包含免疫原性微颗粒的组合物

1.免疫学有效量的一种组合物在制备用于诱导对象免疫应答 的药物中的应用，所述组合物包含由一种与抗原共价缀合的呈惰性的 物质组成的微颗粒，其中所述微颗粒的大小使得其通过一种被乙酸肉 豆蔻佛波醇抑制的机制被树突状细胞摄取。
2.权利要求1的应用，其中所述微颗粒的平均直径为0.03微米 至0.1微米。
3.权利要求1的应用，其中所述微颗粒的平均直径为0.03微米 至0.05微米。
4.权利要求1的应用，其中所述微颗粒的大小基本上是均一的。
5.权利要求1的应用，其中所述微颗粒包含实心的核心。
6.权利要求1的应用，其中所述组合物是疫苗。
7.权利要求1的应用，其中所述惰性物质选自乳胶、亚铁分子、 金、玻璃、磷酸钙、聚苯乙烯、聚赖氨酸G、可生物降解的聚合物、 生物相容性聚合物、及其组合。
8.权利要求1的应用，其中所述抗原来源于病原体、组织、细 胞器或分子并选自：
花粉；丙型肝炎病毒(HCV)核心、E1、E2和NS2蛋白；
来自选自由间日疟原虫、恶性疟原虫的环孢子蛋白(CS)、人恶 性疟原虫、人间日疟原虫、人卵形疟原虫和人三日疟原虫组成的 一组的疟原虫属的抗原：TRAP、MSP-1、MSP-2、MSP-3、 MSP-4、MSP-5、AMA-1、RESA、SALSA、STARP、LSA1 和LSA3；HIV-gp120/160包膜糖蛋白；链球菌表面蛋白抗原； 流感病毒核蛋白；血凝素-神经酰胺酶表面蛋白；TcpA菌毛蛋白 亚基；VP1蛋白；LMCV核蛋白；硕大利什曼原虫主要表面糖 蛋白gp63；百日咳博德特氏菌表面蛋白；狂犬病病毒G蛋白； 链球菌M蛋白；葡萄球菌蛋白；幽门螺旋杆菌蛋白；合胞体病 毒(RSV)F或G蛋白；Epstein Barr病毒(EBV)gp340或核抗 原3A；血凝素；博氏疏螺旋体外表面蛋白(Osp)A；结核分支 杆菌38kD脂蛋白或Ag85、10kD或65kD蛋白；脑膜炎奈瑟菌 I型外蛋白；水痘带状疱疹IE62和gpl；风疹病毒壳体蛋白；乙 型肝炎病毒前-S1抗原；单纯疱疹病毒I型糖蛋白G或gp D或 CP27；墨累灰牛流域脑炎病毒E糖蛋白；甲型肝炎病毒P1；脊 髓灰质炎病毒壳体蛋白VP1、VP2、和VP3；沙眼衣原体表面 蛋白；乙型肝炎病毒包膜抗原前-S2；人鼻病毒(HRV)壳体；来 自癌基因E6和E7的人乳头状瘤病毒多肽；李斯特杆菌表面蛋 白；水痘病毒壳体蛋白；牛痘病毒包膜蛋白；布氏杆菌表面蛋白； 轮状病毒VP-3、VP-4、VP-5、VP-7和VP-8；所述一种或多种 抗原的组合；所述抗原的长度上包含5个或更多氨基酸的氨基酸 亚基；以及一个或多个所述亚基的组合。
9.权利要求1的应用，其中所述抗原来源于选自乳腺癌、肺癌、 胰腺癌、结肠癌和黑色素瘤的肿瘤。
10.权利要求1的应用，其中所述免疫应答选自CD8和/或CD4 T细胞免疫应答和抗体应答中的至少一种，其中所述抗体选自免疫球 蛋白G、免疫球蛋白M和免疫球蛋白A组成的组。
11.权利要求1的应用，其中所述微颗粒被细胞内凹和/或网格 蛋白凹摄取，并且其中所述微颗粒的摄取有利于对MHC I通过Rab4 非依赖性和TAP依赖性途径呈递的抗原的加工。
12.权利要求1的应用，其中所述免疫应答是抗原呈递细胞的 活化和/或扩增和/或增殖。
13.权利要求12的应用，其中所述抗原呈递细胞是树突状细 胞。
14.权利要求1的应用，其中所述对象是人或动物。
15.一种在对象体内诱导免疫应答的免疫原性组合物，所述组 合物包含由一种与抗原共价缀合的呈惰性的物质组成的微颗粒，其中 所述微颗粒的大小使得其通过一种被乙酸肉豆蔻佛波醇抑制的机制 被树突状细胞摄取。
16.权利要求15的组合物，其中所述微颗粒的平均直径为0.03微 米至0.1微米。
17.权利要求15的组合物，其中所述微颗粒的平均直径为0.03 微米至0.05微米。
18.权利要求15的组合物，其中所述微颗粒的大小基本上是均 一的。
19.权利要求15的组合物，其中所述微颗粒包含实心的核心。
20.权利要求15的组合物，其中所述组合物是疫苗。
21.权利要求15的组合物，其中所述惰性物质选自乳胶、亚铁 分子、金、玻璃、磷酸钙、聚苯乙烯、聚赖氨酸G、可生物降解的聚 合物、生物相容性聚合物、及其组合。
22.权利要求15的组合物，其中所述抗原来源于病原体、组织、 细胞器或分子并选自：
花粉；丙型肝炎病毒(HCV)核心、E1、E2和NS2蛋白；
来自选自由间日疟原虫、恶性疟原虫的环孢子蛋白(CS)、人恶 性疟原虫、人间日疟原虫、人卵形疟原虫和人三日疟原虫组成的 一组的疟原虫属的抗原：TRAP、MSP-1、MSP-2、MSP-3、 MSP-4、MSP-5、AMA-1、RESA、SALSA、STARP、LSA1 和LSA3；HIV-gp120/160包膜糖蛋白；链球菌表面蛋白抗原； 流感病毒核蛋白；血凝素-神经酰胺酶表面蛋白；TcpA菌毛蛋白 亚基；VP1蛋白LMCV核蛋白；硕大利什曼原虫主要表面糖 蛋白gp63；百日咳博德特氏菌表面蛋白；狂犬病病毒G蛋白； 链球菌M蛋白；葡萄球菌蛋白；幽门螺旋杆菌蛋白；合胞体病 毒(RSV)F或G蛋白；Epstein Barr病毒(EBV)gp340或核抗 原3A；血凝素；博氏疏螺旋体外表面蛋白(Osp)A；结核分支 杆菌38kD脂蛋白或Ag85、10kD或65kD蛋白；脑膜炎奈瑟菌 I型外蛋白；水痘带状疱疹IE62和gpl；风疹病毒壳体蛋白；乙 型肝炎病毒前-S1抗原；单纯疱疹病毒I型糖蛋白G或gp D或 CP27；墨累灰牛流域脑炎病毒E糖蛋白；甲型肝炎病毒P1；脊 髓灰质炎病毒壳体蛋白VP1、VP2、和VP3；沙眼衣原体表面 蛋白；乙型肝炎病毒包膜抗原前-S2；人鼻病毒(HRV)壳体；来 自癌基因E6和E7的人乳头状瘤病毒多肽；李斯特杆菌表面蛋 白；水痘病毒壳体蛋白；牛痘病毒包膜蛋白；布氏杆菌表面蛋白； 轮状病毒VP-3、VP-4、VP-5、VP-7和VP-8；所述一种或多种 抗原的组合；所述抗原的长度上包含5个或更多氨基酸的氨基酸 亚基；以及一个或多个所述亚基的组合。
23.权利要求15的组合物，其中所述抗原来源于选自乳腺癌、 肺癌、胰腺癌、结肠癌和黑色素瘤的肿瘤。
24.权利要求15的组合物，其中所述免疫应答选自CD8和/或 CD4T细胞免疫应答和抗体应答中的至少一种，其中所述抗体选自免 疫球蛋白G、免疫球蛋白M和免疫球蛋白A组成的组。
25.权利要求15的组合物，其中所述微颗粒被细胞内凹和/或网 格蛋白凹摄取，并且其中所述微颗粒的摄取有利于对MHC I通过 Rab4非依赖性和TAP依赖性途径呈递的抗原的加工。
26.权利要求15的组合物，其中所述免疫应答是抗原呈递细胞 的活化和/或扩增和/或增殖。
27.权利要求26的组合物，其中所述抗原呈递细胞是树突状细 胞。
28.权利要求15的组合物，其中所述对象是人或动物。

本发明涉及一种免疫原性组合物，疫苗组合物，在研究对象中引 发免疫应答的方法和生产这些组合物的方法。\n发明背景\n调控人和动物的免疫系统是一种得到广泛认可的避免或治疗某 些疾病或情况的手段。\n免疫系统控制疾病的机理包括诱导中和抗体(一种体液免疫应 答)和产生细胞或T细胞免疫应答。后者包括T辅助细胞(TH)和 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在病毒感染例如脊髓灰质炎或肝炎， 抗体通过阻止病毒感染细胞而提供保护。通过利用杀菌机制和中和细 菌毒素，抗体也能抵抗细菌如肺炎链球菌和葡萄球菌。\n当抗原的肽片段结合到称为MHC I或MHC II的分子(主要组 织相容性复合物，I型或II型)并被呈递在专门的APC(抗原呈递 细胞(antigen presenting cells))如DC(树突状细胞(dendritic cells)) 或巨噬细胞表面时，T细胞能被激活。T细胞含有的抗原受体能用于 监视细胞表面的抗原肽片段的出现。TH细胞的抗原受体识别结合于 MHC II分子的抗原肽。相反的，CTL的受体和呈现在I型分子的抗 原反应。