猴头菌抑制幽门螺杆菌的生物小分子及其在治疗消化道疾病中的应用

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猴头菌抑制幽门螺杆菌的生物小分子及其在治疗消化道疾\n病中的应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物医药领域。具体而言，本发明涉及抑制幽门螺杆菌的生物小分子及其应用。\n背景技术\n[0002] 自1982年Marshall和Warren从胃炎患者中分离出幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)之后，现已确认幽门螺杆菌是慢性活动性胃炎的病原菌，是消化性溃疡的重要致病因子，幽门螺杆菌持续感染可导致慢性萎缩性胃炎发生；幽门螺杆菌也与消化道恶性肿瘤发病密切相关。例如，与未感染人群相比，感染人群胃癌发生的风险提高2-6倍(CDC，\n1998)，幽门螺杆菌根除可以显著地降低胃癌的发生，世界卫生组织已把Hp列为与胃癌有关的病原菌，已明确指出Hp为第一类致癌因子。此外，幽门螺杆菌与许多胃外疾病可能有密切关系(陈颖，2009，H pylori感染与胃外疾病的研究进展，世界华人消化杂志2009年\n10月18日；17(29)：3008-3013)。临床上，应用单一抗生素很难根除Hp的感染，因此采用了不同的药物组合，比如以铋剂为基础的二联和三联疗法。虽然这种组合疗法的效果明显，但其应用仍然遇到了一些困难，主要表现为服药时间长，副作用大；耐药性增加；肠道内有益菌的数量和种类减少，菌群失衡。因此，寻找治疗简单、安全无副作用、治愈率高的药物是医药研究者孜孜以求的目标。\n[0003] 猴头菌(Hericium erinaceum)应用于胃肠疾病治疗具有鲜明的中国特色，在临床上广泛用来治疗慢性胃炎、胃十二指肠溃疡等疾病，积累了大量的临床经验和数据。上世纪60年代，上海市农科院食用菌所在我国首先驯化猴头菇人工栽培成功(陈国良，1979)。\n70年代从民间了解到猴头菇有补胃功能，开始制作猴头糖浆对十二指肠溃疡患者作疗效试验，获得良好的治疗效果。在此基础上，食用菌所、上海中药制药三厂、上海医药工业研究院、南市斜桥地段医院、徐汇区中心医院及中国科学院药物研究所等单位协作，用甘蔗渣加米糠为培养料培养猴头菇菌丝体，用猴头菇菌丝体水提物制成浸膏与药片，进行了较系统的毒性、药理、疗效研究。1977年通过鉴定，同年上海市卫生局批准上海中药制药三厂投产，产品定名为“猴头菇菌片”，成为上海及国内治疗消化道溃疡、炎症的主要药物之一(上海市农科院园艺所，1977；陈国良，1978；上海市猴菇菌片协作组，1978)。目前我国有超过100多个以猴头菌为主要原料的准号药用于胃肠疾病治疗。\n[0004] 长期大量的临床实践表明，中药猴头菌片单独或辅助其它化学药，对慢性胃炎(潘超雄，2004；王立军，2009)、消化不良(乜之英，2008；夏立营，2008；)、溃疡性结肠炎(李桂珍，2007；周中银，2007)、治疗及预防胃、十二指肠溃疡复发(张敏，2004；江必武，\n2007)、上消化道恶性肿瘤(中国医药工业杂志，1978)等多种消化系统疾病有确切良好的疗效，极少发现不良反应。\n[0005] 在猴头菌——慢性胃炎和消化性溃疡——幽门螺杆菌三者中，已经基本建立了其中的两个关系，但对猴头菌——幽门螺杆菌之间的关系尚不清楚。猴头菌除了通过保胃、养胃发挥作用外，对幽门螺杆菌有没有直接的作用目前还是未知的。\n发明内容\n[0006] 本发明第一方面提供下式I和II化合物或其药学上可接受的盐：\n[0007] \n[0008] 本发明第二方面提供上述式I和/或II和/或其药学上可接受的盐在制备治疗和预防幽门螺杆菌引起的疾病中的用途。\n[0009] 本发明第三方面提供一种药物组合物，该组合物含有治疗有效量的式I化合物和/或式II化合物和/或其药学上可接受的盐。\n[0010] 本发明第四方面提供一种猴头菌培养物的醇提取物。\n[0011] 本发明第五方面提供一种本发明猴头菌培养物的醇提取物在制备治疗和预防幽门螺杆菌引起的疾病中的用途。\n[0012] 本发明第六方面提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的猴头菌培养物的醇提取物。\n[0013] 本发明第七方面提供一种食品添加剂，所述食品添加剂含有本发明式I、式II或其组合，或含有本发明的猴头菌培养物的醇提取物。在一具体实施例中，本发明的食品添加剂还含有香菇、巴西蘑菇、杏鲍菇、茶树菇、平菇、灰树花、鸡腿菇、桑黄和/或虫草的醇提取物(例如，乙醇提取物)。\n[0014] 本发明第八方面提供一种食品，所述食品含有本发明式I、式II或其组合，或含有本发明的猴头菌培养物醇提取物，或含有本发明的食品添加剂。在一具体实施例中，本发明的食品还含有香菇、巴西蘑菇、杏鲍菇、茶树菇、平菇、灰树花、鸡腿菇、桑黄和/或虫草的醇提取物(例如，乙醇提取物)。\n附图说明\n[0015] 图1显示不同生长时间的猴头菌菌牒对HP的抑制。\n[0016] 图2显示猴头菌发酵液对HP的抑制。\n[0017] 图3显示猴头菌发酵液正丁醇萃取物Zac对HP的抑菌圈(每孔加样160μl，样液浓度)。\n具体实施方式\n[0018] 本发明也包括所述式I和II化合物的药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”可由药学上可接受的无毒性的酸和碱包括无机和有机酸和碱来制备盐。