一种改良植物果实支链淀粉品质的基因及其编码产物与应用

1.一种香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种权利要求1所述的香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种表达载体，其特征在于，其包含原始载体和权利要求1所述的香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述原始载体为pCAMBIA-1302载体质粒，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列位于pCAMBIA-1302载体质粒的Nco I和Spe I两限制性内切酶位点之间。
5.如权利要求1所述的香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1、或者权利要求3或4所述的表达载体在改良番茄果实支链淀粉品质中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1、或者权利要求3或4所述的表达载体改变果实淀粉颗粒形态，提高了MaSSIII-1表达量、SS酶活性和支链淀粉含量。
7.一种在番茄中过表达可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1的应用方法，其特征在于，用权利要求3或4所述的表达载体重组质粒转化番茄叶盘。
8.一种用于扩增如权利要求1所述的香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

一种改良植物果实支链淀粉品质的基因及其编码产物与应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种基因及其应用，同时也涉及到该基因编码蛋白质，尤其涉及一种改良植物果实支链淀粉品质的基因及其编码产物与应用。\n背景技术\n[0002] 香蕉果实淀粉代谢直接影响我国和世界香蕉产量和品质，其关键酶基因的研究是提高产量、改善品质、满足淀粉品质多样化需求的基础。可溶性淀粉合成酶(Soluble starch synthase，SS)主要参与支链淀粉的代谢。它通过α-1,4-D-糖苷键将ADPG中的葡萄糖残基加到侧链的非还原端，并且它的活性与支链淀粉的积累呈显著正相关。至今为止，人们已经报道了4种SS同工酶，分别是SSI、SSII、SSIII和SSIV(Ball and Morell，2003)，SSI是延长较短的支链，SSII和SSIII则是分别延长中间长度和较长的支链(Ball and Morell，\n2003)，SSIV可能是参与淀粉颗粒形成的起始阶段，生成较短的葡聚糖链(Roldán et al.，\n2007)。抑制SSIII-1表达，导致长链支链淀粉含量下降，并影响了支/直链淀粉比例，在maize，拟南芥(Zhang et al.，2005)，水稻(Dian et al.，2005)、玉米(Zhu et al.，2014)及马铃薯(杜宏辉,2011)中均有相关报道。\n[0003] 尽管在很多植物中都对SS进行了研究，然而在鲜食淀粉转化型果实，如：香蕉、猕猴桃、芒果等，却未见相关报道。因此，开展香蕉MaSSIII-1基因的相关研究对调控支链淀粉含量或提高作物产量、改善淀粉品质、培育优质香蕉新品种具有重要意义。\n发明内容\n[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种从巴西香蕉获得的一种改良植物果实支链淀粉品质的基因，以及该基因编码产物与应用。\n[0005] 本发明的第一个方面是提供一种香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。\n[0006] 本发明的第二个方面是提供一种本发明第一个方面所述的香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。\n[0007] 本发明的第三个方面是提供一种表达载体，其包含原始载体和本发明第一个方面所述的香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1。\n[0008] 其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pCAMBIA-1302载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。\n[0009] 优选地，所述原始载体为pCAMBIA-1302载体质粒，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列位于pCAMBIA-1302载体质粒的Nco I和Spe I两限制性内切酶位点之间。