\n激活的T细胞放大免疫应答，这是因为当T细胞识别被病原体 感染或包含它能识别的抗原决定簇的目标细胞时，链式事件被触发， 这些最终导致感染的细胞的死亡。另外，一些T细胞能刺激分泌细胞 因子或淋巴因子，这些反过来可最终导致病原体的失活或消除。\n尽管市场上有很多疫苗，但是对于大量的疾病或情况仍然需要生 产更有效和广谱的疫苗。也仍然需要保护性对抗那些尚未获得疫苗或 疫苗效果不佳的感染体或病原体。另外，需要一种有效的单剂量的疫 苗，就经济、运输和患者或研究对象的顺从性等原因而言，它显得尤 其需要。\n大多数疫苗的缺点为不能诱导最佳的、不同类型的体液和细胞应 答的组合，以达到免疫学有效性。例如，当抗体和细胞应答两者同时 存在会更有效时，一些疫苗只能刺激抗体应答。其他例子中，需要多 剂的疫苗注射如追加注射才能抵抗相关的感染体。\n在一些其他的例子中，与所需要的免疫球蛋白如IgA、IgG和IgM 一起被诱导产生的还有IgE。诱导IgE的疫苗是不利的，因该免疫球 蛋白出现在过敏反应中。\n刺激IgA的生成对于经黏膜位置或表面进入感染的病原体是“第 一线”防御。因此，能产生高IgA分泌的免疫应答而不增加IgE生成 的疫苗也将是有用的。\n然而在其他例子中，尽管疫苗能刺激APC，免疫刺激的程度是 不乐观的。例如，树突状细胞或DC被一系列的细胞亚群所特征化， 它们能通过表面分子彼此区别开来，一些表面分子是能结合于T细胞 受体的特异配体。因此，需要去生产一种疫苗能选择性地定向于DC 的一类亚群，例如一类能有效地启动CD8T细胞的亚群，因为这些T 细胞在对抗许多细胞内病原体和肿瘤的保护性免疫中发挥重要作用， 但其难于诱导是众所周知的。\n进一步，对于疫苗，就大多数细胞而言，细胞外的抗原传统地不 进入MHC I处理途径。通常，利用死疫苗产生CTL免疫是不太可能 的，尽管有人认为存在APC通过摄取凋亡细胞、免疫复合物和颗粒 [1]来进行处理和呈递的I型的选择性途径。乙型肝炎的表面蛋白或酵 母逆转录蛋白颗粒构成的非感染性病毒样颗粒(VLP)已经显示能被 巨噬细胞用于有效地加工以呈递MHC I来在体内和体外诱导CD8 CTL细胞应答[2，3]。VLP是多亚基、包含脂质的蛋白颗粒，其中 脂质成分构成超过干重的50％。\n然而，因为乙型肝炎核心蛋白颗粒不具有免疫原性，并具有较低 的脂质成分，推测VLP的免疫原性不是因为其大小而是在于其生物 化学成分。这与关于当抗原表现为包含脂质或去污剂的形式时，它们 可能通过损坏细胞膜而与APC融合，然后进入细胞浆的假说一致。\n应用载有抗原的微球已经被试验作为一种可能的疫苗组合物。微 球由可生物降解的乳酸和羟乙酸多酯(PLA和PLGA)构成。微球被 构建成使得它们的大小和聚合物组合物能够控制其自身的降解速度。 当微球降解后，其载有的抗原从中被释放，并提供了抗原的控释来刺 激免疫应答。这些分子通过与蛋白颗粒一样的方式与免疫细胞接触和 反应是不太可能的，蛋白颗粒的构造与细胞膜具有生物相容性。\n然而，这种形式的疫苗组合物的难点还包括抗原稳定性、微球大 小和抗原释放的动力学，所有的这些仍需要去解决以生产出具有好的 抗原性和永久免疫原性的疫苗，以生产出能经济地生产和施用的疫苗 [4]。\n在美国专利No.4,225,581中，一种包含不同大小的异源性颗粒 混合物的组合物被描述为对于将吸附于聚合物颗粒表面的抗原运输 到体内是有用的。然而，这种疫苗的成功转运、抗原性和免疫原性没 有被阐述或展示。特别的，没有证据显示诱导了CD8T细胞应答， 或甚至参与了MHC I型呈递途径。颗粒的聚合物材料认为和上面讨 论的PLA或PLGA微颗粒具有相似的特性。\n因此，在本发明之前还不清楚，作为疫苗的一部分而被施用的颗 粒，其本身的大小是否能诱导免疫原性应答。\n在形成本发明的工作中，发明者惊奇地发现结合于抗原的、与病 毒大约一样大小的微颗粒能在研究对象上引起强烈的细胞和体液抗 体应答。\n发明概述\n在本发明的第一部分提供了一种免疫原性组合物，其包含结合于 微颗粒的至少一种抗原，其中微颗粒有着和病毒一样的大小范围。\n涉及免疫原性组合物使用的术语“包含”意思是组合物中包括抗 原和微颗粒。也可以包括其他成分。\n术语“抗原”指的是任何能引起免疫应答的分子、成分或实体。 免疫应答包括细胞和/或体液免疫应答。依赖于组合物设定的功能可 以包含一种或多种抗原。\n抗原可以是一种肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸或其他类 型的分子或任何的这些分子的组合。\n抗原可以来自病原体、组织、细胞、器官或分子，这依赖于组合 物设定的功能。可以是纯化的抗原，或是重组来源的，生产于合适的 载体如细菌、酵母菌或细胞培养。病原体例如可以是任何病原体、细 胞内或细胞外的、抗原成分或它们的部分、病毒、细菌或原虫来源、 如HIV、流感病毒、肝炎病毒、疟疾。特别的，本发明中采用的抗原 例子如下：花粉、丙型肝炎病毒、(HIV)核心、E1、E2和NS2蛋白、 来自疟原虫属的抗原、如间日疟原虫和其他疟原虫属包括恶性疟原虫 的环孢子蛋白(CS)和人恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫和 三日疟原虫、TRAP、MSP-1、MSP-2、MSP-3、MSP-4、MSP-5、 AMA-1、RESA、SALSA、STARP、LSA1和LSA3、HIV-gp120/160 包膜糖蛋白、链球菌表面蛋白抗原、流感核蛋白、血凝素-神经酰胺 酶表面感染、TcpA菌毛蛋白亚基、VP1蛋白、LMCV核蛋白、硕大 利什曼原虫表面糖化蛋白(gp63)、百日咳博德特氏菌表面蛋白、狂 犬病病毒G蛋白、链球菌M蛋白、葡萄球菌蛋白或幽门螺旋杆菌蛋 白、合胞体病毒(RSV)F或G蛋白、Epstein Barr virus(EBV)gp340 或核抗原3A、血凝素、博氏疏螺旋体外表面蛋白(Osp)A、结核 分支杆菌38kD脂蛋白或30kD蛋白(Ag85)、10kD或65kD蛋白、 脑膜炎奈瑟菌I型外蛋白、水痘带状疱疹IE62和gp1、风疹病毒壳 体蛋白、乙型肝炎病毒前S1抗原、疱疹单纯病I型糖化蛋白G或 gp D或CP27、墨累灰牛流域脑炎病毒E糖蛋白、甲型肝炎病毒 VP1、脊髓灰质炎病毒壳体蛋白VP1、VP2、VP3和VP6、沙眼衣 原体表面蛋白、乙型肝炎病毒包膜前S2抗原、人鼻病毒(HRV)壳 体、人乳头状瘤病毒来自癌基因E6和E7的肽、李斯特杆菌表面 蛋白、水痘病毒壳体蛋白、牛痘病毒包膜蛋白、布氏杆菌表面蛋白、 轮状病毒VP-3、VP-4、VP-5、VP-7和VP-8、上述一种或多种抗 原的组合、上述抗原的长度上包含5个或更多氨基酸的氨基酸亚基或 一个或多个上述亚基的组合。\n上述例举的病原体的裂解物或培养的过滤物也可以作为抗原。这 些片段可以是纯化的、浓缩的或稀释的形式、同样他们提供了抗原性 和或免疫原性。因此，根据本发明，这使得为患者特制免疫原性组合 物成为可能，通过将患者肿瘤裂解物或肿瘤蛋白的某一特定成分结合 到微颗粒上。\n抗原也可以来自任何肿瘤类型或恶性物。可以生成抗原的肿瘤类 型的例子是乳腺癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌和黑色素瘤。一些进一步 来源于肿瘤的特异性抗原的例子是黑色素瘤特异抗原(例如，MAGE 系列抗原)，来自结肠的癌胚胎抗原(CEA)，nm23癌抗原和其他癌 抗原或任何肿瘤中提取的真抗原，如粘蛋白如MUC-1到MUC-7抗 原。单独或组合的重组肽或蛋白也可以被利用。\n抗原也可以是合成的抗原决定簇，如基于上述提及的一种或多种 抗原的模拟物或肽样模拟物。\n术语“结合于”指的是微颗粒和抗原之间的连接。这可以是通过 吸附、或通过结合或共价偶联。优选的抗原共价连接于微颗粒。甚至 更优选的，抗原结合于微颗粒的表面。\n术语微颗粒指的是小颗粒。它可以是珠样或球样或其他任何合适 的形式。\n术语“病毒大小颗粒”(VSP)在本文中用于描述本发明的免疫 原性组合物的某个实施方案。