酸包括：醋酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯磺酸、二氯醋酸、反丁烯二酸、葡糖酸、谷氨酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、巴莫酸、泛酸、膦酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、草酸、对甲苯磺酸等。尤其优选盐酸、氢溴酸、膦酸、硫酸和甲磺酸。可接受的碱盐包括碱金属(如钠、钾)、碱土金属(如钙、镁)和铝盐。\n[0019] 本发明的醇提取物通过使用醇提取猴头菌培养物而获得。本发明的猴头菌培养物包括猴头菇子实体、猴头菌固体发酵物和猴头菇液体发酵物。因此，本发明的猴头菌培养物的醇提取物包括猴头菇子实体、猴头菌固体发酵物或猴头菌液体发酵物的醇提取物。\n[0020] 本发明的醇提取物经醇提取猴头菌培养物、合并醇提液、回收溶剂至无醇味后获得。用于本发明进行提取的醇为乙醇、丙醇或丁醇，或其混合物。\n[0021] 在一具体实施例中，本发明的醇提取物为油状物，经静置醇提物后取油相而获得。\n[0022] 在一具体实施例中，本发明的醇提取物是醇提取后使用乙酸乙酯进行萃取、静置后获得的水相。\n[0023] 在一具体实施例中，所述醇提取物采用大孔树脂吸附、乙醇洗脱获得。因此，优选地，本发明的醇提取物是大孔树脂醇洗脱物。\n[0024] 优选地，猴头菌培养物是猴头菇子实体。\n[0025] 在一具体实施例中，醇提物含有本发明式I化合物、式II化合物或其组合。\n[0026] 本发明的药物组合物可含有治疗有效量的本发明式I和/或II化合物和/或其药学上可接受的盐，和/或含有治疗有效量的本发明的猴头菌培养物的醇提取物，和/或含有治疗或预防有效量的本发明猴头菌培养物醇提取物的乙酸乙酯萃取物，和/或含有治疗有效量的本发明香菇、巴西蘑菇、杏鲍菇、茶树菇、平菇、灰树花、鸡腿菇、桑黄和/或虫草的醇提取物(例如，乙醇提取物)。\n[0027] “治疗或预防有效量”指当给予需要该治疗的哺乳动物，例如人时，该药物的量足以治疗和预防幽门螺杆菌引起的疾病。\n[0028] 除上述活性成分以外，本发明的药物组合物还可含有药学上可接受的载体或赋形剂(包括辅料和助剂)。同样地，除上述活性成分以外，本发明的食品添加剂还可以含有可食用的其它食品添加剂。例如，可将上述活性成分与常见的食品添加剂，例如食盐、味精、糖等，混合。\n[0029] 优选的载体或赋形剂是活性成分能溶解在其中的那些载体。本发明的药物组合物也可包括乳化剂，稳定剂，保湿剂和抗氧化剂，以及如果需要的话，給予颜色或香味的试剂。\n[0030] 虽然每个人的需求各不相同，本领域技术人员可确定本发明药物组合物中每种活性成分的最佳剂量。一般情况下，本发明的化合物或其药学上可接受的盐，对哺乳动物每天口服给药，药量按照约0.0025到50毫克/公斤体重。但最好是每公斤口服给药约0.01到\n10毫克。例如，单位口服剂量可以包括约0.01到50毫克，最好是约0.1到10毫克的本发明化合物。单位剂量可给予一次或多次，每天为一片或多片，每片含有约0.1到50毫克，合宜地约0.25到10毫克的本发明化合物或其溶剂化物。\n[0031] 本发明的药物组合物可被配制成适合各种给药途径的制剂形式，包括但不限于被配制成用于肠外，皮下，静脉，肌肉，腹腔内，透皮，口腔，鞘内，颅内，鼻腔或外用途径给药的形式，用于治疗肿瘤和其他疾病。给药量是有效地改善或消除一个或多个病症的药量。对于特定疾病的治疗，有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病有关的症状的药量。这样的药量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案给药。给药量也许可治愈疾病，但是给药通常是为了改善疾病的症状。一般需要反复给药来实现所需的症状改善。药的剂量将根据病人的年龄，健康与体重，并行治疗的种类，治疗的频率，以及所需治疗效益来决定。\n[0032] 本发明的药物组合物可以给予任何哺乳动物，只要他们能获得本发明化合物的治疗效果。在这些哺乳动物中最为重要的是人类。\n[0033] 本发明的药物组合物可用已知的方式制造。例如，由传统的混合，制粒，制锭，溶解，或冷冻干燥过程制造。制造口服制剂时，可结合固体辅料和活性化合物，选择性研磨混合物。如果需要或必要时加入适量助剂后，加工颗粒混合物，获得片剂或锭剂芯。\n[0034] 合适的辅料特别是填料，例如糖类如乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇；纤维素制剂或钙磷酸盐，例如磷酸三钙或磷酸氢钙；以及粘结剂，例如淀粉糊，包括玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可增加崩解剂，比如上面提到的淀粉，以及羧甲基淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，或褐藻酸或其盐，如海藻酸钠；辅助剂特别是流动调节剂和润滑剂，例如，硅石，滑石，硬脂酸盐类，如镁硬脂酸钙，硬脂酸或聚乙二醇。如果需要，可以給锭剂核芯提供可以抵抗胃液的合适包衣。为此，可以应用浓缩糖类溶液。这个溶液可以含有阿拉伯树胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了制备耐胃液的包衣，可使用适当的纤维素溶液，例如醋酸纤维素邻苯二甲酸或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸。可向药片或锭剂核芯的包衣加入染料或色素。例如，用于识别或为了表征活性成分剂量的组合。\n[0035] 如前文所述，本发明的式I、II化合物或其药学上可接受的盐、醇提取物、药物组合物可用于治疗或预防幽门螺杆菌引起的各种疾病，包括各种消化系统疾病，尤其是胃炎、消化道溃疡、消化不良、溃疡性结肠炎或消化道恶性肿瘤等。胃炎可以为慢性胃炎；慢性胃炎可以为慢性活动性胃炎或慢性萎缩性胃炎；消化道溃疡可以为胃溃疡或十二指肠溃疡；\n消化道恶性肿瘤可以为胃癌。\n[0036] 可采用本领域周知的各种给药方法给予本发明的化合物、提取物或其药物组合物或药物制剂，并可根据患者的实际情况加以确定。这些方法包括但不限于肠外，皮下，静脉，肌肉，腹腔内，透皮，口腔，鞘内，颅内，鼻腔或外用途径给药。\n[0037] 因此，本发明也涉及式I和/或II化合物和/或其药学上可接受的盐、醇提取物、药物组合物等在制备治疗或预防上述幽门螺杆菌引起的疾病的药物中的用途。\n[0038] 本发明也涉及香菇、巴西蘑菇、杏鲍菇、茶树菇、平菇、灰树花、鸡腿菇、桑黄和虫草的醇提取物(例如，乙醇提取物)，以及这些醇提取物在制备用于治疗和预防本文所述的幽门螺杆菌引起的疾病中的用途。本发明也涉及含有香菇、巴西蘑菇、杏鲍菇、茶树菇、平菇、灰树花、鸡腿菇、桑黄和/或虫草的醇提取物(尤其是乙醇提取物)的药物组合物、食品和食品添加剂。\n[0039] 本发明也包括上述化合物和提取物在制备用于抑制幽门螺杆菌的产品(例如药物组合物、食品添加剂、食品)中的用途。\n[0040] 下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，本发明并不限于这些具体实施例，它们仅仅是阐述性的。实施例中所使用到的试剂及其用量以及反应条件，如果没有特别说明，均为本领域常规的试剂和用量。\n[0041] 1.材料与方法\n[0042] 1.1试验菌株\n[0043] H.pylori ATCC43504、H.pylori SS1由上海二医大提供；E.coli CMCC44103、S.aureus CMCC 26003由上海交通大学提供；E.coli ATCC 25922由上海园林科学研究所提供。上述菌株都可从保藏单位获得。\n[0044] H.erinaceum 0608、0605、0605M、0602、0607、0619、0606、0629、0621、0617、0610、\n0609、0620、0613、0618、0627抑、0622、0616、0604由上海市农业科学院提供；shenggong、sanchang由中科院生物工程中心提供。上述菌株直接从保藏单位获得。\n[0045] 1.2培养基\n[0046] 1.2.1PDA培养基：去皮马铃薯200克煮沸20分钟滤去薯片，葡萄糖20克，琼脂20克，加蒸馏水至1000毫升。\n[0047] 1.2.2GYP培养基：葡萄糖40g，酵母膏10g，KH2PO4 1g。MgSO4·7H2O 0.5g加水溶解，定容到1000毫升，pH值自然。\n[0048] 1.2.3改良布氏肉汤培养基(Hassan et al，1999)：改良布氏肉汤(CDRC)28g，加水溶解定容至1000ml，1N NaOH调pH至7.3，琼脂2％，临用前加7％无菌羊血(CDRC)。\n[0049] 1.2.4LB培养基：10g Tryptone，5g Yeast Extract，5g NaCl，1mL 1N NaOH的1L水溶液(pH调整至7)。\n[0050] 1.3培养方法\n[0051] 1.3.1猴头菌PDA平板培养：将低温保藏的猴头菌株转接到PDA斜面，26℃下暗室培养10天进行菌株活化，活化好的菌株挑取菌落边缘到PDA平板中央，26℃下暗室培养8-9天。\n[0052] 1.3.2猴头菌液体三角瓶发酵：挑取活化好的菌株的菌丝块于无菌水中均浆，以\n10％的接种量接种于GYP发酵培养基中，温度26℃，转速160r/min，发酵培养时间为12天。\n[0053] 1.3.3HP培养：将疑固的改良布氏肉汤培养基放入微波炉溶化，待温度冷却到\n50℃左右，无菌条件下加入15ml的新鲜无菌绵羊血，摇匀，迅速倒入灭菌的平板中，每平板约20ml，待血平板冷却凝固。取-80℃条件下脱脂牛奶保藏的幽门螺杆菌，用无菌接种环划线轻轻接种于血平板表面，放入三气培养箱中(O2，5％；CO2，10％；N2，85％)，37℃恒温培养\n72小时。\n[0054] 1.3.4 E.coli及S.aureus培养：将4℃保藏的菌种划线接于LB平板上，37℃恒温培养12h。\n[0055] 1.3.5菌悬液制备：挑取适量培养12小时(E.coli及S.aureus)或72小时(HP)的菌落于无菌生理盐水(0.9％NaCl)中，超声约30s，制成相当于2.0McFarland standard(含\n7 8\n菌1×10 至1×10c.f.u.ml/L)。\n[0056] 1.3.6猴头菌栽培培养基：棉子壳(78％)、麸皮(20％)、石膏粉(1％)，每三角瓶干重装约240克、含水量60％-65％。制法：先将棉子壳提前约12-14小时喷水预湿后再根据具体配方要求加入其它培养料，充分拌透均匀，最后加水把含水量调整在60％-65％左右。简单测试方法：手捏培养料手指间有水珠几滴，说明含水量已达要求。配制好的培养料当天完成分装。分装完毕，装料瓶121℃，高压灭菌2小时，自然冷却至室温备用。\n[0057] 1.4抑菌试验\n[0058] 1.4.1菌牒法：将培养有菌丝的PDA平板(菌丝培养10天左右)打孔，制得直径约为0.6cm的菌丝块，将菌丝面贴放在将用于培养HP的血平板上，25℃放置24小时，去掉菌丝块，无菌棉棒蘸菌悬液后在血平板上均匀涂布HP，进行HP培养，可在菌丝块位置周围形成抑菌圈。