\n[0010] 本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1、或者本发明第三个方面所述的表达载体在改良植物果实支链淀粉品质中的应用。\n[0011] 其中，本发明第一个方面所述的香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1、或者本发明第三个方面所述的表达载体体改变果实淀粉颗粒形态，提高了MaSSIII-1表达量、SS酶活性和支链淀粉含量。\n[0012] 本发明的第五个方面是提供一种在番茄中过表达可溶性淀粉合成酶基因\nMaSSIII-1的应用方法，用本发明第三个方面所述的表达载体重组质粒转化番茄叶盘。\n[0013] 本发明的第六个方面是提供一种用于扩增可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。\n[0014] 本发明的基因MaSSIII-1能够改善果实支链淀粉品质，提高果实质量和品质。例如将其导入番茄中，获得35S启动子驱动的MaSSIII-1转基因番茄2个独立株系，过量表达MaSSIII-1改变了淀粉颗粒形态(淀粉颗粒表面出现明显的十字裂痕)，提高了MaSSIII-1表达量、SS酶活性和支链淀粉含量。\n附图说明\n[0015] 图1为MaSSIII-1基因扩增电泳结果图，其中，M1：DL2000 DNA Marker；泳道1：\nMaSSIII-1基因PCR产物。\n[0016] 图2为pCAMBIA-MaSSIII-1双酶切验证电泳结果图，其中，M1：DL2000 DNA Marker，泳道2：为pCAMBIA-MaSSIII-1重组质粒双酶切结果。\n[0017] 图3为MaSSIII-1转基因番茄的Southern blot分析(A)以及果实形状(B)、淀粉颗粒(C)、基因表达(D)、总淀粉含量(E)、支链淀粉含量(F)和SS酶活性(G)的变化。其中，WT：野生型；L4、L11：MaSSIII-1转基因植株；IG：幼果期；MG：绿果期；BR：转色期；RR：红熟期；＊代表MaSSIII-1转基因植株与野生型的数值达到了差异显著水平(＊p<0.05；＊＊p<0.01)；Scale bar＝15μm。\n具体实施方式\n[0018] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。\n[0019] 一、基因获得\n[0020] 以巴西蕉果实cDNA为模板，以\n[0021] 5’-CCCATGGGATGTTCCGTGTTTCA-3’\n[0022] 5’-GACTAGTCTTATGATACGTGCCTG-3’\n[0023] 为引物，通过PCR方法扩增获得的一种含有碱基序列为2397bp(图1)，其序列如SEQ ID No.1所示；编码MaSSIII-1基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。\n[0024] 二、表达载体构建\n[0025] 将上述香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1的核苷酸序列，利用Nco I和Spe I两种限制性内切酶分别对目的片段及pCAMBIA-1302载体质粒双酶切，将酶切后的目的片段与植物表达载体pCAMBIA-1302片段进行回收、连接、转化及测序验证正确，即得香蕉果实可溶性淀粉合成酶基因MaSSIII-1的表达载体(图2)。\n[0026] 三、表达载体转化至番茄叶盘\n[0027] 用上述的表达载体重组质粒通过农杆菌转化至番茄叶盘。农杆菌叶盘转化法具体实验步骤如下：\n[0028] (1)pCAMBIA-1302-MaSSIII-1载体的农杆菌转化：\n[0029] 取200μL冰浴上融化的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，加入pCAMBIA-1302-MaSSIII-1重组质粒2μg，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；转入液氮中冷冻3min，迅速置37℃水浴中温育5min；加入800μL YEP液体培养基，28℃，250rpm预培养4～5h；吸取300μL菌液至含有50mg/L Rif的YEP固体选择培养基上，均匀涂布于整个平板；将平板置于28℃至液体被吸收，倒置平板，28℃培养2～3天，挑选单菌落，验证检测，将转化正确的农杆菌菌液用于下一步实验。