应该明白术语VSP被采用仅仅是因为 便利，并不将本发明限制在已知的病毒大小。例如，和未知病毒一样 大小的颗粒也在本发明的预期之中。\n优选的，微颗粒具有实心的核心，给结合的或相连的抗原提供了 稳定性，区别于以往是空心或胶囊工艺的微球。方便起见，这里指的 病毒大小实心颗粒(VSSP)，其抗原出现在颗粒外面。用于制造VSSP 的颗粒可以从制造商得到且基本上是统一规格(也就是，在预定大小 的10％以内)。\n术语“实心的核心”指的是基本上实心(也就是颗粒不是空心的)。 微颗粒可以由任何合适材料构成只要它不减弱免疫原性组合物的功 能。因此微颗粒可以由乳胶、亚铁分子、金(如金的纳米颗粒)、玻 璃、磷酸钙、聚苯乙烯或可生物降解的和生物相容性的聚合物如PLG (聚赖氨酸g)构成。优选的，微颗粒由聚苯乙烯、PLG或金构成。 最优选的，微颗粒由聚苯乙烯构成。\n微颗粒有着和已知的病毒相同的大小范围。这意味着微颗粒是优 选的小于大约0.50μm。优选的如此大小的微颗粒适合于引起免疫应 答。尤其它适合于被人体研究对象或动物中的抗原呈递细胞所摄取。 更优选的，微颗粒在大约0.03和0.5μm之间，优选的在大约0.03和 0.15μm之间，仍更优选的在0.03和0.10μm之间。甚至更优选的微 颗粒在约0.03到0.05μm之间，更优选的，微颗粒在约0.03μm和 0.049μm之间。仍更优选的微颗粒在约0.03和约0.04μm之间或约 0.04和0.049μm之间。\n在优选的实施方案中，根据本发明应用的微颗粒群体，如用于单 次剂量免疫接种的微颗粒群体，是统一大小的。这意味着在约定群体 中的绝大多数颗粒是所指定的大小。\n优选的微颗粒/抗原组合物是特别适合于引起细胞和/或体液免疫 应答。细胞应答优选的选自TH细胞尤其是生成IFN和IL-4的T细胞、 CTL尤其是CD8CTL和B细胞的活化、成熟或增殖。\n优选的微颗粒/抗原组合物引发了MHC I型抗原呈递机制，抗原 通过包括内凹(caveole)和/或网格蛋白凹(pit)的迄今未知的机制被摄 取以通过Rab 4非依赖性和TAP依赖性过程来进一步处理，如在这里 的实施例4和7中解释的一样。体液应答优选地选自IgA、IgD、IgG、 IgM和它们的亚组。\n这种组合物也可以刺激那些有助于增强或放大免疫应答的细胞。 这些包括但不限制于APC如髓样或淋巴样两者来源的DC，和巨噬细 胞。这些细胞的成熟、活化或增殖是预期之中的，这些细胞上和T细 胞作用的共刺激配体或分子，如CD40、CD80和CD86也是如此。\n本发明的免疫原性组合物可以用于治疗、预防或防治抗原引起的 或与抗原接触相关的疾病或情况。例如，这种组合物可以用于特定的 癌症的治疗或预防。\n在本发明的另一部分提供了一种疫苗组合物，包括结合于微颗粒 的至少一种抗原，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围。本发 明的组合物尤其有用和有优点的是它是一种有效的单剂量疫苗，但是 也可以用于多剂量方案。\n因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种单剂量的疫苗组合 物，包括结合于微颗粒的至少一种抗原，其中所述微颗粒具有和病毒 一样的大小范围。\n“单剂量”是指在一次给予该组合物或疫苗后，体液和/或细胞 免疫应答被刺激或增强到最大水平(“最大”是指这种水平不能被重 复接种进一步增强)，或提供给这种组合物的受者以保护。施用可以 通过任何合适的方式，如通过经肌肉、经腹腔、经静脉注射、口服、 吸入、或通过黏膜表面或位置施用。\n优选的，抗原结合于微颗粒的表面。微颗粒的大小直径在约0.03 和0.5μm之间，优选的在约0.03到0.15μm，更优选的在约0.03到 0.1μm，甚至更优选的约0.03到0.05μm，甚至更优选的约在0.03 到0.049μm。仍更优选的0.03到0.04μm或0.04到0.049μm。微颗 粒最优选的由聚苯乙烯、PLG、玻璃、磷酸钙或金构成。在优选的实 施方案中，本发明应用的每种抗原都结合于固定大小的微颗粒上。\n在另一个实施方案，本发明提供了一种单剂量疫苗组合物，它能 增强体液和细胞免疫应答，组合物包括结合于微颗粒的至少一种抗 原，其中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围。\n细胞应答优选的选自TH细胞、CTL和B细胞的刺激、成熟或增 殖。体液应答是优选的选自IgA、IgG、IgM和它们的亚组。优选的， IgG、IgA和/或IgM应答被刺激。\n这种组合物也可以刺激那些有助于增强或扩增免疫应答的细胞。 这些包括但不限制于APC如髓样或淋巴样两者来源的DC、和巨噬细 胞。这些细胞的成熟、活化或增殖是预期之中的。\n术语“包含”有着和上面提及的相同的含义。\n术语微颗粒有着和上面提及的含义。优选的微颗粒适合于被动物 的抗原呈递细胞所摄取。优选的微颗粒在0.03和0.5μm之间，优选 的在0.03和0.15μm之间。更优选的微颗粒在约0.03和0.10μm之 间，更优选的微颗粒在约0.03μm和约0.05μm之间。仍更优选的微 颗粒在约0.03到0.049或0.04和0.049μm。\n术语“抗原”和“结合”有着上面提及的含义。可根据意欲进行 预防接种的情况/疾病应用任何合适的抗原。\n给予患者的本发明的疫苗组合物的量是非关键性的或非限制性 的。疫苗组合物的有效量是能刺激对抗抗原成分的免疫应答，优选的 在单剂量或给药后将引起强烈的细胞和体液应答。根据患者的免疫状 态(依赖于患者是否是免疫抑制或免疫刺激)，主治医师或兽医的判 断，是否该组合物被用作疫苗防治或治疗疾病状态，或作为防治肿瘤 形成的疫苗，或是否疫苗被用做治疗已经存在的肿瘤，给予的组合物 的量可以不同。例如，患者可以接受1μg到10,000μg的本发明的 组合物，更优选的50μg到5,000μg，仍更优选的100μg到1,000 μg和甚至更优选的100μg到500μg的本发明的组合物。佐剂通常 是不需要的，然而，佐剂可以用于接种。合适的佐剂包括明矾，和任 何其他佐剂或在应用于人的疫苗工艺中已经熟知的佐剂。\n本发明的疫苗可以通过注射施用，通过口服给药，或通过黏膜表 面或位置给药。在一个实施方案中，疫苗通过基因枪方式施用。根据 本发明如果应用亚铁微颗粒和金微颗粒是特别适合于通过基因枪施 用。然而，其他类型的抗原微颗粒可以按此方式给药。例如，来源于 疟疾基因库的抗原，根据Smooker PM等(《疫苗》18(22)：2522-2540 “表达基因库免疫保护小鼠对付毒性疟疾的挑战”)描述的方法， DNA或质粒已经显示是能被基因枪有效地施用。在此将其全文并入 作为参考。接种可以通过单或多剂量施用或通过接触抗原一加强而进 行。\n在本发明的另一实施方案提供了一个在研究对象上引发免疫应 答的方法，上述方法包括给予研究对象施用免疫有效量的包含至少一 种结合于微颗粒的抗原的组合物，其中所述微颗粒具有和病毒一样的 大小范围。\n研究对象可以是任何被要求去引发免疫应答的人或动物。这包括 家养动物、家畜(如牛、养、马、母牛、猪、山羊、美洲驼羊、家禽、 鸵鸟、鸸鹋)和本土和外来动物，野生动物和凶猛动物。\n术语“包含”有着和上面提及的相同的含义。\n免疫有效量指的是能在研究对象中产生免疫应答的有效剂量，优 选的在单次给予后产生免疫应答。免疫有效量的不同依赖于很多因素 包括上面讨论的，和可能依赖于研究对象是否是人或动物，它们的年 龄，体重等。\n术语“抗原”和“结合”有着和和上面提及的相同的含义。\n术语“免疫应答”指的是上面描述的细胞和体液应答，也是上面 描述的辅助增强或扩增免疫应答的细胞的应答。特别的，免疫应答可 以被树突状细胞的增殖和/或扩增来提供，尤其是DEC205+，CD40+ 和CD86+细胞，\n术语微颗粒有着和上面提及的相同的含义。\n优选的微颗粒在0.03和0.5μm之间，更优选的在0.03和0.1μ m之间。