一种合成三聚氰胺完全抗原的方法及检测三聚氰胺的ELISA试剂盒

1.一种人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，其特征在于：以三聚氰胺为半抗原，通过戊二醛法与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原。
2.根据权利要求1所述的完全抗原制备的单克隆抗体检测三聚氰胺的直接竞争ELISA试剂盒，组成包括：三聚氰胺酶标物、三聚氰胺标准液、包被三聚氰胺单克隆抗体的酶标板、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液及样品稀释液。
3.权利要求2所述试剂盒的制备方法，其特征在于：以三聚氰胺为半抗原，通过与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原；通过完全抗原免疫小鼠、细胞融合、筛选及克隆化培养过程制备单克隆抗体；将单克隆抗体包被于酶标板制备包被三聚氰胺单克隆抗体的酶标板，再加入三聚氰胺酶标物、三聚氰胺标准液、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液及样品稀释液，组成ELISA试剂盒。
4.权利要求3所述ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于：所述三聚氰胺酶标物所用酶为辣根过氧化物酶，通过过碘酸钠法与三聚氰胺偶联制备三聚氰胺酶标物。

一种合成三聚氰胺完全抗原的方法及检测三聚氰胺的\nELISA试剂盒\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，尤其是提供了应用单克隆抗体术研制的检测三聚氰胺的ELISA试剂盒，同时还公开了其制备方法，属于酶联免疫技术领域。\n背景技术\n[0002] 三聚氰胺(melamine)简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料。这种化学品常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂。三聚氰胺含氮量为66.6％，折合成粗蛋白含量为416.27％，掺入少量就可以迅速提高蛋白含量，使产品在常规检查中显得含有较高的蛋白质，常被不法商贩冒充成高蛋白物质加入，以提高检测时食品中蛋白质检测数值，还能大幅度降低成本。由于三聚氰胺不溶解在水里，抗氨氮测定，加上三聚氰胺为白色粉末，易被染色，很容易混入原料中而不被发现。所以一般的分析化验部门很难分析出来。\n[0003] 国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》(第三卷)表明：长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石，因此三聚氰胺是一种禁止用于食品及动物饲料的化学物质。\n[0004] 目前，三聚氰胺检测方法主要是气相色谱法和高效液相色谱法。高效液相色谱法虽操作简单，但检出限较高，无法满足对三聚氰胺低残留限量的要求；气相色谱法灵敏度较高，但样品前处理过程复杂、分析速度慢，不适合在基层推广使用；并且气相色谱法和高效液相色谱法需要昂贵的专门设备，不适合现场检测，对检测人员的技术要求较高。\n[0005] 基于抗原抗体特异性反应建立起来的ELISA检测方法，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强和价格低廉等诸多优点，可以直接用于生产实践。\n发明内容：\n[0006] 本发明公开一种人工合成三聚氰胺完全抗原的方法，用于制备单克隆抗体或多克隆抗体。\n[0007] 本发明还提供了应用单克隆抗体检测三聚氰胺的直接竞争ELISA检测试剂盒的制备方法，适合工厂化生产。\n[0008] 本发明公开的人工合成三聚氰胺完全抗原是通过以下方法得到的：\n[0009] 以三聚氰胺为半抗原，通过戊二醛法与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原。\n[0010] 本发明提供的ELISA检测试剂盒的组成包括：\n[0011] 三聚氰胺酶标物、三聚氰胺标准液、包被三聚氰胺单克隆抗体的酶标板、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液及样品稀释液等。\n[0012] 所述单克隆抗体为以三聚氰胺为半抗原，通过与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原，并通过小鼠免疫、细胞融合、筛选及克隆化培养制得；所述三聚氰胺酶标物采用化学方法偶联得到，标记酶为辣根过氧化物酶，所述方法为过碘酸钠法；所述样品稀释液为含0.1％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4；所述洗涤液为含0.05％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4；所述酶标物稀释液为含0.01％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4；底物显色液：\nA液为0.1mol/LpH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.3％过氧化氢储备液，每1mL缓冲液加入14uL储备液，制成使用液；B液为四甲基联苯胺，先用丙酮配成0.2mg/mL溶液，用0.1mol/LpH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成0.2mg/L溶液。\n[0013] 另一方面，本发明还提供检测样品中三聚氰胺含量的方法，步骤如下：\n[0014] (1)样品前处理\n[0015] (2)用权利要求2所述的ELISA检测试剂盒检测，向包被三聚氰胺单抗的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，加入三聚氰胺酶标物，孵育30分钟，洗涤液洗涤，加入显色液孵育20分钟，终止液终止反应，用酶标仪测定吸光度值。