\n[0030] (2)根癌农杆菌介导番茄遗传转化：\n[0031] 在超净工作台上将番茄种子浸泡于5mL 75％乙醇的无菌离心管中1min，浸泡期间充分晃动，然后用无菌水冲洗三次；20％次氯酸钠溶液浸泡15min，浸泡期间充分晃动，用无菌水冲洗三次；将番茄种子置于无菌滤纸上，晾干水分，播种于MS固体培养基中，于25℃，黑暗条件下培养4～5天；当种子开始萌发后，将其转移到25℃，1800Lux光照强度，16h光照，8h黑暗条件下培养；待其长出两片子叶时，用无菌刀片切取约0.5×0.5cm2大小的叶片置于番茄分化培养基(MS固体培养基+2.0mg/L 6-BA/ZT+0.2mg/L IAA)上，25℃黑暗条件下培养2天左右，待叶片切口出刚刚开始膨大时即可；将已经转化pCAMBIA-1302-MaSSIII-1重组载体的根癌农杆菌LBA4404菌液取20μL到10mL含有50mg/L kan和50mg/L Rif的YEP液体培养基中过夜活化培养；吸取活化培养的菌液1mL到新的50mL含有50mg/L kan和50mg/L Rif的YEP液体培养基中培养至OD600到0.5左右；将所需浓度的菌液于超净工作台上转移到50mL无菌离心管中，4℃，6000rpm离心5min，弃去上清液，加入等体积(离心前菌液体积)的MS液体培养基将菌体重新悬浮；将菌液转移到100mL无菌三角瓶中，加入0.1％体积(重悬菌液体积)的乙酰丁香酮(AS)，充分混匀，然后将已预培养的叶片外植体转移至农杆菌菌液中浸泡\n15min，期间摇动菌液使外植体于菌液充分接触；将外植体取出置于无菌滤纸上，吸干外植体表面多余的菌液，然后将其转移到含有乙酰丁香酮的MS分化培养基上，25℃黑暗培养2天；将共培养的叶盘转移到含有200mg/L特美汀的MS分化培养基上，于25℃，2000Lux光照强度，16h光照，8h黑暗条件下培养一周时间；叶盘转移到含有200mg/L特美汀和15mg/L潮霉素的MS分化培养基上，于25℃，2000Lux光照强度，16h光照，8h黑暗条件下培养。每两周继代培养一次。待叶盘愈伤组织长出不定芽到2cm左右时，切取并于含有200mg/L特美汀和20mg/L潮霉素的MS生根培养基(MS固体培养基+0.2mg/L IAA)上，于25℃，2000Lux光照强度，16h光照，8h黑暗条件下培养。培养两周待其分化出根之后，选择能够正常生长的番茄幼苗进行炼苗适应培养，然后将其移栽种植。\n[0032] 四、转化株系的检测\n[0033] (1)番茄基因组DNA提取及阳性转化植株检测\n[0034] 使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，天根生化科技(北京)有限公司)提取转化番茄基因组DNA，其具体实验方法见说明书。\n[0035] (2)转化番茄株系Southern blot鉴定\n[0036] 为进一步检测外源基因MaSSIII-1在番茄基因组中的整合，以转化番茄植株为材料，以非转化WT野生型番茄植株为阴性对照，以转化使用的菌株质粒为阳性对照及探针制备，对转化番茄株系进行Southern blot鉴定，其具体实验方法步骤如下：\n[0037] a、探针标记\n[0038] 在0.2mL PCR管中加入下列试剂：\n[0039]\n[0040] 轻弹混匀，瞬时离心，然后按下列程序进行PCR扩增：\n[0041]\n[0042] 终止：将完成标记的反应物煮沸5min，立即放入冰浴中，冷藏(-20℃)或直接用于杂交。\n[0043] b、基因组DNA酶切\n[0044] 在灭菌的0.5mL离心管中，按照下表准备酶切反应体系：\n[0045]\n[0046] 37℃保温2h。\n[0047] 加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇。\n[0048] 室温沉淀20min。\n[0049] 12000rpm离心10min。\n[0050] 室温干燥。\n[0051] 加入10μL TE溶解。\n[0052] c、酶切产物琼脂糖凝胶电泳\n[0053] 将50×TAE稀释50倍，即为1×TAE。配置20mL 0.7％琼脂糖凝胶：称取0.14g琼脂糖于锥形瓶中，加入20mL 1×TAE，加热至琼脂糖溶化，待胶冷却至60℃左右，加入1μL GoldViewTM混匀，制胶。加样：将酶切产物加入1μL 10×上样缓冲液和含检测目的基因的重组质粒4μL加入0.5μL 10×上样缓冲液混匀后分别上样。电泳：恒压50V电泳。当溴酚蓝染料移动到凝胶前沿时，停止电泳。凝胶成像系统观察和记录电泳结果。\n[0054] d、转膜\n[0055] 用刀片切掉未用过的凝胶区域，并将凝胶切掉一个角(对点样顺序做个标记)，然后转至玻璃平皿中。\n[0056] 在室温下将凝胶浸泡在变性溶液中15min(目的是使DNA双链变性成单链)，并轻轻摇动。更换变性液继续浸泡凝胶20min，并轻轻摇动使DNA充分变性。