\n[0059] 1.4.2发酵液法：将发酵液倾倒在斜放的血平板的底部一侧，25℃放置24小时后倒去发酵液，涂HP培养。在倾倒发酵液的区域及其外围形成抑菌区。\n[0060] 1.4.3琼脂块法：发酵液经过浓缩分离后，制成一定浓度的水溶液，将没有菌丝生长的水琼脂圆牒浸泡其中，等试液达到浓度的内外平衡后，再进行1.4.1方法进行抑菌检测。\n[0061] 1.4.4打孔法：检测用血平板为定量平板，直径90mm，每板加培养基23g左右，每板打孔3个，呈等边三角形，孔径8mm，每孔加试样160μl(溶剂为无菌水)，涂HP培养检测抑菌。\n[0062] 1.5猴头菌粗提取物制备方法\n[0063] 1.5.1取约2公斤猴头菇干子实体，粉碎，用50升95％乙醇浸约48小时，回收乙醇，得浸膏，如此3次。合并浸膏，静置，分液去油层，过滤除去沉淀，上清用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得子实体乙酸乙酯萃取物备用。\n[0064] 1.5.2猴头菌发酵完成后，4层纱布过滤，滤液70℃浓缩至原体积的1/10，加等体积正丁醇萃取，每次萃取多于3h，3次，正丁醇上清经旋蒸仪浓缩(60℃，P＜50bp)回收溶剂后，得3组分：粘于旋蒸瓶壁黑褐色固体，稍加蒸馏水溶解(Zb)；旋蒸得浑浊液静止，沉淀(Za)；上清Zc。合并Za、Zc得Zac经大孔树脂柱D101干法上样后，依次用水，30％乙醇，\n70％乙醇，95％乙醇洗脱，得到各粗提物分别命名为Zac-1、Zac-2、Zac-3和Zac-4。40℃下恒温干燥备用。\n[0065] 1.6猴头菌碱、麦角甾醇、猴头菌酮的分离纯化及结构鉴定\n[0066] 取5公斤猴头菇干子实体，粉碎，用50升95％乙醇浸24小时，回收乙醇，得浸膏，如此3次。合并浸膏，静置，分液去油层，过滤除去沉淀，上清用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，萃取物拌硅胶、硅胶柱层析，洗脱用氯仿-甲醇系统。氯仿洗脱部分根据薄层色谱的结果合并为6个部分，其中第6个部分在回收氯仿后析出结晶。该结晶进行第二次硅胶柱层，洗脱用石油醚-乙酸乙酯系统，其中石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1洗脱部分根据薄层色谱结果合并成5个部分，其中第3个部分在回收溶剂后得结晶经H谱、C谱分析后进行结构确证。\n[0067] 1.7MIC检测\n[0068] 使用96孔板(96well)检测MIC，首先取0.1ml的无水乙醇加到96孔盘之A1-A12中。各试样配制成一定浓度的储存液；留A1做空白对照，取0.1ml的药物溶液加到A2中，以移液枪进行2倍连续稀释，使药物最终浓度达25□10000μg/ml。60℃挥干96板中溶剂后，用移液枪吸0.1ml融化的LB培养基(E.coli及S.aureus)或布氏血琼脂于每个含药的孔中，凝固。接下来用无菌棉棒蘸取待测菌菌悬液，依次接种于各孔中的培养基表面，于\n37℃培养过夜(E.coli及S.aureus)或3天(HP)。以肉眼观察培养基表面没有细菌生长的最低药物稀释浓度即定为MIC。\n[0069] 2结果与分析\n[0070] 2.1猴头菌培养物(菌牒、发酵液)对HP的体外抑制\n[0071] 猴头菌菌丝在PDA平板上培养9天后，以接种块边缘开始，依次由内向外用打孔器打6个直径约为0.6cm的菌丝块，从内向外各接种块上的菌丝处于由老至嫩的不同状态，把这种菌丝块菌丝面向下、间距均匀地贴放在将用于培养HP的血平板上，25℃放置24小时，去掉菌丝块，涂布HP，进行HP培养，可在菌丝块位置周围形成抑菌圈(图1)。老嫩不同的菌牒对HP的抑制效果不同，过老或过嫩均未有抑菌，而正值“壮年”的菌牒则表现出最强的抑菌效果，表明抑菌成分的产生与分泌与菌丝的生长状态有密切的关系(如图1中所示，1表示最老的菌丝，6表示最嫩的菌丝，2到5依次从老过度到嫩菌丝)。\n[0072] 猴头菌发酵液可在倾倒发酵液的区域及其边界外形成抑制幽门螺杆菌生长的区域，距此较远的平板其它区域HP生长正常(图2)。研究还发现，发酵液从第6天开始有抑菌活性，第10天抑菌活性达到最佳，生产发酵液参考时间为10-11天。\n[0073] 2.2猴头菌发酵液正丁醇萃取物、猴头菌子实体乙酸乙酯提取物对HP及其它致病菌的MIC\n[0074] 猴头菌发酵液正丁醇萃取物Zac在每孔加样约5mg(样液浓度约33mg/mL，每孔加样0.16mL)时，形成两种抑菌圈和一种不抑菌结果。1、在加样孔周围形成抑菌区，但抑菌区内仍有菌落生长，且离加样孔越近，□Hp生长越稀少(图3-A)，以“不完全抑制”表示；2、加样孔周围形成抑菌区，抑菌区内无菌落生长，抑菌圈边缘光滑齐整(图3-B)，以“+”表示；\n3、加样孔周围无抑菌情况，孔边缘菌落正常生长(图3-C)，以“-”表示。\n[0075] 对收集到的22株猴头菌菌株制备发酵液正丁醇萃取物Zac的抑菌结果研究表明，其中的20株猴头菌表现出强弱不同的抑菌效果，抑菌圈直径(含孔径)范围在8.3-13.5mm之间，另有两株在实验条件下未检测到抑菌活性(表1)。