\n[0016] (3)分析检测结果\n[0017] 本发明人工合成三聚氰胺完全抗原的原理为：\n[0018] 戊二醛(GA)是一种同型双功能交联剂，它的两个功能基可以与多聚赖氨酸和三聚氰胺上的氨基结合，形成多聚赖氨酸-GA-三聚氰胺的结合物。用两步法先将多聚赖氨酸与过量的GA反应，形成二者的结合物，然后再将该结合物与抗体蛋白质分子的氨基交联，形成多聚赖氨酸-GA-三聚氰胺的结合物，制备成三聚氰胺的完全抗原，可用于免疫动物制备单克隆抗体或多克隆抗体。\n[0019] 本发明试剂盒的检测原理为：\n[0020] 将抗三聚氰胺的单克隆抗体包被于固相载体上，加入样本或三聚氰胺标准品溶液并加入三聚氰胺酶标物，待检样品中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标物竞争包被于固相载体上的单克隆抗体，通过洗涤除去未结合的三聚氰胺酶标物，加入显色液显色后终止反应，测定样品吸光度值，改值与样品中三聚氰胺的量呈负相关，与标准曲线比较即可测定样品中三聚氰胺的浓度。\n[0021] 本发明的积极效果在于：\n[0022] 本发明首次公开一种新的合成三聚氰胺完全抗原的方法，为制备单克隆抗体或多克隆抗体奠定了基础；并首次应用单克隆抗体建立了一种检测三聚氰胺的直接竞争ELISA试剂盒，可定性或定量分析样品中的三聚氰胺，适和工厂化生产。本发明的试剂盒缩短了检测时间，对样品的前处理要求低，处理过程简单，并配备了相关的样品处理试剂，能够同时迅速检测大批样品。\n[0023] 本发明的试剂盒所有试剂均为已配制好的工作液，可以直接操作无需处理，减少了操作步骤，可以快速，灵敏检测液态牛奶、奶粉、固体样品中的三聚氰胺，避免了复杂的操作，对设备要求低，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要；并且本发明的试剂盒样本用量小，试剂保存时间长，自动化程度高，对操作者无毒性，对环境无污染等；因此本发明应用单克隆抗体建立的ELISA检测试剂盒具有重大的社会意义和广阔的市场前景。\n附图说明\n[0024] 图1.三聚氰胺抑制曲线。\n具体实施方式\n[0025] 通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。\n[0026] 实施例1\n[0027] 制备三聚氰胺完全抗原\n[0028] 通过戊二醛法使三聚氰胺与多聚赖氨酸偶联制备完全抗原，具体步骤如下：\n[0029] 1.取100mg多聚赖氨酸溶于20mL pH7.2PBS中，加入2mL50％戊二醛，40℃作用\n18h。\n[0030] 2.用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过夜，期间更换透析液三次。\n[0031] 3.用1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液调节洗脱液或透析液pH值至9.0～9.6，将\n100mg三聚氰胺直接溶于洗脱液或透析液中，37℃作用18h。\n[0032] 4.装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2PBS，4℃透析过夜。\n[0033] 5.用PEG8000浓缩透析液，加入等量50％甘油，小量分装，4℃或20℃保存。用此方法制备的完全抗原可直接免疫动物，制备单克隆抗体或多克隆抗体。\n[0034] 实施例2\n[0035] 三聚氰胺特异性单克隆抗体的制备\n[0036] 用实施例1方法制备的完全抗原作为免疫原，选用健康8周龄雌性BALB/C小鼠作为免疫动物，免疫剂量1mg/只，采取腹腔注射，每次免疫间隔为2周，免疫5次。初次免疫用免疫原与弗氏完全佐剂(体积比＝1：1)注射，二、三、四次免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂混合，最后一次不加佐剂用2倍量免疫，3天后取小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞。采取有限稀释法筛选杂交瘤细胞，筛选能够稳定分泌三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体的生产与纯化，小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，采集腹水，经硫酸铵盐析，SPA-Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化单抗，加入0.01％叠氮钠，经真空冷冻干燥后置-20℃保存。\n[0037] 实施例3\n[0038] 三聚氰胺酶标物的制备\n[0039] 酶标抗原中的酶可为辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)，优选为HRP，HRP-三聚氰胺标记物采用过碘酸钠法制备，具体如下：\n[0040] 1.称取10mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。\n[0041] 2.于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。\n[0042] 3.将上述溶液装入透析袋中，1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液4℃透析过夜。\n[0043] 4.加20μL0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0～9.5。\n[0044] 5.0.5mg半抗原溶于1mL0.01M碳酸盐缓冲液中，分为两份，加入到醛化的HRP中，室温避光轻轻搅拌2小时。\n[0045] 6.加0.1ml新配的4mg/mL NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。