18、\n0.24、0.30μmol/mL的6个羟脯氨酸样品，取1.0ml蒸馏水于25ml比色管中作为参照样品；\n[0045] ③羟脯氨酸样品测定：向参照样品和各羟脯氨酸样品中分别加入1mL 2mol/L的乙酸缓冲液和1mL茚三酮显色液，充分混合，密封后于100℃水浴加热20min，冷却，放置\n10min，加入3mL 60%乙醇溶液稀释，以参照样品为参比溶液，在520nm处测各羟脯氨酸样品的吸光值，各羟脯氨酸样品的浓度C与测出的吸光值A见表1：\n[0046] \n[0047] 根据羟脯氨酸样品的浓度C和吸光值A作出C-A标准曲线，并拟合出标准曲线公式：C=2.748A-0.2325。\n[0048] ④待测酶解液制备：称取0.8mg不溶性胶原蛋白，加入0.4mL 0.1mol/L的Tris·Cl缓冲液于35℃预热8min，再加入0.1mL酶液，于35℃反应25min，加入0.5mL 10%的三氯乙酸溶液，充分混合以终止反应，然后加入0.5mL0.8mol/L的邻苯二甲醛溶液，摇匀反应5min，然后加入0.4g硅胶，摇匀后静置5min，离心得上清液1.5ml，将上清液稀释25倍作为待测酶解液；\n[0049] ⑤空白液制备：称取0.8mg不溶性胶原蛋白，加入0.4mL 0.1mol/L的Tris·Cl缓冲液，35℃预热8min，加入0.5mL 10%的三氯乙酸，摇匀后再加0.1mL酶液，35℃反应\n25min，然后加入0.5mL0.8mol/L的邻苯二甲醛溶液，摇匀反应5min，然后加入0.4g硅胶，摇匀后静置5min，离心得上清液1.5ml，将离心清液稀释25倍作为空白液；\n[0050] ⑥酶活力测定：各取1.0mL待测酶解液和空白液，分别加入1.0mL 2mol/L的乙酸缓冲液和1.0mL茚三酮显色液，充分混合，密封后于100℃水浴加热20min，冷却，放置\n10min，加入3mL 60%乙醇稀释，以空白液为参照，测出待测酶解液在520nm处的吸光值为\n0.130;\n[0051] ⑦将吸光值0.130代入标准曲线公式C=2.748A-0.2325得到待测酶解液中羟脯氨酸浓度为0.1247μmol/mL。\n[0052] ⑧胶原蛋白酶酶活的计算：计算公式如下：\n[0053] \n[0054] 其中：C=0.1247μmol/mL；V1=1.5ml；V2=0.1ml；MW=131.3；N=25；T=25min。\n[0055] 代入公式： = =246.2\n[0056] 实施例2\n[0057] ①试剂准备：同实施例1，不同之处是邻苯二甲醛浓度为0.8mol/l；\n[0058] ②羟脯氨酸样品制备：分别移取0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mL的羟脯氨酸标准液于25ml比色管中，用蒸馏水补齐定容至1mL，稀释成浓度分别为0.03、0.06、0.12、\n0.15、0.18、0.24、0.30μmol/mL的7个羟脯氨酸样品，取1.0ml蒸馏水于25ml比色管中作为参照样品；\n[0059] ③羟脯氨酸样品测定：操作条件同实施例1，不同之处是：水浴温度为105℃，时间为15min，拟合出标准曲线公式：C=2.7483A-0.2328。\n[0060] ④待测酶解液制备：称取1.2mg不溶性胶原蛋白，加入0.6mL 0.1mol/L的Tris·Cl缓冲液于40℃预热12min，再加入0.1mL酶液，于40℃反应35min，加入0.7mL 10%的三氯乙酸溶液，充分混合以终止反应，然后加入0.7mL0.8mol/L的邻苯二甲醛溶液，摇匀反应8min，然后加入0.6g硅胶，摇匀后静置8min，离心得上清液2.1ml，将上清液稀释20倍作为待测酶解液；\n[0061] ⑤空白液制备：称取1.2mg不溶性胶原蛋白，加入0.6mL 0.1mol/L的Tris·Cl缓冲液， 40℃预热12min，加入0.7mL 10%的三氯乙酸，摇匀后再加0.1mL酶液，40℃反应\n35min，然后加入0.7mL0.8mol/L的邻苯二甲醛溶液，摇匀反应8min，然后加入0.6g硅胶，摇匀后静置8min，离心得上清液2.1ml，将离心清液稀释20倍作为空白液；\n[0062] ⑥酶活力测定：各取1.0mL待测酶解液和空白液，分别加入1.0mL 2mol/L的乙酸缓冲液和1.0mL茚三酮显色液，充分混合，密封后于105℃水浴15min，冷却，放置10min，加入3mL 60%异丙醇稀释，以空白液为参照，测出待测酶解液在520nm处的吸光值为0.142;\n[0063] ⑦将吸光值0.142代入标准曲线公式C=2.7483A-0.2328得到待测酶解液中羟脯氨酸浓度为0.158μmol/mL。\n[0064] ⑧胶原蛋白酶酶活的计算：计算公式如下：\n[0065] \n[0066] 其中：C=0.158μmol/mL；V1=2.1ml；V2=0.1ml；MW=131.3；N=20；T=35min。\n[0067] 代入公式： = =248.9\n[0068] 实施例3\n[0069] ①试剂准备：同实施例1，不同之处是邻苯二甲醛浓度为0.7mol/l；\n[0070] ②羟脯氨酸样品制备：分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.7、0.8、1.0mL的羟脯氨酸标准液于25ml比色管中，用蒸馏水补齐定容至1mL，稀释成浓度分别为0.03、0.06、0.12、\n0.15、0.18、0.21、0.24、0.30μmol/mL的8个羟脯氨酸样品，取1.0ml蒸馏水于25ml比色管中作为参照品；\n[0071] ③羟脯氨酸样品测定：操作条件同实施例1，不同之处是：水浴温度为102℃，时间为18min；拟合出标准曲线公式：C=2.7488A-0.2432。