仍更优选的在0.03和0.1μm之间，甚至更优选的微颗粒在 约0.03μm和约0.05μm之间。甚至更优选的在约0.03和0.04或0.19 和0.049μm。仍更优选的抗原/微颗粒组合物特别适合于引发强烈的 细胞和或体液免疫应答。\n在一个优选的实施方案中，本发明提供了一个在研究对象上引发 免疫应答的方法，上述方法包括给予研究对象一个免疫有效量的包含 至少一种结合于微颗粒的抗原的组合物，其中所述微颗粒具有和病毒 一样的大小范围，并且免疫应答包括刺激和/或扩增树突状细胞。优 选的微颗粒是约40到50nm，最优选的是40到49nm大小。\n在另一个实施方案中，本发明提供了一个通过单剂量引发对抗原 的保护性免疫应答的方法，上述方法包括施用，仅是单次给予研究对 象，免疫有效量的、包括至少一种结合于微颗粒的抗原的组合物，其 中所述微颗粒具有和病毒一样的大小范围，并且免疫应答包括刺激和 /或扩增树突状细胞。优选的所述微颗粒是约40到50nm，最优选的 是40到49nm大小。\n在另一部分本发明提供了一种为了引发免疫应答在体内将抗原 转运入树突状细胞的方法，上述方法包括给予研究对象施用免疫有效 量的、包括至少一种结合于微颗粒的抗原的组合物，其中所述微颗粒 具有和病毒一样的大小范围，并且免疫应答包括刺激和/或扩增树突 状细胞。优选的微颗粒是约40到50nm，最优选的是40到49nm大 小。\n本发明也扩展到一种制造免疫原性微颗粒/抗原组合物的方法， 其包含将具有和病毒一样的大小范围的微颗粒与一种或多种抗原接 触，以使得微颗粒和抗原相结合。本领域技术人员应熟知用于制造这 种组合物的技术。\n发明的详细阐述\n本发明现在将参考下面的非限制性的实施例和图表来描述。\n图1：组A-巨噬细胞与树突状细胞比较对不同大小微颗粒的不同 摄取。每细胞1000个0.02，0.1或1微米的荧光珠与培养的、来自 C57BL/B6小鼠的腹膜渗出液的巨噬细胞或骨髓来源的树突状细胞一 起孵育过夜，FACSCan检测荧光细胞百分比。三个相似实验之一被 显示。用10倍的珠浓度，与珠或Balb/c来源的抗原呈递细胞作用3 小时，得到在摄取不同大小的珠上的类似的差异。组B-病毒大小的 颗粒在体内淋巴结的细胞中被优先发现。左边在脚趾处用50微升的 0.1％的不同大小(0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1和2微米)的荧光 珠溶液皮内接种于C57BL/B6小鼠，10天后取走引流的腘淋巴结，用 FACScan检测已摄取珠的细胞的百分比。数据用三次重复样本的平均 荧光细胞百分比/-标准误(SE)表示。0.04和0.1微米大小的颗粒有 着比其他任何大小的显著更高的摄取(p＞0.001)。在仅用0.1或1 微米珠的类似的实验中，0.1微米珠在接种后3，6，9天收集的淋巴 结中比1微米珠有着显著更高的摄取。组C和D-病毒大小颗粒被淋 巴结NLDC145+(也称为DEC205+)(组C)和F4/80+(组D)细胞 优先摄取。用FACScan分析已摄取荧光颗粒的淋巴结细胞的树突状 细胞标记NLDC145/DEC205或巨噬细胞/单核细胞标记F4/80的共表 达。数据显示归结于珠摄取而发出荧光的NLDC145+或F4/80+细胞 百分比。\n图2：组A-用结合于不同大小珠的OVA通过接种诱导产生干扰 素γ的CD8和CD4T细胞。用100μg结合于0.02，0.04，0.1，0.2， 0.5，1或2微米大小珠的OVA皮内接种C57BL/B6小鼠两次(间隔 10天)，用IFN γELISPOT检测追加接种10天后的脾T细胞活性。 测定对H-2Kb限制的CD8T细胞抗原决定簇SIINFEKL或整个OVA 的应答。对于检测对OVA的反应性，在检测前用磁珠(Dynabeads) 先消除脾细胞中的CD8T细胞再定量OVA反应性的CD4T细胞。应 用的SIINFEKL为2.5μg/ml和OVA为25μg/ml。三个相似实验之一 被显示。对于每种大小的珠每组中接种2只小鼠。ELISPOT培养被 重复两次，用每100万个被测定的细胞中的斑点形成单位(SFU)的 平均值表示。标准差(SD)一直小于平均值的20％。组B-反应于 SIINFEKL的通过ELISPOT检测的细胞毒活性的T细胞和分泌r干扰 素的T细胞之间的相关性。用不同大小的OVA珠接种C57BL/B6小 鼠，用上面描述的IFN γELISPOT检测对SIINFEKL的活性。此外， 通过有限稀释分析平行检测SIINFEKL特异的细胞毒活性的T细胞数 目。带铬的EL4细胞本身或用2.5μg/ml的SIINFEKL预处理的EL4 细胞被用做靶细胞。显示的数据说明了两个检测之间的强相关性(R 平方＝0.9254)。两个相似实验之一被显示。组C-用结合于不同大小的 珠的OVA接种诱导抗体产生。从组A中描述的小鼠中收集血清，用 ELISA检测稀释血清的OVA特异性IgG应答性。接受0.02，0.04， 0.1，0.2，0.5，1或2微米大小的OVA珠接种的个体小鼠被标记。两 个相似实验之一被显示。\n图3：抗原共价结合于珠对于诱导理想的T细胞应答是必要的。 组A-珠结合的OVA本身说明I型MHC限制性T细胞应答。用OVA 共价结合的先前未透析的(对照)或用PBS通过300Kd分离膜透析 的(透析)0.04微米珠接种C57BL/B6小鼠，用ELISPOT检测一次 皮内接种10天后对生成干扰素γ的脾SIIFEKL特异性CD8T细胞的 诱导。用在两次重复实验中ELISPOT检测的每组4只小鼠的平均值 +/-标准误表示。组B-合用珠和可溶性OVA不能诱导理想的MHC I 型限制性的T细胞应答。用共价结合于0.1微米珠的OVA(珠结合 的OVA)或注射前与OVA混合的珠(珠/OVA混合)接种C57BL/B6 小鼠。用ELISPOT检测一次皮内接种10天后对生成干扰素γ的脾 SIIFEKL特异性CD8T细胞的诱导。两次重复实验中ELISPOT检测 每组中两只小鼠的平均T细胞前体频率被显示。\n图4：用病毒大小的珠-OVA的单次接种能有效地诱导持久的高 水平的I型MHC限制性的T细胞。组A-用珠-OVA(0.1微米)皮内 接种C57BL/B6小鼠1次，2次或3次，每次14天间隔，用ELISPOT 检测每组最后一次接种10天后它们的干扰素γ对SIINEKL的应答。 每组中有3只小鼠被接种，数据显示每个小鼠两次实验的平均值。两 个相似实验之一被显示。组B-用珠-OVA(0.1微米)接种一次小鼠， 并在12天或82天后通过ELISPOT测定干扰素γ对SIINFEKL或OVA 的应答。如图2显示测定对OVA的抗体水平保持到第82天。\n图5：检测皮内接种后引流淋巴结内摄取珠的细胞的CD40的表 达。来自纯种C57BL/6小鼠(左)或用荧光0.04μm荧光珠皮内接 种于脚趾的小鼠的腘淋巴结在注射后48小时被分离，用PE结合的对 这些标记物特异的抗体的染色来分析CD40的表达。FL-1＝FITC阳性 细胞(珠阳性)和FL-2＝PE阳性细胞(标记物阳性)。背景染色可 以忽略(小于1％)。左边组表示来自非接种动物的腘淋巴结细胞， 右边组表示来自VAP-OVA接种动物的相同类型细胞。\n图6：0.1μm OVA-珠诱导成熟和不成熟小鼠DC的增殖。DC培 养来自从C57BL/6小鼠后腿的胫骨和股骨提取的骨髓细胞，加有 GM-CSF和IL-4。培养5天后，细胞按1.25x 106细胞/1.25ml被分成 实验条件和与每细胞1000珠的结合有OVA的珠(0.1μm)处理。4 小时处理后，在培养物中加入LPS和a干扰素。细胞继续培养过夜， 胸腺嘧啶核苷增殖分析设定在第二天，孵育过夜。每个数值代表三次 的平均值/-标准误(未处理的DC和实验组之间的*p＜0.00001，非 配对t检验)。\n图7：在脚趾处注射有50μl 0.04或1μm荧光珠-OVA的C57BL/6 小鼠体内摄取0.04μm和1μm颗粒的APC表型特征的比较。48小 时后分析引流的腘淋巴结的珠阳性细胞的活性与抗原呈递细胞系的 细胞标记物的共染色。