一种检测三聚氰胺的直接竞争法酶联免疫试剂盒

1.一种检测三聚氰胺的直接竞争法酶联免疫试剂盒，其中包括：三聚氰胺特异性抗体、三聚氰胺标准品、酶标记三聚氰胺、包被了酶标记三聚氰胺、包被有三聚氰胺特异性抗体的酶标板、三聚氰胺标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液、浓缩样品稀释液以及酶标物稀释液。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述三聚氰胺特异性抗体为多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶标记三聚氰胺所用的酶为辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的洗涤液为含有
0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的显色剂由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
6.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的浓缩样品稀释液为含
0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶标物稀释液为含
0.01％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
8.一种检测样品中三聚氰胺含量的方法，包括步骤：
(1)样品前处理；
(2)用权利要求1-7任一所述的试剂盒进行检测，向包被有三聚氰胺抗体的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入酶标记三聚氰胺，孵育后洗涤拍干，加入显色剂、终止液，用酶标仪测定吸光度值；
(3)分析检测结果。

一种检测三聚氰胺的直接竞争法酶联免疫试剂盒\n技术领域\n[0001] 本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测领域。具体而言，本发明涉及一种用于检测三聚氰胺的直接竞争法酶联免疫试剂盒。\n[0002] 技术背景\n[0003] 三聚氰胺(Melamine)，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，白色结晶粉末，无味。这种化学品常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂，在部分亚洲国家，它也被用以制造化肥。它是一种禁止用于宠物食品及动物饲料的化学物质，动物食用后可以使动物发生肾衰竭并导致死亡。\n[0004] 2007年3月中旬以来，美国发生多起宠物猫、狗中毒死亡事件。经调查，是由于一些宠物饲料供应商为了增加饲料中蛋白质的含量，在小麦蛋白粉和大米蛋白粉中添加了三聚氰胺，从而导致猫、狗中毒死亡。\n[0005] 因此亟需建立方便快捷且灵敏度高的检测方法，禁止此类事件的发生。\n[0006] 现有的三聚氰胺检测方法多为色谱法，但是这些方法需要有完善的实验室，有经验的技术人员，复杂的仪器设备，且检测过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。基于此原理建立的直接竞争法酶联免疫检测技术较间接方法进一步缩短了检测时间。该技术的关键是完全抗原和酶标记抗原的合成及抗体的制备。\n[0007] 目前，三聚氰胺的直接竞争酶联免疫检测方法尚未见报道。\n发明内容\n[0008] 本发明的目的在于提供一种快速检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒。\n[0009] 本发明提供了一种快速检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括：三聚氰胺特异性抗体酶标板、酶标三聚氰胺。其中三聚氰胺特异性抗体为兔抗三聚氰胺的多克隆抗体，用三聚氰胺与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔)制得。所述的酶标记三聚氰胺采用化学方法偶联得到，标记酶为辣根过氧化物酶，所述偶联方法为琥珀酸酐法。\n[0010] 用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。\n[0011] 为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括包被有三聚氰胺特异性抗体的酶标板、三聚氰胺标准溶液、显色剂、洗涤液、终止液、酶标物稀释液和浓缩样品稀释液。\n[0012] 所述的洗涤液为0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1∶1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的浓缩样品稀释液为含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液，所述的酶标物稀释液为含0.01％吐温-20的磷酸盐缓冲液。