\n[0076] 表1.22株猴头菌株发酵液正丁醇萃取物对HP抑菌活性(33mg/mL)\n[0077] \n[0078] 注：“-”表示抑菌圈直径＜8mm\n[0079] 本研究进一步制备了猴头菇(Hericium erinaceum)、金针菇(Flammulina velutiper)、蛹虫草(Cordyceps militaris)、杏鲍菇(Pleurotus eryngn)、茶树菇(Agrocybe aegerita)、香菇(Lentinula edodes)、巴西蘑菇(Agaricus blazei)、平菇(Pleurotus ostreatus)、毛头鬼伞(Coprinus comatus)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)、灰树花(Grifola frondosa)和桑黄(Phellinus igniarius)等12种食药用菌子实体材料的乙醇粗提取物，并按1.4部分所述的方法检测这些提取物抑制H.pylori ATCC 43504、H.pylori SS1、S.aureus CMCC 26003、E.coliCMCC 44103和E.coli ATCC 25922的体外生长的情况。结果显示，在10mg/mL的样品浓度下，全部12种食药用菌的粗提物对所测试E.coli两菌株均无抑菌活性；仅猴头菇和灵芝样品对S.aureus显示抑菌活性；除了双孢蘑菇和金针菇之外的其它10种食药用菌的粗提物对H.pylori显示出程度不同的抑菌活性(表2)，其中香菇、巴西蘑菇、杏鲍菇和茶树菇的粗提物对H.pylori ATCC43504体外生长的抑菌浓度为2.5-5mg/mL，猴头菌、平菇、灰树花和鸡腿菇为1.5-3mg/mL，桑黄和虫草较高，为1-2mg/mL。\n[0080] 表2常见食药用菌子实体乙醇提取物对H.pylori，S.aureus和E.coli体外生长的抑菌浓度(mg/mL)\n[0081] \n[0082] 注：a，最低抑菌浓度范围。\n[0083] 进一步检测猴头菇子实体精提物(即乙酸乙酯提取物)、猴头菇液体发酵液精提取物、猴头菇片醇提物及猴头菇多糖对E.coli、H.pylori和S.aureus的MIC，结果显示(表3)：经乙酸乙酯进一步提取的猴头菇子实体精提物对E.coli仍未显示出抑菌活性；对H.pylori ATCC43504、H.pylori SS1和S.aureus CMCC26003的MIC分别为＜1mg/mL、＜1mg/mL和4-8mg/mL，发酵液精提物对三株菌的MIC分别为＜1mg/mL、＜1.4mg/mL和1-2mg/mL。其中一种猴头菌片醇提物对三株菌的MIC分别为2.5-5mg/mL、2.5-5mg/mL和5-10mg/mL，这三个样品对H.pylori的抑制强于对S.aureus的抑制。另一种猴头菌片醇提物在10mg/mL时没检测到抑菌活性。猴头菇粗多糖在22.5mg/mL时无抑制H.pyloriATCC43504活性。\n[0084] 表3不同猴头菌样品精提物对H.pylori，S.aureus和E.coli的最低抑菌浓度(mg/mL)\n[0085] \n[0086] a，最低抑菌浓度；Nt，未检测。检测在96孔板上用培养基微量稀释法进行。\n[0087] 经反复试验，最终将猴头菇子实体精提物样品的浓度梯度设定在50μg/mL～\n200μg/mL之间，在该区间内，样品对H.pylori ATCC 43504生长的抑制率在33.1％～\n100％之间(表4)，测出IC50为73.0μg/mL(r＝0.9523，p＝0.0124)。另测得猴头菇子实体精提物样品的最低杀菌浓度为200μg/mL。\n[0088] 表4.不同浓度的猴头菇子实体精提物对H.pylori ATCC 43504生长的效果[0089] \n提取物浓度，μg/mL 抑制率，％ 杀菌活性\n CK 0 -\n 50 33.1 -\n 75 43.1 -\n 100 60.8 -\n 125 87.4 -\n 150 88.6 -\n 200 100.0 +\n[0091] 2.3抑菌活性成分的分离纯化\n[0092] 猴头菇子实体5kg，粉碎后以50L 95％乙醇冷浸提取三次，每次24小时。醇提液合并，回收溶剂至无醇味，得醇提物约350mL。醇提物静置分层，上层为油状物，下层为水相。\n用分液漏斗分离出水相，以乙酸乙酯萃取三次，每次250mL。合并乙酸乙酯萃取液，回收溶剂，得膏状乙酸乙酯萃取物14克。\n[0093] 醇提物、油状物、乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃取后水溶液分别测抑菌活性，结果显示醇提物(MIC＝10mg/mL)、油状物(MIC＝20mg/mL)和乙酸乙酯萃取物(MIC＝4.0mg/mL)有活性，而乙酸乙酯萃取后水溶液没有抑菌作用。乙酸乙酯萃取物活性明显高于醇提物和油状物，因此对乙酸乙酯萃取物进行下一步分离纯化和活性筛选。\n[0094] 乙酸乙酯萃取所得浸膏(14g)以硅胶柱层析分离，氯仿-甲醇梯度洗脱，得25个流分(A1-A25)。流分A5-A23显示抑菌活性，其中A6(氯仿洗脱流分，MIC＜1.0mg/mL)和A12-A16(氯仿-甲醇50∶1-20∶1洗脱流分，MIC：0.30-0.75mg/mL)活性较强。\n[0095] 流分A6放置后析出白色晶体，约80mg，TLC分析为混晶。进一步分离使用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得晶1(麦角甾醇，10mg)和晶2(猴头菇碱，6.7mg)。晶\n1和晶2均显示抑菌活性，MIC分别为5.0mg/mL和0.5mg/mL。\n[0096] 流分A6母液与氯仿洗脱流分A7合并，约1.0克，以硅胶柱层析分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得91个流分(B1-B91)。