用3-14只小鼠/标记物的平均值/-标准差表示。 0.04和1μm荧光珠阳性细胞有着显著不同的DEC205、F4/80、 CD40、CD80和CD86(p＜0.05)的表达。\n图8A：DC摄取病毒大小的颗粒的机制。骨髓来源培养的DC与 0(黑色)、5(白色)、10μM(灰色)的乙酰肉豆蔻佛波醇(PMA)； 0(黑色)、1(白色)、3mM(灰色)的阿米洛利(amiloride，AML) 或0(黑色)、0.25(白色)或0.5μg/ml(灰色)的松胞菌素D(cytochalasin D，CCD)孵育30分钟，然后加入0.04μm的OVA荧光颗粒继续3 小时。选择性抑制内凹、网格蛋白包被的小凹形成或吞噬已经在10 μM PMA、3mM阿米洛利和0.5μg/ml CCD中被报道，相应的14， 15。当同时使用时，PMA恒定在10μM，而加入AML 1(白色)或 3mM(灰色)。用FACScan检测荧光细胞数目。数据用三次培养的 平均值+/-标准误表示。\n图8B：确认摄取的机制。DC在有或无1μg/ml CDD、1μg/ml 非律平(FIL)或40mM氯化铵(AC)条件下孵育30分钟，加入0.04 μm或1μm的荧光珠继续3小时。选择性抑制内凹或网格蛋白有被 小凹形成在1μg/ml非律平和40mM氯化铵中被报道，相应的14-17， 29。用FACScan检测荧光细胞数目。数据用三次培养的平均值+/-标 准误表示。\n图9：可溶性OVA和1μmOVA珠不能诱导与0.05μmOVA-珠 能相比较的保护。C57/B6小鼠用结合于0.05μm或1μm珠的OVA、 可溶性OVA接种或不处理，然后如上比较。数据用每组8个动物在 第10天时个体肿瘤大小来表示。两次相似实验之一被显示。0.05μ mOVA-珠组和其他任何一组的肿瘤频率的差异是显著的：P＝0.0001 对未处理组；P＝0.0007对可溶性组和P＝0.0035对1μmOVA-珠组。\n图10：病毒大小的颗粒不能和早期内体共存(左侧)。骨髓来源 的DC和0.1微米珠-OVA(500珠/细胞)孵育过夜，轻轻洗涤以洗去 游离珠，涂在玻璃载片上用于共聚焦显微镜。细胞然后用多聚甲醛固 定，用triton增加通透性，用生物素结合的早期内体标记物Rab4的 单克隆抗体染色，再加入抗生蛋白链霉素-Alexa。在未结合的0.04和 0.1微米的珠中观察到了相似的结果，显示了三个实验之一。用DC 和珠孵育30分钟或3小时，0.1微米珠同样不能和Rab4染色共存(右 侧)。将0.1微米的珠-OVA皮内注射在小鼠的后脚趾，48小时后切除 引流的腘淋巴结如上用于共聚焦分析。Rab4标记物和OVA结合或未 结合的0.1微米或0.04微米珠没有发现有共存。显示了三个实验之一。 相反的，在用1微米大小的荧光珠接种的阳性对照小鼠中确定有共 存。\n图11：保护性对抗肿瘤。组A用OVA-VSSP(接种)单次皮内 接种或未处理(纯种)的C57/B6小鼠30天后用5x106EG7(肿瘤细 胞)挑战。用测径器测定肿瘤大小。显示了每组10只动物个体的肿 瘤生长曲线。组B肿瘤如上诱导，在第8天的肿瘤生长(第0天接 种)，6只动物未处理(纯种)和6只用OVA-VSSP皮内接种(接种) 显示了接种后3-13天个体的生长曲线。\n图12：VSSP接种后小鼠经受致命疟疾挑战的生存率。用100μ gVSSP-OVA、VSSP-裂解物或裂解物本身皮内接种C57/B6小鼠，再 将之用500,000致命性约氏疟原虫17XL感染的C57/B6红细胞挑战。 每天监测生存率。每组感染5只动物，六个代表性实验之一被显示。 在相似实验中，纯种小鼠在2周后有40％生存率(8/20)。将约氏疟 原虫17XL感染的红细胞反复冻融得到裂解物，超速离心，用标准方 法结合到VSP上。\n图13：按上面对抗原OVA描述的将抗原nm23被结合到0.05μ m珠(VSP)，100μg/小鼠皮内注射到小鼠，10天后用ELISPOT检 测接种动物脾中干扰素γ应答性。应答于nm23的前体细胞频率的数 据用每100万脾细胞的斑点形成单位来表示，平均值的标准误。三只 小鼠(m1-m3)的个体应答被显示。\n图14：每方案中肿瘤抗原nm23或OVA被结合到VSP，100μ g/小鼠皮内注射。10天后用ELISPOT检测白介素4分泌细胞的诱导。 数据用每种免疫原接种的三只独立小鼠的斑点形成单位/百万细胞+/- 标准误表示。\n图15A：用结合有OVA的0.05μm珠(VSP-OVA)单次皮内接 种小鼠血浆对OVA的抗体反应性，90天后用ELISA(B组)检测与 未接种对照(A组)的比较。\n图15B：用ELISA检测来自图15A中小鼠的相同血浆中的OVA 特异IgE抗体，在两个纯种小鼠(A2和A3)和三个VSP-OVA小鼠 (B2，3和5)。\n图16：组A单次接种诱导持久的抗体应答。C57/B6小鼠用OVA 结合的0.04μm珠单次接种，在不同的时间点收集血浆。显示了OVA 特异的IgG的ELISA里，每组4个动物在405nm的平均光密度+/- 平均差。未经免疫的血浆作为阴性对照。两次相似实验之一被显示。 相似的ELISA结果在总Ig中得到，没有IgM或IgA被检测到(未显 示)。OVA单独不能诱导PBS接种的动物的IgG应答，在完全Freund 佐剂(CFA)中的OVA诱导的IgG应答比单剂量0.05μm珠-OVA对 数级更高(未显示)。组B用0.04μm珠-OVA单次接种对持久的高 水平的生成干扰素γ的T细胞的诱导。用结合于0.04μm珠的OVA (黑色或格子柱)，PBS中的可溶性OVA(白色柱)或用混合于0.04 μm珠的OVA(灰色柱)皮内接种C57/B6小鼠。用IFN γELISPOT 检测10天后(黑、白和灰色柱)或12月后(格子柱)的SIINFEKL 活性脾T细胞的前体细胞频率。每组中有四只小鼠被测定，两次相似 实验之一被显示。每组的每100万细胞的斑点形成单位(SFU)的平 均值+/-标准差被显示。在相似实验中，用降低10倍的抗原(10μg VSP-OVA)单次接种诱导出每100万的102+/-56SIINFEKL特异性脾 细胞(n＝4)。单次接种的10天后在标准的铬释放检测中也观察到了 细胞毒T细胞应答(对于3/3动物大于50％特异性裂解在E∶T＝20∶ 1，没有显示)。\n图17：初始/追加接种C57/B6动物分成未处理组或最初用100 μg来自MUC1的肽cp13-32，其在完全Freunds佐剂(cp13)中结 合到700g的KLH，或用结合到重组MUC1-GST融合蛋白(MFP) 的甘露聚糖，或用0.1μm结合到MUC1-GST融合蛋白的VSP(VSP)， 进行皮内注射。10天后动物被用100万有传染性的表达MUC1蛋白 的痘病毒再次加强接种，10天后用IFNγELISPOT检测对Cp13-32 抗原簇的反应性。数据用每组2-3动物平均的每100万脾细胞中产生 IFN-γ细胞的平均数目+/-平均差来表示。\n图18：比较聚苯乙烯和玻璃的0.05μmVSP-OVA颗粒。聚苯乙 烯0.05μm珠如上所述被结合到OVA(PS)并与以同样方式结合到 玻璃珠的OVA(G1)作比较。另外，一种不同的化学操作比较于玻 璃珠。简言之，玻璃珠被称量，悬浮在PBS中形成2.5％固体，洗涤 2遍。在微量离心机中离心5分钟去除PBS。珠被重悬在8％戊二醛 的pH值7.4的PBS溶液中，在室温下轻轻混合过夜。珠用PBS再 洗涤3遍，重悬在PBS中。加入每毫升500ug的蛋白，轻轻混合5 小时。珠被沉淀，将沉淀物重悬在0.5M的氨基乙醇中混合30分钟而 终止反应。用PBS洗涤珠并用于接种(G2)。将聚苯乙烯(PS)或 玻璃(G1或G2)的VSP-OVA按100μg/小鼠的量皮内接种，10天 后ELISPOT定量化来源于脾的SIINFEKL特异性分泌干扰素γT细 胞。数据用每组三只动物的个体平均值+/-标准差表示。\n图19：珠结合形式和免疫原性。50mM MES缓冲液(pH 6.0) 中的2mg/ml卵白蛋白与聚苯乙烯羟基修饰的0.05μm的珠(2％固体) 混合15分钟。