\n[0013] 另一方面，本发明还提供了一种检测饲料样品中三聚氰胺含量的方法，包括步骤：\n[0014] (1)样品前处理；\n[0015] (2)用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有三聚氰胺抗体的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入酶标记三聚氰胺，孵育后洗涤拍干，加入显色剂显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；\n[0016] (3)分析检测结果。\n[0017] 本发明试剂盒的检测原理为：\n[0018] 将三聚氰胺抗体包被于固相载体上，加入样本或三聚氰胺标准品溶液并加入酶标记三聚氰胺工作液，待测样品中的三聚氰胺与酶标记三聚氰胺竞争固相化的三聚氰胺抗体，通过洗涤出去未结合的酶标记物，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中三聚氰胺的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出三聚氰胺浓度范围。\n[0019] 有益效果：\n[0020] 本发明检测三聚氰胺的试剂盒主要采用直接竞争酶联免疫测定法定性或定量检测样品中三聚氰胺含量；进一步缩短了检测时间，有间接竞争法的2个小时缩短为1个小时，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。\n[0021] 本发明该试剂盒采用高特异性的三聚氰胺多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料及动物源性产品检测中发挥重要作用。\n附图说明\n[0022] 图1为三聚氰胺抑制曲线。\n[0023] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。\n[0024] 实施例1三聚氰胺免疫原的合成及免疫血清的制备[0025] 1.1试剂与仪器\n[0026] 三聚氰胺(北京百灵威试剂有限公司)，琥珀酸酐(购自北京耀北生物技术有限公司)，吡啶(Pyridine，AR.WM＝79.10，含量＞99.5％，天津市科密欧化学试剂开发中心)，N，N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF，美国新泽西州ACROSORGANICS公司生产，购自百灵威化学试剂公司)，正三丁胺(Tributylamine，美国新泽西州ACROSORGANICS公司生产，购自百灵威化学试剂公司)，氯甲酸异丁酯购(自百灵威化学试剂公司)，牛血清白蛋白(BSA)、辣根过氧化物酶(HRP)等(购自北京耀北生物技术有限公司)，其它试剂均为分析纯。\n[0027] 双光束紫外可见分光光度仪(TU-1909，北京普析通用仪器有限公司)，层析装置(3057型便携式记录仪，重庆川仪四厂；SBS系列数控计滴器，恒流泵，自动部分收集器，层析柱，上海沪西分析仪器厂)，磁力搅拌器(上海东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机(Minispin最大转速13400rpm最大离心力12100rcf，2ml×12)。\n[0028] 1.2三聚氰胺人工抗原的合成\n[0029] 称取三聚氰胺63.06mg(0.5mmol)溶于5ml吡啶溶液中，加入琥珀酸酐50mg室温搅拌反应过夜。\n[0030] 吹干吡啶，用10ml溶剂(DMF和1，4-二恶烷1∶1混合)溶解Rac-戊二酸酐半醛，加入131μl(约0.5mmol)三丁胺，冰中搅拌10min，加入氯甲酸异丁酯72μl(约0.5mmol)，转入室温搅拌反应1小时。活化的三聚氰胺溶液逐滴加入到0.1M pH 8.5冰冷载体蛋白(BSA或OVA)硼酸钠溶液中，1小时内加完，室温搅拌反应过夜。\n[0031] 然后，将偶联物过SephadexG-25M凝胶层析纯化，用0.01M pH 7.4PBS三倍柱床体积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓缩至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物，洗脱液用pH 7.40.01M PBS。\n[0032] 1.3免疫及特异性抗体的制备\n[0033] 将上述三聚氰胺-BSA偶联物用生理盐水稀释成1mg/ml溶液备用。\n[0034] 选取6只体重2～2.5Kg健康雄性新西兰大白兔。将偶联物与等量弗氏完全佐剂通过注射器对抽法混合成油包水的乳浊液，按1mg/Kg体重的量进行首次免疫，采取背部皮下多点注射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后10天，耳缘静脉取血1ml，进行抗体效价检测，当抗体效价不再升高时，不加佐剂进行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后颈动脉放血，室温凝固2h后4℃过夜，8000r/min离心10分钟，除去血块，血清部分用50％饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33％饱和硫酸铵溶液沉淀两次，沉淀物用尽可能少的磷酸缓冲液溶解，经透析后用SephadexG-25M层析，即得多克隆抗体。\n[0035] 实施例2免疫检测方法的建立\n[0036] 2.1ELISA方阵法确定最佳反应浓度\n[0037] 将1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml系列浓度的三聚氰胺抗体按每孔100μl包被酶标板，4℃包被过夜，洗涤3次，拍干，按每孔200μl封闭液4℃下封闭过夜，洗涤3次，拍干。