其中流分B50-B54活性最强(MIC＝0.18mg/mL)。\nB50-B54放置析出白色固体，于丙酮中重结晶得晶3(猴头菇酮A，1.8mg)。\n[0097] 流分A8-A16合并，得浸膏约1.5克，以硅胶柱层析分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得106个流分(C1-C106)。流分C77-C84活性最强(MIC＝0.63mg/mL)，从中析出白色晶体，于石油醚-乙酸乙酯(1∶1，V/V)中重结晶，得6.5mg晶体。活性测试显示该晶体有明显抑菌活性，MIC＜0.312mg/mL。结构鉴定证明其为两个化合物晶4和晶5的混晶。\n[0098] 2.4抑菌活性成分的结构鉴定\n[0099] 2.4.1化合物波谱数据\n[0100] 晶1：白 色 针 晶。EI-MSm/z：396(M+)，378，363，253(100 ％ )。HR-EI-MSm/z：\n+ 1\n396.3396(M，C28H44O，calc.396.3392)。H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：0.63(3H，s)，0.83(6H，t，J＝6.4Hz)，0.92(3H，d，J＝6.8Hz)，0.95(3H，s)，1.04(3H，d，J＝6.8Hz)，1.2-2.1(21H，m)，2.28(1H，t，J ＝ 12.8Hz)，2.47(1H，d，J ＝ 14.4Hz)，3.63(1H，br s)，5.20(2H，m)，\n13\n5.39(1H，m)，5.58(1H，dd，J＝5.4Hz，2.0Hz)。 C-NMR(400MHz，CDCl3)δ：12.0，16.3，17.6，\n19.6，20.0，21.1，23.0，28.3，32.0，33.1，37.0，38.4，39.1，40.4，40.8，42.8，46.2，54.5，\n55.7，70.4，116.3，119.6，132.0，135.6，139.8，141.4。与标准图谱对照，鉴定为麦角甾醇(Ergosterol)。\n[0101] 晶2：白色 晶体。EI-MS m/z：419(M+)，401，328，149(100％ )。HR-EI-MSm/z：\n+ 1\n419.2462(M，C27H33O3N，calc.419.2460)。H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.58(3H，s)，1.66(3H，s)，1.80(3H，s)，2.07(4H，m)，2.97(2H，t，J＝7.2Hz)，3.49(2H，d，J＝6.8Hz)，3.83(3H，s)，3.84(2H，t，J＝7.2Hz)，4.17(2H，s)，5.03(1H，t，J＝6.0Hz)，5.24(1H，t，J＝7.2Hz)，\n13\n6.39(1H，br s)，6.95(1H，s)，7.1-7.3(5H，m)。C-NMR(400MHz，CDCl3)δ：16.2，17.7，22.8，\n25.7，26.3，34.9，39.7，44.2，48.1，56.1，97.6，118.2，121.1，121.2，123.7，126.5，128.6，\n128.7，132.1，132.2，138.7，139.6，150.5，158.3，168.8。与文献图谱对照(Yasuo Kimura，Masahiko Nishibe，Hiromitsu Nakajima，Takashi Hamasaki，Atsumi Shimada，Akihiko Tsuneda，and Norihiro Shiematsu，Agric.Biol.Chem.，55(10)，2673-2674，1991)，鉴定为猴头菇碱(Hericerin)。\n[0102] 晶3：白 色粉末。EI-MS m/z：330(M+)。HR-EI-MS m/z：330.1494(M+，C19H22O5，\n1\ncalc.330.1467)。H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.82(3H，s)，1.91(3H，s)，2.17(3H，s)，\n3.19(2H，s)，3.60(2H，d，J＝7.4Hz)，3.87(3H，s)，5.25(2H，s)，5.30(1H，t，J＝7.4Hz)，\n6.08(1H，s)，6.97(1H，s)。与文献图谱对照(Hirokazu Kawagishi，Motoharu Ando，and Takashi Mizuno，Tetrahedron Letters，31(3)，373-376，1990)，鉴定为猴头菇酮A(Hericenone A)。\n[0103] 晶4：白色晶体。EI-MS m/z：315(M+)，300，272，246，230，203，193(100％)，178，+ 1\n161，123。HR-EI-MS m/z：315.1832(M，C19H25NO3，calc.315.1834)。H-NMR(400MHz，CD3COCD3)δ：1.55(3H，s)，1.60(3H，s)，1.78(3H，s)，1.94(2H，t，J＝6.8Hz)，2.07(2H，m)，3.45(2H，d，J＝6.8Hz)，3.88(3H，s)，4.34(2H，s)，5.06(1H，t)，5.22(1H，t)，6.85(1H，s)，7.37(1H，\n1\nbr.s)。