\n[0046] 7.将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4℃过夜。\n[0047] 8.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。\n[0048] 9.3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。\n[0049] 10.将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲液透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，加入等量\n50％甘油，小量分装，4℃或-20℃保存。\n[0050] 实施例4\n[0051] 直接竞争ELISA方法的建立\n[0052] 1.单抗最佳包被浓度和三聚氰胺酶结合物最佳稀释度的确定\n[0053] 以倍比稀释的单抗包被酶标板，包被过夜后，1％ BSA 37℃封闭1h，洗涤后，按分别检测阴、阳性样品，比较阴、阳性样品的OD值，选择阳性OD值较高、阴性OD值较低和P/N值较高的单抗工作浓度作为最佳包被浓度；经测定最佳包被浓度为1.41ug/mL。单抗用最佳包被浓度包被酶标板，检测酶结合物最佳稀释度，经测定三聚氰胺酶结合物最佳稀释度为8000×。\n[0054] 2.ELISA检测单抗IC50值：\n[0055] 以最佳包被浓度用单抗包被酶标板，准备0ug/L、5ug/L、10ug/L、50ug/L、100ug/L和200ug/L三聚氰胺标准品，加入50uL标准品和50uL最佳稀释度酶标结合物，室温反应30分钟，洗涤后显色20分钟终止反应，酶标仪测定OD450nm值。检测结果见图1。由图1可见三聚氰胺单克隆抗体IC50在10ug/L左右，表明本发明制备的单克隆抗体有较好的特异性，能够满足检测三聚氰胺ELISA试剂盒的要求。\n[0056] 实施例5\n[0057] 检测三聚氰胺直接竞争ELISA试剂盒的组建\n[0058] ELISA检测试剂盒包括以下组分：\n[0059] 1.三聚氰胺标准溶液：浓度分别为0ug/L、5ug/L、10ug/L、50ug/L、100ug/L和\n200ug/L，共六瓶。\n[0060] 2.包被三聚氰胺单克隆抗体的96孔聚苯乙烯酶标板。\n[0061] 3.三聚氰胺酶标物：HRP-三聚氰胺酶标物浓度为1mg/L。\n[0062] 4.底物显色液：A液为0.1mol/LpH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成\n0.3％过氧化氢储备液，每1mL缓冲液加入14uL储备液，制成使用液；B液为四甲基联苯胺，先用丙酮配成0.2mg/mL溶液，用0.1mol/LpH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸缓冲液配制成\n0.2mg/L溶液。\n[0063] 5.洗涤液：含0.05％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4。\n[0064] 6.酶标物稀释液：含0.01％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4.[0065] 7.样品稀释液：含0.1％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4。\n[0066] 8.终止液：2mol/L硫酸。\n[0067] 试剂盒的保存温度为4℃保存。\n[0068] 实施例6\n[0069] 样品中三聚氰胺残留的检测\n[0070] 1.样品前处理：\n[0071] 液态奶：用样品稀释液1：10稀释；\n[0072] 奶粉：按样品包装说明用样品稀释液代替水稀释，再用样品稀释液1：10稀释；\n[0073] 固体样品：称取样品加入5倍体积DMSO振荡1小时，离心取上清，用样品稀释液稀释，制备样品溶液。\n[0074] 2.试剂盒检测：\n[0075] (1)将向包被三聚氰胺单克隆抗体的酶标板中加入50uL样品或三聚氰胺标准品溶液，并加入50uL三聚氰胺酶标物；\n[0076] (2)轻轻振荡30秒，室温反应30分钟；\n[0077] (3)洗涤：倾去孔内的液体，用洗涤液注满各孔(约300μl)，然后倒掉洗涤液，如此反复3次，最后一次在吸水纸上拍干；\n[0078] (4)加入50uL三聚氰胺酶标物，37℃反应20分钟；\n[0079] (5)加50uL终止液终止反应；\n[0080] (6)用酶标仪读出OD450nm值。\n[0081] 3.结果分析：\n[0082] 绘制标准曲线，相对应每一个样品中三聚氰胺的含量可从标准曲线上读出，也可以用回归方程计算出样本中三聚氰胺的含量。测得的吸光度与样品中的三聚氰胺含量成反比，可通过标准曲线计算三聚氰胺的含量。\n[0083] 实施例7\n[0084] 往无三聚氰胺的的鲜牛奶中添加50ug/L的三聚氰胺作为实际样品，用试剂盒进行检测。\n[0085] 1.样品前处理：\n[0086] 用样品稀释液1：10稀释，制备样品溶液。\n[0087] 2.试剂盒检测：\n[0088] (1)将向包被三聚氰胺单克隆抗体的酶标板中加入50uL样品或三聚氰胺标准品溶液，并加入50uL三聚氰胺酶标物；\n[0089] (2)轻轻振荡30秒，室温反应30分钟；\n[0090] (3)洗涤：倾去孔内的液体，用洗涤液注满各孔(约300μ1)，然后倒掉洗涤液，如此反复3次，最后一次在吸水纸上拍干；\n[0091] (4)加入50uL三聚氰胺酶标物，37℃反应20分钟；\n[0092] (5)加50uL终止液终止反应；\n[0093] (6)用酶标仪读出OD450nm值，经测定数值为1.012。\n[0094] 3.结果分析：\n[0095] 通过标准曲线比较，求得样品溶液三聚氰胺的含量为5ug/L，因为样品溶液经前处理已经稀释10倍，所以测定样品牛奶中三聚氰胺的含量为50ug/L。