在每份制备物中加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)- 碳二亚胺到4mg/ml(pH 6.5)，在室温下孵育2小时。标准(甘氨酸) 用7mg/ml甘氨酸或20μl 1 M pH 7.4的氨基乙醇(胺)，或20μl 1M pH 8.0的胺乙醛二甲基乙缩醛(醛)，或20μl 1M pH 7.4的乙二胺 (醇)淬火。制备物在室温下孵育近16小时。所有的制备物在4℃ 下PBS中透析过夜。醛的制备物进一步用20μl 1M HCL淬火并孵育 4小时，在4℃下PBS中透析过夜。用100μg每种VSSP-OVA颗粒 皮内接种2-3只C57/B6小鼠，用干扰素γELISPOT检测脾中针对 CD8T细胞抗原决定簇SIINFEKL的免疫原性。结果用每只动物中每 100万脾细胞中斑点形成单位的平均值/-标准差来表示。\n实施例1：使用的材料和方法\n小鼠和接种：6-8周大小的C57BL/6和BALB/c小鼠都购自 Walter和Eliza Hall。小鼠以100ul的抗原结合珠皮内(ID)接种在 后脚趾。\n试剂：所有试剂包括抗原卵白蛋白(OVA，III级)和1-乙基-3- (3-二甲基胺丙基)碳二亚胺(EDAC)，除非另外说明都购自Sigma 公司。用于FACScan和共聚焦研究的单克隆抗体来自在蛋白G柱 (Pharmacia)上自杂交瘤系自制(in house)纯化或购自Pharmigen。 FITC结合的和羧化的0.02-2μm荧光球都购自Molecular Probes，非 荧光的羧化微球购自Polysciences。使用了以下标记物的抗体：MHC II、MHCI、CD11c、CD11b、F4/80、NLD-145、CD8alpha、 CD40、CD80和CD86。共聚焦研究中使用的抗Rab4单克隆抗体是 Dr.Russel(Peter McCallum Research Institute)的惠赠品。\n抗原呈递细胞：树突状细胞制备于骨髓单核细胞按以前发表的方 法稍加改动[5]。简要的，通过用培养基将细胞从后肢的胫骨和长骨的 骨腔中冲洗出来，收集后接着裂解红细胞。细胞按1x106/ml种植在 RPMI(CSL、AUST)中，其中含有10％热灭活的胎牛血清(FCS)， 4mM L-谷酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、100μ M巯基乙醇、1000U/ml GM-CSF和0.2ng/ml的白细胞介素-4。在 直径100mm的petri-dishes中的10ml培养基在潮湿的CO2孵箱中37 ℃下生长5-6天。在腹膜内注射硫胶质3天后从小鼠的腹膜腔内获得 巨噬细胞，如所述方法培养3天来富集粘附细胞组分。\n珠-抗体结合按生产商说明进行。简要的，OVA在0.05M MES 缓冲液pH6.0中稀释为2.0mg/ml，和2％固体/体积的珠按体积比1： 1混合。轻轻摇动混合液15分钟，然后加入4mg/ml E DTA。用稀释 的NaOH将混合液pH值调整为6.5。轻轻摇动混合液2到3小时。 加入甘氨酸使得其终浓度为100mM以终止反应。混合30分钟后，制 备物在冷PBS中透析过夜。制备物可以马上使用或与0.01％叠氮化物 储存在4℃备用。\n细胞毒检测：按[3]描述的方法进行。简要的，用于细胞毒检测的 效应细胞为脾细胞，在2ml培养皿按2.5x106/ml在37℃、潮湿的CO2 孵箱，和含10μg/ml肽抗原的RPMI(CSL、AUST)培养基中培养7 天，其中含有10％热灭活的胎牛血清(FCS)，4mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素和100μmβ-巯基乙醇。白介素 2(10U/ml，重组人白介素2，Lymphocult HT、Biotest、UK)在第 三天加入。靶细胞是51Cr标记的EL4细胞，单独(背景)或在37℃ 下和10μg/ml SIINFEKL肽预处理1小时，或EG7，一种卵白蛋白转 化的EL4细胞株。除非另外说明，检测在效应细胞：靶细胞比为20： 1下重复2次。在四次重复实验中对所有靶细胞都设定了自发裂解(仅 有培养基)和最大裂解(有5％triton)。4小时后收集上清。裂解％计 算为100x(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)。特异裂解 ％(SL％)为肽裂解％-无肽裂解％。\n细胞毒T细胞前体(CTLp)检测：CTLp检测按以前描述的[7] 进行。对于至少6个效应细胞数目(1x103-1.28x105)，要至少32次 重复以得到CTLp频率。5x105丝裂霉素C处理过的同源脾细胞被培 养在U底的微量滴定盘上的含有10％胎牛血清、5μM SIINFEKL 或OVA和10U/ml重组人白介素2的DMEM中。7天后，用以含 有104 51Cr标记的EL4或EG7细胞为靶细胞的100μl靶细胞悬液取 代100ml的培养基来检测每个微培养的细胞毒性。如果发现每个盘中 Cr的释放在仅和刺激物共培养的104个效应细胞或仅和肽或仅和重组 人白介素2的刺激细胞中的平均同位素释放值的3个标准误之上，那 么认为存在细胞毒活性。在应答细胞数目之间存在着线性关系(0.987 ≤r2≤1)，表现为线性曲线，阴性细胞频率为对数曲线。CTLp频 率用达到产生37％阴性孔的应答细胞剂量的倒数表示。CTLp频率检 测进行3次，每次频率差异不超过平均值的20％。\nELISPOT IFNγ检测：按[3]描述的进行。简要的，100μl的 5x106/ml新近分离的脾细胞和设定的刺激物在预包被抗小鼠IFN γ单 克隆抗体(R4)的乙酸板(MAHAMillipore)上培养18小时(EACC)。 每个条件都设置复孔。应用的培养基为RPMI1640(CSL)，附加物同 上描述。过夜培养后，细胞被洗涤，板和第二种生物素结合的抗小鼠 IFNγ单克隆抗体(XMG.21-生物素、Pharmigen、CA、USA)孵 育，之后结合1μg/ml的extravidin碱性磷酸酶(A-AP)(Sigma)。用 比色法AP检测试剂盒((Biorad、Hercules、CA、USA)检测碱性 磷酸酶活性斑点，利用解剖显微镜计数。数据用每百万细胞的斑点形 成单位表示。使用的SIINFEKL肽为2.5μg/ml。\n统计分析：在保护性研究中，每组受保护的小鼠数目的比较用 Epilnfo Version 5.0的STAT程序的卡方检验。在免疫原性研究中，组 间的ELISPOT和Cr释放应答的比较用MicrosofExcel Version 5.0a中 的Student′s t检验。线性回归用于检测免疫原性和保护性之间的相关 性用SPSS for Windows统计软件包，\n树突状细胞和巨噬细胞摄取珠：在显微镜玻片上的生长3天的巨 噬细胞培养物和5天的树突状细胞培养物用不同大小的荧光微珠孵 育5分钟到24小时。培养物被洗涤以去除游离的珠和准备用于 FACScan或共聚焦分析。\n体内摄取珠的细胞分析：从珠接种的小鼠中从接种后12小时直 到12天间隔不同时间收集其引流的淋巴结和脾。收集细胞，裂解红 细胞后洗涤，准备用于FACScan或共聚焦分析。\n细胞表面标记物染色和流式细胞分析：对于表面染色，5x105细 胞与PE标记的抗表面标记物F4/80和NLD-145、CD的单克隆抗体 孵育。对于那些不能被直接标记的抗体，两步洗涤后，细胞和对第一 种抗体特异的第二种PE标记的抗体孵育。在和第二种抗体孵育之前 的封闭步骤中使用生产第二种抗体的物种的天然血清。两次洗涤后， 细胞用PBS/0.2％多聚甲醛洗涤，用FACScan流式细胞仪 (Becton-Dickinson)和CeIlQuest软件分析。设定光栅门以去除死细 胞和非淋系细胞。来自珠接种的未经任何表面标记染色的细胞和来自 天然小鼠经对表面标记的PE标记抗体染色的细胞用于确定FITC和 PE发射谱之间重叠的校正。