H-NMR(400MHz，CD3OD)δ：1.53(3H，s)，1.58(3H，s)，1.77(3H，s)，1.93(2H，t，J＝ 7.2Hz)，2.02(2H，t)，3.41(2H，d，J ＝ 7.2Hz)，3.85(3H，s)，4.30(2H，s)，5.02(1H，t，\n7.2Hz)，5.16(1H，t，7.2Hz)，6.91(1H，s)。\n[0104] 晶5：白色晶体。EI-MS m/z：329(M+)，311，298，270，247，231(100％)，216，191，+ 1\n178，83。HR-EI-MS m/z：329.1625(M，C19H23NO4，calc.329.1627)。H-NMR(400MHz，CD3COCD3)δ：1.77(3H，s)，1.82(3H，s)，2.09(3H，s)，2.99(2H，s)，3.49(2H，d，J＝7.6Hz)，3.88(3H，\n1\ns)，5.30(1H，t)，6.13(1H，t)，6.85(1H，s)，7.37(1H，s)，8.40(1H，s)。H-NMR(400MHz，CD3CD)δ：1.76(3H，s)，1.82(3H，s)，2.08(3H，s)，2.99(2H，s)，3.47(2H，d，J＝7.2Hz)，3.85(3H，s)，5.34(1H，t)，6.13(1H，t)，6.85(1H，s)，8.40(1H，s)。\n[0105] 2.4.2化合物结构鉴定\n[0106] 晶1为白色针晶，溶于氯仿，难溶于其他有机溶剂。核磁共振氢谱显示结构母核\n1 1\n为含有六个甲基(H-NMR δ0.63-1.04)的甾体结构，结合碳谱证明存在三个双键(H-NMR \n13\nδ5.20，5.39，5.58；C-NMR δ116.3，119.6，132.0，135.6，139.8，141.4)和一个羟基取代\n1 13\n(H-NMR δ3.63；C-NMR δ70.4)。高分辨质谱测定分子量为393.3396，符合麦角甾醇结构式C28H44O。氢谱和碳谱与麦角甾醇标准品图谱一致，确证晶1为麦角甾醇(Ergosterol)。\n[0107] \n[0108] 晶1麦角甾醇(Ergosterol)\n[0109] 晶2为白色晶体，溶于氯仿、丙酮、甲醇等有机溶剂。核磁共振氢谱和碳谱显示结\n1 13\n构中含有一个单取代苯(H-NMR δ7.2，5H，多重峰；C-NMR δ126.5，128.6，128.6，128.7，\n1 13\n128.7，139.6)和一个五取代苯(H-NMR δ6.95，1H，单峰；C-NMR δ97.6，118.2，121.1，\n1 1\n132.1，150.5，158.3)，三个甲基(H-NMRδ1.58，1.66，1.80)、两个双键(H-NMR δ5.03，\n13 13\n5.24；C-NMR δ121.2，123.7，132.2，138.7)、一个羰基( C-NMR δ168.8)和一个活泼氢\n1\n(H-NMR δ6.19)。根据其结构特征，推测为猴头菇子实体中所特有的芳环类化合物。高分辨质谱测得分子量为419.2462，为含N化合物，符合猴头菇碱的结构式C27H33NO3。与文献报道波谱数据(Kimura，1991)对照，确证晶2为猴头菇碱(Hericerin)。\n[0110] \n[0111] 晶2猴头菌碱(Hericerin)\n[0112] 表5晶2(猴头菇碱，Hericerin)1H-NMR和13C-NMR信号归属\n[0113] \n[0114] \n[0115] 晶3为白色粉末状结晶，溶于氯仿、丙酮、甲醇等有机溶剂。核磁共振氢谱显示\n1 1\n结构中含有一个五取代苯环(H-NMR 86.97，1H，单峰)、三个甲基(H-NMR δ1.82，1.91，\n1\n2.17)和两个双键(H-NMR δ5.30，6.08)，符合猴头菇中含有的芳环类化合物结构特征。高分辨质谱测得分子量为330.1494，结构式为C19H22O5，与猴头菇酮A相符。对照文献报道氢谱数据(Kawagishi，1990)，确证晶3为猴头菇酮A(Hericenone A)。\n[0116] \n[0117] 晶3猴头菇酮A(Hericenone A)\n[0118] 表7.猴头姑酮A的1H-NMR数据\n[0119] \n[0120] 晶4为白色晶体，溶于丙酮、甲醇等有机溶剂。高分辨质谱测得精确分子量为\n315.1832，为含N化合物，结构式为C19H25NO3。核磁共振氢谱显示结构中含有一个五取代苯\n1 1 1\n环(H-NMR 86.85，1H，单峰)、三个甲基(H-NMR δ1.55，1.60，1.78)和两个双键(H-NMR δ5.06，5.22)，符合猴头菇中的芳环类化合物结构特征。与已知化合物氢谱比较，其侧链烷烃的结构与猴头菇碱和猴头酮J一致，为一(2’E)-geranyl基团。在84.34出现的单峰信号归属为3-CH2，该亚甲基与N原子相连，因此结构中存在与猴头菇碱类似的酰胺环。使用氘\n1\n代丙酮为溶剂的氢谱显示有两个活泼氢(H-NMR δ7.37，8.31，用氘代甲醇作溶剂时信号消失)，分别归属为7-OH和3-NH。综合波谱数据，晶4的结构鉴定为6-[(2’E)-3’，7’-二甲基-2’，6’-辛二烯基]-7-羟基-5-甲氧基-1-异吲哚满酮，为一新的化合物，命名为猴头菇酮K(Hericenone K)。\n[0121] \n[0122] 晶4猴头菇酮K(Hericenone K)\n[0123] 表7.猴头姑酮K的1H-NMR数据\n[0124] \n[0125] 晶5为白色晶体，溶于丙酮、甲醇等有机溶剂。高分辨质谱测得精确分子量为\n329.1625，为含N化合物，结构式为C19H23NO4。