\n[0057] 将带正电荷的尼龙膜裁成比凝胶大1mm大小，并在相应位置上剪掉一个角，再切6张与尼龙膜一样大小的滤纸，然后用蒸馏水浸湿，再放入碱性转移缓冲液中浸泡约30min。\n[0058] 将尼龙膜放在3张潮湿的滤纸上，凝胶放在尼龙膜上(二者切去的一角对其)，立即将3张潮湿的滤纸放在凝胶上(做成夹心饼式的结构，千万不要有气泡)。\n[0059] 预先裁纸一叠同样大小的纸巾，纸巾大小略比尼龙膜小1mm。在玻璃板上先放上约\n15～20cm高的纸巾，并在其上放上10层同样大小的干滤纸，然后将夹在一起的“滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸”放到其上，最后在其上放一层浸湿转移缓冲液的滤纸(滤纸的两端浸入转移缓冲液中)，盖上盖子，让凝胶上的DNA下行转移16h或过夜。\n[0060] 将尼龙膜与凝胶剥离，将膜浸在中和缓冲液中，室温10min，更换一次中和缓冲液继续室温浸泡10min，并轻轻摇动。\n[0061] e、Southern杂交\n[0062] 预杂交：将尼龙膜塞入杂交管中，按每平方厘米0.2mL加入预杂交液。将杂交管放在68℃的杂交箱中预杂交5～6h(预杂交的目的是将背景中未结合DNA的部位和非特异性序列封闭，从而使背景更清晰)。\n[0063] 探针变性：完成标记后，将探针100℃加热5min变性，迅速将探针放入冰水浴中冷却。\n[0064] 杂交：迅速将装有膜的杂交管取出，将预杂交液倒出；将变性的探针加到适量的新鲜预杂交液中混匀，并将杂交液转入杂交管中。将杂交管再放到62℃的杂交箱中杂交16h或过夜(变性探针与膜上的特异性序列杂交)。\n[0065] 洗膜(洗膜目的是将滤膜上未与DNA杂交的及非特异杂交的探针分子从滤膜上洗去)：\n[0066] 一洗：2×SSC+0.1％SDS 10min×2，室温慢摇\n[0067] 二洗：1×SSC+0.1％SDS 10min×2，室温慢摇\n[0068] 三洗：0.5×SSC+0.1％SDS 15min×2，65～68℃慢摇\n[0069] f、Southern检测\n[0070] 将膜放入洗涤液中，在15～25℃震荡1～5min。\n[0071] 将膜放入封闭液中，保温30min。\n[0072] 将膜放到抗体溶液(用封闭液1:5000稀释DIG-Ab-Ap)中，保温30min。\n[0073] 用洗涤液洗涤膜二次，每次15min。\n[0074] 将膜放入检测缓冲液中，平衡2～5min。\n[0075] 将膜放到2mL新鲜准备的有色底物溶液(2mL检测缓冲液+40μL NBT/BCIP)中，避光使可见的有色斑点产生。\n[0076] 终止反应：待颜色达到所需的程度时，用无菌水或TE浸泡5min即可终止反应。\n[0077] 结果如图3所示，野生型WT没有条带，而转MaSSIII-1基因株系L4和L11能够清楚地分辨出单一条带，证明MaSSIII-1基因已成功转化至番茄基因组，且L4和L11株系的拷贝数为单拷贝。\n[0078] (3)不同发育时期番茄果实淀粉颗粒形态观察\n[0079] 为对不同发育时期的番茄果实淀粉颗粒数量及形态进行观察，将不同发育时期的番茄果实于冷冻干燥机中冷冻干燥，然后于扫描电子显微镜下对其淀粉颗粒进行观察，具体实验步骤参考电子扫描显微镜(Phenom Pro，USA)操作说明。\n[0080] 结果如图3所示，野生型番茄淀粉颗粒呈圆球形，与野生型番茄淀粉颗粒形态相比较，转MaSSIII-1基因株系L4和L11淀粉颗粒表面均出现明显的十字裂痕，MaSSIII-1过表达导致了淀粉颗粒形态发生了明显改变。\n[0081] (4)MaSSIII-1基因在番茄中的表达分析\n[0082] 以MaSSIII-1转基因株系和野生型幼果期、绿熟期、转色期和红熟期不同发育阶段(Alba et al.，2005)的果实cDNA为模板，对MaSSIII-1基因在番茄不同发育阶段中的表达进行分析，其反应体系及具体实验方法如下：\n[0083] 在200μL的PCR管中加入以下个组分，其反应体系如下：\n[0084]\n[0085]\n[0086] 吸打混匀，瞬时离心数秒，然后于实时荧光定量PCR仪(Mx3000P，Stratagene)中以MaActin为内参基因进行扩增检测，每个样品重复三次，扩增反应运行程序如下：\n[0087]\n[0088] 结果如图3所示，与野生型相比较，转基因株系L4和L11在幼果期、绿熟期、转色期和红熟期MaSSIII-1基因的相对表达量分别增加了约120～200倍、50～120倍、300～500倍和200～250倍。