\n吞噬FITC标记的珠的共聚焦显微镜检测：使用Olympus镜头的 共聚焦显微镜，带有Krypton-Argon激光光源，装备有双重的荧光和 发射检测来确定是否不同大小的荧光珠被巨噬细胞或树突状细胞吞 噬。将标本制成0.5-1.0微米尺寸的的系列切片以确定吞噬作用和用 Optiscan分析仪分析。细胞在488nm和568nm被激活相应荧光素和 Alexa594，相应的通过530nm和610nm区带滤过片来检测。所有的 采集中，激光能保持在饱和水平以下，增益和补偿参数在单一实验中 固定。\nELISA检测：用ELISA测定反应于OVA的抗体。聚氯乙烯板用 OVA(10μg/ml在0.2M NaHC03缓冲液、pH 9.6)4℃包埋过夜。 板用PBS/0.05％Tween20洗涤4遍和PBS洗涤4遍，利用2％小牛血 清白蛋白非特异性结合在室温下封闭1小时。如上洗涤后，加入小鼠 血清的系列稀释液，室温下孵育1小时。非免疫小鼠的血清作为阴性 对照。板被洗涤，用辣根过氧化物酶结合的羊抗小鼠Ig(Selinus、 AUS)和显色底物2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉)磺酸(Amersham、 UK)检测结合的抗体。用EL 312e微量反应板读取器记录在405nm的 吸光度。\n实施例2：体内和体外抗原呈递细胞对VSSP的优选摄取。\n大量利用来自巨噬细胞/单核细胞系的研究已经显示颗粒大小依 赖性的吞噬作用，理想的摄取是1微米直径[10，11]。在树突状细胞 中也观察到了摄取，然而，颗粒大小的综合范围还没有被测定。发明 者尤其感兴趣于是否病毒大小的蛋白包被的颗粒(0.03-0.1μm)也能 被树突状细胞或巨噬细胞有效地摄取。图1a显示硫胶质引发的腹膜 渗出液的巨噬细胞内吞了1μm和0.1μm的荧光素标记的颗粒(荧 光素珠)。相反的，发现未成熟的骨髓来源的树突状细胞优先摄取 0.1μm大小的荧光素珠。共聚焦显微镜用于确认颗粒在细胞内(未 显示)。这体内数据提示病毒大小的实心颗粒(VSSP)在体内也能 被抗原呈递细胞优先摄取。一组不同大小(0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、 1和2μm)的荧光素聚苯乙烯蛋白结合的颗粒被皮内注射到C57/B6 小鼠的脚趾中。10天后收集引流淋巴结的细胞用于FACScan分析。 0.04-0.1μm大小的颗粒被淋巴结细胞优先摄取(图1b)。分析颗粒注 射后的第1、3、6和10天的淋巴结细胞和未结合的颗粒取得了相同 的结果。VSSP被同时表达巨噬细胞和树突状细胞表面标记物的抗原 呈递细胞有效摄取(图1b)。骨髓来源的树突状细胞体外也摄取VSSP。 和预想的一样，这些细胞主要是髓系表型的[12]。\n实施例3：VSSP诱导高的细胞毒和IFN γ分泌T细胞的前体频率和 抗体\n体内树突状细胞对VSSP的有效摄取提示它们可以用作靶抗原的 转运和新疫苗的潜能。用卵白蛋白(OVA)包被的0.02、0.04、0.1、 0.2、0.5、1或2μm颗粒接种C57/B6小鼠，15天后追加接种，10 天后收集血清或脾细胞。图2a显示用0.04μm大小的颗粒获得了对 MHC I型限制性SIINFEKL抗原决定簇诱导的IFNγ分泌CD8T细 胞的满意诱导。应答于OVA的CD4T细胞发现有着于OVA结合的 范围在0.04-1微米的颗粒相似的前体频率。VSSP诱导的对SIINFEKL 的细胞毒T细胞和IFN γ分泌T细胞的前体频率相关(R2＝0.92)(图 2b)。OVA特异IgG在用0.04μm接种的小鼠具有最高的前体频率， 其次为用1μm颗粒接种的小鼠中。用无荧光素的VSSP也发现了相 似的结果。因此，与许多免疫原和佐剂优选地启动细胞或体液应答不 同，VSSP对两者都能诱导出高水平的应答。\n图2显示的结果是基于注射相同总量的结合抗原，但未消除残留 的可溶性抗原。图3a显示在可溶性抗原被透析或超速离心去除后， 用0.04微米VSSP获得了相似的T细胞应答。因此，可溶性抗原对 于观察到的T细胞应答没有显著的作用。这也被结合和未结合OVA 和VSSP混合物的比较所支持。图3b显示只有共价结合的VSSP能 诱导高水平的SIINFEKL特异性T细胞。因此，共价结合到VSSP对 于在体内将OVA导入I型呈递途径和诱导I型限制性的T细胞是必 要的。能推测更大量的结合蛋白在更小的颗粒比在更大的颗粒能产生 更高的VSSP免疫原性。然而，不是这样，因为：1)0.04μm为免疫 原性高峰，而0.02μm大小的珠诱导出的反应性极低(图2)；2) 0.04-0.1微米的VSSP比1μm颗粒一直具有更高的免疫原性，而不 论结合抗原的水平；3)将1μm颗粒的接种浓度增加到所用VSSP 的浓度的100倍(到1mg/小鼠)也不能将免疫原性增强到在结合于 VSSP的一定浓度范围的抗原上看到的水平；4)用等效价量的不同大 小的珠上的结合蛋白，或用相同数目的不同大小的珠接种，一直显示 VSSP比浓度范围广泛(0.5-1000μg总OVA、0.5-50μg结合的OVA and 103-108珠/动物)的更大的颗粒有着更高的免疫原性。\n实施例4：颗粒摄取和加工的新途径\n已经显示：通过II型MHC加工途径消化形成的肽能被返流并最 终结合到细胞表面空置的I型MHC分子[1，10]。I型呈递的不同机 制是独立于TAP(抗原加工相关转运子)介导的进入内质网(ER) 的转运。乙型肝炎病毒表面蛋白VLP在巨噬细胞内通过非TAP依赖 性机制被加工成I型呈递[2]。发明者用OVA-结合的VSSP接种敲除 TAP的C57/B6小鼠，在TAP敲除动物中没有检测到对SIINFEKL或 OVA的上述背景水平的T细胞应答，这提示对VSSP的I型呈递相反 的是TAP依赖的。对于吸收进1μm颗粒的蛋白，外源性抗原的I型 呈递的TAP依赖性机制已经被描述成基于内饮囊泡的“渗漏”和抗 原偶然地释放到细胞浆内[1，10]。被吞噬作用摄取的如此大的颗粒的 加工包括了与表达Rab4衔接子蛋白的溶酶体早期结合的步骤[13]。 本发明者用共聚焦显微镜确定是否VSSP将按这个途径进行。图4显 示Rab4和含VSSP荧光珠的囊泡在骨髓来源的培养的树突状细胞和 皮内注射VSSP 24小时后体内的淋巴结细胞中都没有共存。因此， VSSP可能利用一种不同于VLP和更大颗粒的加工途径，它是Rab4 非依赖性和TAP依赖性的。机制在实施例7中进一步研究。\n实施例5：VSSP在体内和体外诱导抗原呈递细胞扩增。\nC57/B6或不处理或用荧光素0.1μm荧光珠在脚趾皮内接种。在 注射48小时后切除腘淋巴结(LN)，通过用PE结合的CD40特异 性抗体染色分析该标记物的表达。\n结果(图5)显示：0.04，0.05，0.1μm聚苯乙烯珠单独或结合 到OVA能增加皮内接种后来自引流淋巴结的细胞总数达4倍。此外， 它们能引起NLDC145+(树突状细胞标记物)细胞的比例增加1.5倍， 但对F4/80+(单核细胞/巨噬细胞标记物)细胞则不能。它们也增加 表达活性分子CD40和CD86的淋巴结细胞的比例大于1.5倍。图5 显示用FACScan观察到接种后增加CD40+细胞的例子(33％到66％)。 也显示这些细胞中的许多已经摄取0.04μm珠，在这里我们使用的绿 色荧光素核心的0.04μm珠。\n0.04，0.05和0.1μm的聚苯乙烯珠本身或结合到OVA能诱导纯 化于小鼠骨髓的树突状细胞在体外的扩增。不成熟的，而非成熟(LPS 和alpha肿瘤坏死因子活化后)的树突状细胞对于VSSP的激活效应 是敏感的(图6)。\n这些数据综合提示，0.04-0.1μm大小的颗粒(VSSP)有着不可 质疑的、前所未知的刺激抗原呈递细胞的能力，包括树突状细胞，和 表达象CD40和CD86的有效共刺激分子的特殊细胞的增殖和扩增。 另外，这提示VSSP对于免疫应答可能有佐剂效应的机制，甚至是对 于那些非化学性地与其结合的抗原所引起的应答。