\n[0072] ④待测酶解液制备：称取1.0mg不溶性胶原蛋白，加入0.5mL 0.1mol/L的Tris·Cl缓冲液于37℃预热10min，再加入0.1mL酶液，于37℃反应30min，加入0.6mL 10%的三氯乙酸溶液，充分混合以终止反应，然后加入0.6mL0.8mol/L的邻苯二甲醛溶液，摇匀反应6min，然后加入0.5g硅胶，摇匀后静置6min，离心得上清液1.8ml，将上清液稀释25倍作为待测酶解液；\n[0073] ⑤空白液制备：称取1.0mg不溶性胶原蛋白，加入0.5mL 0.1mol/L的Tris·Cl缓冲液，37℃预热10min，加入0.6mL 10%的三氯乙酸，摇匀后再加0.1mL酶液，37℃反应\n30min，然后加入0.6mL0.8mol/L的邻苯二甲醛溶液，摇匀反应6min，然后加入0.5g硅胶，摇匀后静置6min，离心得上清液1.8ml，将离心清液稀释25倍作为空白液；\n[0074] ⑥酶活力测定：各取1.0mL待测酶解液和空白液，分别加入1.0mL 2mol/L的乙酸缓冲液，充分混合，然后分别加入1.0mL茚三酮显色液，充分混合，密封后于102℃水浴加热18min，冷却，放置10min，加入3mL 60%乙醇稀释，以空白液为参照，测出待测酶解液在\n520nm处的吸光值为0.135;\n[0075] ⑦将吸光值0.135代入标准曲线公式C=2.7488A-0.2432得到待测酶解液中羟脯氨酸含量为0.128μmol/mL。\n[0076] ⑧胶原蛋白酶酶活的计算：计算公式如下：\n[0077] \n[0078] 其中：C=0.128μmol/mL；V1=1.8ml；V2=0.1ml；MW=131.3；N=25；T=30min。\n[0079] 代入公式： = =251.9\n[0080] 实施例4\n[0081] ①试剂准备：同实施例1；\n[0082] ②羟脯氨酸样品制备：同实施例1；\n[0083] ③羟脯氨酸样品测定:同实施例1；\n[0084] ④待测酶解液制备：以明胶为胶原底物，其它操作条件同实施例1；\n[0085] ⑤空白液制备：以明胶为胶原底物，其它操作条件同实施例1；\n[0086] ⑥酶活力测定：操作条件同实施例1，测得待测酶解液吸光值A为0.129；\n[0087] ⑦将吸光值A=0.129代入标准曲线公式C=2.748A-0.2325，得待测酶解液中羟脯氨酸浓度C=0.122μmol/mL；\n[0088] ⑧胶原蛋白酶酶活的计算：计算公式如下：\n[0089] \n[0090] 其中：C=0.122μmol/mL；V1=1.5ml；V2=0.1ml；MW=131.3；N=25；T=25min。\n[0091] 代入公式： = =240.3\n[0092] 实施例5\n[0093] ①试剂准备：同实施例2；\n[0094] ②羟脯氨酸样品制备：同实施例2；\n[0095] ③羟脯氨酸样品测定:同实施例2；\n[0096] ④待测酶解液制备：以明胶为胶原底物，其它操作条件同实施例2；\n[0097] ⑤空白液制备：以明胶为胶原底物，其它操作条件同实施例2；\n[0098] ⑥酶活力测定：操作条件同实施例2，测得待测酶解液吸光值A为0.143；\n[0099] ⑦将吸光值A=0.143代入标准曲线公式C=2.7483A-0.2328，得待测酶解液中羟脯氨酸浓度C=0.160μmol/mL；\n[0100] ⑧胶原蛋白酶酶活的计算：计算公式如下：\n[0101] \n[0102] 其中：C=0.160μmol/mL；V1=2.1ml；V2=0.1ml；MW=131.3；N=20；T=35min。\n[0103] 代入公式： = =251.5\n[0104] 实施例6\n[0105] ①试剂准备：同实施例3；\n[0106] ②羟脯氨酸样品制备：同实施例3；\n[0107] ③羟脯氨酸样品测定:同实施例3；\n[0108] ④待测酶解液制备：以明胶为胶原底物，其它操作条件同实施例3；\n[0109] ⑤空白液制备：以明胶为胶原底物，其它操作条件同实施例3；\n[0110] ⑥酶活力测定：操作条件同实施例3，，测得吸光值A为0.131；\n[0111] ⑦将吸光值A=0.131代入标准曲线公式C=2.7488A-0.2328，得待测酶解液中羟脯氨酸浓度C=0.127μmol/mL；\n[0112] ⑧胶原蛋白酶酶活的计算：计算公式如下：\n[0113] \n[0114] 其中：C=0.127μmol/mL；V1=1.8ml；V2=0.1ml；MW=131.3；N=25；T=30min。\n[0115] 代入公式： = =250.1\n[0116] 本发明测得的胶原蛋白酶酶活的数据对比见表2：\n[0117] \n 不溶性胶原蛋白 明胶\n实施例1 246.2(U) \n实施例2 248.9(U) \n实施例3 251.9(U) \n实施例4 240.3(U)\n实施例5 251.5(U)\n实施例6 250.1(U)\n[0118] 由表2数据可知，本发明胶原蛋白酶酶活测定方法克服了底物差异性，测得的酶活精度高，数据一致性好，因此本发明具有显著的有益效果。