加入从1∶200开始倍比稀释的酶标三聚氰胺，室温作用30分钟，洗涤三次，加50μl底物A液和50μ1底物B液，室温避光作用15min，50μl终止液终止反应，酶标仪检测A值(450nm)。同时设置两个平行，取OD值为1.0左右时的包被浓度为最佳浓度。试验数据列于表1。\n[0038] 表1方阵法OD值\n[0039] \n[0040] 由表1的数据中可以确定，最佳抗体包被浓度为5μg/ml。酶标抗原稀释倍数\n1∶800达到最佳反应浓度。\n[0041] 2.2ELISA检测抗体抗体IC50值\n[0042] ELISA操作方法同2.1，最佳抗体包被浓度为5μg/ml，酶标抗原稀释倍数\n1∶800，准备0μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L系列浓度的游离三聚氰胺标准品。每孔加入50μ1标准品，随后加入50μl酶标抗原稀释液，室温反应30分钟，洗板3次，加显色剂温育15分钟，终止反应，酶标仪读数。检测结果的数据见下表2[0043] 表2抗血清IC50值\n[0044] \n 三聚氰胺的抑 0 1 5 10 50 100\n 制浓度(ng/ml)\n OD值 1.541 1.353 1.026 0.736 0.423 0.154\n[0045] 由表2中数据可知，三聚氰胺抗血清IC50值在10ng/ml左右，表明本发明制备的抗血清是具有较好的特异性的抗三聚氰胺多克隆抗体，能满足三聚氰胺检测要求。\n[0046] 实施例3检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒的组建[0047] 组建检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：\n[0048] (1)包被三聚氰胺抗体的酶标板；\n[0049] (2)浓度为1mg/L的酶标记三聚氰胺；\n[0050] (3)三聚氰胺标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、\n50μg/L、100μg/L；\n[0051] (4)底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液为四甲基联苯胺；\n[0052] (6)洗涤液为含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液；\n[0053] (7)浓缩样品稀释液为0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液；\n[0054] (8)酶标记三聚氰胺稀释液为含0.01％吐温-20的磷酸盐缓冲液；\n[0055] (9)终止液为2mol/L的盐酸溶液。\n[0056] 实施例4样品中三聚氰胺残留的检测\n[0057] 4.1样品前处理\n[0058] 准确称取5g饲料于40ml离心管中。加入20mlDMSO振荡1小时，离心取上清，用样品样品稀释液稀释，制备样品溶液。\n[0059] 4.2用试剂盒进行检测\n[0060] 向三聚氰胺抗体包被的酶标板微孔中加系列标准品或样品溶液50μ1，再加入酶标三聚氰胺工作液50μl，室温反应30分钟。倒出孔中液体，每孔加入250μl经10倍稀释了的洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板3次，用吸水纸拍干。每孔加入底物显色液A液(过氧化脲)50μl，再加B液(四甲基联苯胺)50μl，轻轻振荡混匀，室温避光显色15min，每孔加入终止液(2mol/L盐酸)50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)。\n[0061] 4.3结果分析：\n[0062] 计算百分吸光度值并绘制标准曲线，相对应每一个样品中三聚氰胺的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程法计算出在样本中三聚氰胺的含量。利用专业电脑软件更便于大量的样本的快速分析。根据酶标板上的样本颜色的深浅与系列浓度标准溶液颜色的比较，可以判断出样本中三聚氰胺的浓度范围。\n[0063] 实验例1试剂盒精密度试验\n[0064] 本实验例为标准可重复性试验。具体操作为：\n[0065] 从每批实施例2或3中的方法制备的酶标板中，各抽取10个孔，测定5μg/L的标准溶液的吸光度值(OD)，重复3次，计算变异系数CV％。\n[0066] 结果表明变异系数范围在4.8-7.6％之间，符合了变异系数小于10％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了要求。\n[0067] 实验例2试剂盒的回收率试验\n[0068] 取两个浓度的三聚氰胺标样，对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率。结果表明饲料中的添加回收率为75％-105％。\n[0069] 实验例3试剂盒保存期试验\n[0070] 试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零添加)、\n50％抑制浓度、三聚氰胺添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置两周，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在\n2-8℃保存12个月以上。