\n[0089] (5)不同发育阶段番茄果实SS酶活性测定\n[0090] 以MaSSIII-1转基因番茄和野生型不同发育阶段的果实为材料，每个样品三次重复，其具体实验方法步骤如下：\n[0091] 粗酶液提取\n[0092] 取0.5g材料，加入5ml提取液(含100mmol·L-1Tricine-NaOH，PH7.5，8mmol·L-\n1MgCl2，2mmol·L-1EDTA，12.5％(V/V)Glycerol；1％(W/V)PVP-40，50mmol·L-1 2-Mercaptoethanol)，磨成匀浆，在10000x g离心25min，然后收集上清液，用于测定SS活性。\n[0093] SS活性测定\n[0094] 在180μl的混合液[包括50mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.4)，1.6mmol·L-1ADPG，0.7g支链淀粉，15mmol·L-1DTT]中，加入100μl粗酶液，30℃下反应10min，沸水中终止反应，冰浴-1 -1\n中冷却，混合物中加100μl的反应液，包括50mmol·L Hepes-NaOH(pH7.4)，4mmol·L PEP，\n200mmol·L-1KCl，10mmol·L-1MgCl2，1.2U的丙酮酸激酶，沸水浴中加热30s终止反应，\n10000r/min离心5min。\n[0095] 取上清液350μl，加入反应液300μl[50mmol·L-1Hepes-NaOH(pH7.4)，10mmol·L-1-1\n葡萄糖，20mmol·L-1MgCl2，2mmol·L NADP，1.4U己糖激酶，0.35UG6P脱氢酶]30℃下反应\n10min后，加入缓冲液2ml，测定340nm OD值。以每1min增加0.01OD值为1个酶活性单位。结果如图3所示，与野生型相比较，转基因株系L4和L11在幼果期、绿熟期、转色期和红熟期SS酶活性分别增加了约1.0～1.7U·min-1、0.4～1.2U·min-1、0.2～1.1U·min-1和0.2～1.1U·-1\nmin 。\n[0096] (6)淀粉含量测定\n[0097] 以MaSSIII-1转基因番茄和野生型不同发育阶段的果实为材料，于鼓风干燥箱中\n40℃烘干至恒重，充分碾磨成粉末状，用以总淀粉和支链淀粉含量的测定，每个样品三次重复，其具体实验方法步骤如下：\n[0098] 总淀粉含量测定\n[0099] ①称取烘干且碾磨成粉末状的样品0.1g装于15mL离心管中，每个样品三次重复。\n[0100] ②加入5mL 80％乙醇，充分震荡混匀，4000rpm离心5min，弃去上清液，然后向沉淀中加入5mL去离子水重新悬浮洗涤。\n[0101] ③4000rpm离心5min，弃去上清液，然后向沉淀中加入5mL 80％Ca(NO3)2溶液重新悬浮。\n[0102] ④将离心管沸水浴中提取10min，冷却后4000rpm离心10min，吸取上清液转移到\n25mL容量瓶中，其沉淀再用80％Ca(NO3)2溶液重新悬浮提取二次，离心后取上清合并于25mL容量瓶中。\n[0103] ⑤用80％Ca(NO3)2溶液定容25mL，充分混匀。吸取所提取的淀粉溶液1mL，用80％Ca(NO3)2溶液补充至2mL，加入100μL 0.01N的I2-KI溶液，混匀后于620nm波长下测定吸光值，将OD620代入总淀粉标准曲线(见附录)求出测定样品中总淀粉的含量。结果如图3所示，与野生型相比较，转基因株系L4和L11在幼果期、绿熟期、转色期和红熟期总淀粉含量分别增加了约11.5～15.1mg·g-1、13.4～15.8mg·g-1、8.7～9.1mg·g-1和5.9～6.2mg·g-1。\n[0104] 支链淀粉含量测定\n[0105] 称取烘干且碾磨成粉末状的样品0.1g装于50mL离心管中，加入1mL 95％乙醇和\n9mL 1mol/L NaOH，40℃放置24h，每个样品三次重复。\n[0106] 将溶液转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，充分颠倒混匀。\n[0107] 吸取5mL定容后的溶液，转移到新的100mL容量瓶中，加入1mL 1mol/L醋酸和2mL I2-KI溶液，然后用蒸馏水定容至100mL，充分颠倒混匀。\n[0108] 30℃恒温静置30min，于620nm波长下测定吸收值，将OD620代入直链淀粉标准曲线求出测定样品中直链淀粉的含量。支链淀粉的含量就等于总淀粉的含量减去直链淀粉的含量。\n[0109] 结果如图3所示，与野生型相比较，转基因株系L4和L11在幼果期、绿熟期、转色期和红熟期支链淀粉含量分别增加了约0.4～5.9mg·g-1、1.0～3.9mg·g-1、4.3～6.8mg·g-1和3.1～7.0mg·g-1。\n[0110] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。