核磁共振氢谱显示结构中含有一个五取代苯\n1 1 1\n环(H-NMR δ6.85，1H，单峰)、三个甲基(H-NMR δ1.77，1.82，2.08)和两个双键(H-NMR δ5.30，6.13)，与晶4氢谱相似，符合猴头菇中的芳环类化合物结构特征。δ4.30的单峰信\n1\n号为3-CH2，应与N原子相连。与晶4相同，晶5也含有两个活泼氢(H-NMR δ7.37，8.40，用氘代甲醇作溶剂时信号消失)，分别归属为7-OH和3-NH。因此晶5母核结构与晶4相同，区别在于侧链的结构。与已知化合物氢谱比较，晶5的侧链与猴头酮A一致，5’为羰基取代。\n综合波谱数据，晶5的结构鉴定为6-[(2’E)-3’，7’-二甲基-5’-氧代-2’，6’-辛二烯基]-7-羟基-5-甲氧基-1-异吲哚满酮，为一新的化合物，命名为猴头菇酮L(Hericenone L)。\n[0126] \n[0127] 晶5猴头菇酮L(Hericenone L)\n[0128] 表8.猴头姑酮L的1H-NMR数据\n[0129] \n[0130] 2.5猴头菌碱、麦角甾醇、猴头菌酮K和L对HP的MIC\n[0131] 对上述从猴头菌子实体分离到的猴头菌碱、麦角甾醇、猴头菌酮K和L混合物按\n1.7法测对HP的MIC，得猴头菌碱对HP的MIC为0.5mg/mL，麦角甾醇对HP的MIC为5mg/mL，猴头菌酮K和L为0.312mg/mL。\n[0132] 3.主要猴头菌中药体外抑制HP的初步研究\n[0133] 本实施例比较了目前常见猴头菌中药——上海雷允上猴头菌片、南京老山胃乐宁片、山西康欣谓葆猴头菌提取物颗粒、太阳神口服液等分别用水提、水提醇沉上清和乙酸乙酯萃取三个主要部分进行了抑菌比较，比较主要从MIC和总抑菌活力两个方面进行。主要结果如下：上海雷允上猴头菌片、南京老山胃乐宁片、山西康欣谓葆猴头菌提取物颗粒三个药水提物有抑菌效果，它们水提取物的MIC分别约为10mg/mL、5mg/mL和10mg/mL，一次服用剂量的总抑菌活力分别为33个MIC(单位质量药剂则为32MIC/g)、66个MIC(127MIC/g)和222个MIC(74MIC/g)。猴头菌子实体醇提取物MIC为6mg/mL，结合提取率计算，每克子实体总抑菌活力为44个MIC。对于各活性样的醇溶物进一步用乙酸乙酯萃取，除谓葆乙酸乙酯萃取物在～1mg/mL明显抑菌外，胃乐宁片、雷允上猴头菌片和猴头菌子实体的乙酸乙酯萃取物的MIC均为1mg/mL。\n[0134] 3.1样品\n[0135] A：太阳神口服液\n[0136] B：复方猴头颗粒(上海信仁)批号090503\n[0137] C：猴头菌片(上海雷允上)批号10100102\n[0138] D：胃乐宁片(南京老山)批号100610\n[0139] E：谓葆(山西康欣)批号101002031\n[0140] 上述样品均从药店购买。\n[0141] F：猴头子实体醇提取物(自制)\n[0142] 3.2方法\n[0143] 1：用量：A-E各样品取一次服用量，即A1支(10ml)、B1袋(5g)、C4片(1.04g)、D3片(0.52g)、E1袋(3g)；F，373mg/mL。\n[0144] 2：制备：A样加水10mL，B-E各样品加水20mL，充分溶解，超声15分钟3次，过夜。\n离心(6℃，8000转，5分钟)，上清为水提取物(1)；取5ml(1)加10mL 95％乙醇，充分混均，离心(条件同上)，上清为醇提取物(2)；浓缩(2)至原体积1/3，取1mL加2mL乙酸乙酯，萃取，取乙酸乙酯相(3)；下层加2倍体积正丁醇，取正丁醇相(4)。\n[0145] 3：样品各相取适量，45℃烘干称重，计算各样浓度。\n[0146] 4：抑菌检测：在96孔板上准备各样品梯度(约10mg-0.25mg，依不同样品而异)、挥干溶剂、灭菌、注入培养基、抑菌(具体方法略)。\n[0147] 3.3结果\n[0148] 3.3.1各样品提取结果显示在下表中，为C-F各样品提取结果(A、B两样略)。\n[0149] \n[0150] 3.3.2MIC结果(单位：mg/mL)\n[0151] \n[0152] 4.讨论\n[0153] 4.1本实施例首先对5种猴头菌中药或口服液进行了水提，其中片剂或颗粒水溶性成分的含量在38.6％-68.6％之间，可能主要决定于各自的原料和辅料质量。本研究所取猴头菌6种样品中，一种口服液和一种颗粒剂的水提取物在约10mg/mL的浓度下未检测到抑菌活性，其它各样(子实体样未做)均检测到，其中胃乐宁片水提物的MIC最低，为\n4.35mg/mL，其它各样约为10mg/mL。结合各样水提取率及其水提取物MIC分析，一次服用剂量情况下，谓葆约合222个MIC，胃乐宁片次之，约66个MIC，雷允上猴头菌片最少，约为33个MIC。有活性各样的水提取物加醇至终浓度约60％后，醇溶物含量均有不同程度的下降，为34％-45％，其中谓葆下降最为明显。除胃乐宁片醇溶物在～3mg/mL可见明显抑菌外，其余各样品醇溶物在该浓度下未见明显抑菌。对于本实施例所用猴头菌子实体，其80％乙醇提取物在～3mg/mL可见明显抑菌、MIC为6mg/mL，结合其26.6％的提取率，每克子实体约合44个MIC。\n[0154] 4.2对于各活性样的醇溶物进一步用乙酸乙酯萃取，除谓葆乙酸乙酯萃取物在～\n1mg/mL明显抑菌外，胃乐宁片、雷允上猴头菌片和猴头菌子实体的乙酸乙酯萃取物的MIC均为1mg/mL。如果我们最终以猴头菌子实体的乙酸乙酯萃取物为产品(目前的提取得率约为1％)，则单位质量的抑菌总活性可达1000MIC/g。正丁醇提取物活性较乙酸乙酯提取物活性低。