\n实施例6：注射后快速摄取VSSP的细胞的扩展表型\n为了进一步评价哪类细胞在皮内脚趾注射后快速地摄取VSSP (因此可能有关于随后的免疫激活)，切除了引流的腘引流淋巴结。 FACScan分析摄取了带有荧光素核心的0.04μmVSSP-OVA的细胞表 型，并与相同的但为1μm大小的颗粒比较。图7显示表达每种表型 标记物的0.04μm珠阳性或1μm珠阳性细胞比例。摄取0.04μm珠 的细胞最大多数是NLDC145+，CD40+和CD86+。另外，更多的CD11 c+、CD4+和CD8+细胞是0.04μm珠阳性多于1μm珠阳性。这种 已经摄取了0.04μm珠的细胞的高度激活的DC表型可能进一步解释 我们观察到的免疫应答是如此有效的原因，尤其是CD8T细胞应答。\n实施例7：微颗粒的摄取和加工\n为了明确树突状细胞摄取0.04μm珠-OVA的机制，将骨髓来源 的DC和吞噬作用的抑制物(松胞菌素D，CCD)，网格蛋白小凹的 抑制物(阿米洛利，AML)或内凹介导的内饮作用的抑制物(乙酰 肉豆蔻佛波醇，PMA)一起孵育。将DC分别和设定浓度的PMA、 AML、CDD、非律平(FIL)或氯化铵(AM)(都来自Sigma)在三个 复孔中培养30分钟。加入OVA-荧光素0.04μm珠继续3小时，用 FACScan检测摄取。\nPMA和AML都减少了DC对0.04μm珠-OVA的摄取，但是 CCD不能造成任何的抑制(图8a)。PMA和AML的抑制具有相加 作用(图8a)。这提示网格蛋白小凹和内凹都参与了VSSP的摄取。\n阿米洛利作用是抑制对于受体介导的内饮所必要的Na+-H+交换 [14]。本发明者另外试验了通过干扰细胞浆酸化作用而抑制网格蛋白 小凹装配的氯化铵，氯化铵抑制了0.04μm而不是1μm大小的珠的 摄取(图8b)，确认了网格蛋白小凹在VSSP摄取上的作用。内凹也 被提示是介导了DC摄取病毒颗粒的新的机制[15]。本发明者用PMA 的结果提示内凹参与了DC摄取VSSP(图8a)。为了确认这点，本 发明者使用了另一种内凹的抑制物，非律平。非律平通过降解胆固醇 起作用，PMA影响了磷酸化作用而调节内凹内饮作用[14，15，16， 17]。与PMA类似，非律平阻断了0.04μm而不是1μm珠的摄取， 确认了本发明者的假设(图8b)。\n内凹和网格蛋白小凹能将分子转送到内体和溶酶体的区域[14， 16]。或者，内凹可以将抗原直接转运到细胞浆[17]导致细胞浆的加工 和ATP依赖的转运进内质网以用于I型MHC的呈递。\n这些结果，和实施例4中显示的结果一起，说明了根据本发明所 表现的一种新的加工抗原的途径。本发明的免疫原性组合物表现为被 抗原呈递细胞通过内凹和或网格蛋白小凹摄取，之后抗原被Rab4非 依赖性和TAP依赖性的途径加工用于I型MHC的呈递。本发明关于 内凹诱导TAP依赖性的抗原呈递途径和CD8细胞的能力是新颖的， 以前没有报道过。\n实施例8保护效应的比较\n将50nm(也就是0.05μm)(VSSP)的OVA结合颗粒与OVA 单独或1000nm(也就是1μm)OVA结合颗粒进行对照，以直接比 较其在小鼠保护性对抗随后皮下注射100,000表达OVA的肿瘤细胞 (EL4)挑战的能力。所有的小鼠用100μg上述的一种(或没有＝未 处理)皮内接种一次，然后在30天后用肿瘤挑战。图9a显示 VSSP-OVA完全阻止了表达OVA的肿瘤的生长，OVA单独或1000nm 珠的保护效应不显著。\n实施例9：单次VSSP免疫诱导了高水平的免疫力和对保护性对 抗肿瘤的挑战\n用OVA结合的VSSP皮内接种诱导了产生IFN γ干扰素的细胞 毒性SIINFEKL特异性T细胞(图10a和1a和b)。在接种82天后T 细胞能保持高的前体频率(图10d)。抗体应答同样被保持着(图16)。 单次VSSP接种获得的CD8T细胞前体频率比单次甚至多次VLP颗 粒接种观察到的更高，唯与高效异源的初始/追加方案相当[1，2，3， 19，20]。高的产生IFN γ和细胞毒T细胞前体频率与保护性对抗许 多细胞内病原体和肿瘤相关[21，22，23]。本发明者用单一皮内剂量 的OVA结合的VSSP接种C57/B6小鼠，然后用EG7肿瘤细胞株挑 战它们，EG7细胞株表达细胞浆内的OVA并是细胞毒SIINFEKL特 异性T细胞的体外靶细胞。结果显示VSSP接种的小鼠完全保护性对 抗了肿瘤的挑战，而所有的未处理对照组都出现了肿瘤。另外，随着 抗原结合VSSP的单次注射，抗体水平也增加，和在图2c中观察到 的相似。\n关于VSSP疫苗进一步的工作。\n下面描述的实施例10到13正式示范了VSSP能和不同的抗原一 起使用并诱导广泛的免疫力，包括生成干扰素和白介素4的T细胞。 单次剂量后被诱导的是高水平的IgG，而不是有潜在的过敏性的IgE。\nVSSP对于治疗的有效性还表现在另外两个模式上。1)100％清 除存在的肿瘤(见实施例10)和2)在单次疫苗注射后对致命性疟疾 的保护性对抗(见实施例11)。这进一步确定了VSSP做为一种具有 不同寻常的效果和可变通的免疫接种方案，可以发展为对抗不同疾病 的单剂量疫苗。此外，基于这些发现，本发明者相信VSSP可以被用 于肿瘤的治疗和预防。\n实施例10：清除已存在的肿瘤\n本发明者已经观察到用珠-OVA单次接种完全保护性对抗了随后 表达OVA的肿瘤的挑战。\nC57/B6小鼠用100μg珠(0.05μm)-OVA(皮内注射)单次接 种或不处理。30天后，用5x106EG7肿瘤细胞株挑战小鼠。在接种的 3-13天后用测径器测定肿瘤大小。为回顾性研究，用EG7细胞种植 小鼠，8天后分为相同肿瘤大小分布的组。一组不处理，另一组3天 后(也就是在注射肿瘤细胞株11天后)用珠-OVA接种。\n本发明者现在表明对存在肿瘤负荷的小鼠进行单次接种能治愈 已经存在的肿瘤。在单次注射的2周后，肿瘤已被从接种的小鼠上清 除。这个治疗能力对于任何肿瘤疫苗都是极其不寻常的，这使得这个 疫苗载体对于发展治疗性疫苗是有很大希望的(图11B)。\n粘蛋白-1或Mucl是乳腺癌相关抗原。用VSSP-Mucl蛋白单次 接种能抑制用表达乳腺癌抗原的肿瘤细胞株挑战的小鼠的肿瘤形成 (见图11A)。\n实施例11：保护性对抗疟疾\n本发明者证明直径0.05μm的聚苯乙烯珠可以用做载体在小鼠 中诱导对疟疾的保护性对抗。来自约氏疟原虫感染的红细胞的裂解物 被结合到珠上，用于接种小鼠，然后用致死剂量的寄生虫挑战小鼠。\n在50％寄生虫血症时收集感染了约氏疟原虫17XL的C57BL/6 小鼠的血液。离心800g 15分钟获得的红细胞被冻融3次和超声裂解。 裂解物如上所述被结合到0.05μm颗粒上。珠-裂解物，珠-OVA或裂 解物本身被皮内注射。在两周后用1,000,000个约氏疟原虫感染的 红细胞腹腔内注射，挑战接种的或未处理的C57BL/6小鼠。\n所有经上述处理的动物均在挑战中存活下来，而60％的仅用裂解 物(没有珠结合)接种的动物不能控制感染而死亡(图12)。这是单 剂量疫苗能用于实现对血液阶段疟疾的保护性对抗的第一个证明。单 剂量疫苗对于在第三世界广泛存在的疟疾和其他疾病是特别有吸引 力的，因为它简化了疫苗的注射和分发，可以保证覆盖广泛的人群。\n实施例12：细胞免疫\n1)直径0.05μm的聚苯乙烯珠结合了不同于OVA的抗原，如 肿瘤抗原nm23，也能诱导强烈的细胞免疫，如对分泌干扰素γ的T 细胞的高水平的诱导(图13)。\n2)和诱导细胞免疫一样，珠-OVA或珠-nm23诱导了高水平的 IL4(图14)。这个淋巴因子启动了抗体的生成，这可以解释为什么 我们观察到了良好的抗体诱导以及细胞免疫(需要干扰素γ)。\n实施例13：抗体免疫\n1)直径0.05μm的聚苯乙烯珠结合到OVA在单次皮内(ID) 注射后诱导了高滴度的IgG抗体(图15A)。\n2)除了高IgG水平，没有出现可测定的IgE水平。因此，这 个疫苗形式上证明没有诱导潜在的有害的IgE应答(因为它们参与过 敏)的危险。\n实施例14：通过不同途径施用并诱导IgG与IgA抗体\n为了确定将疫苗施用于人的有用途径，如上面描述的皮内给药、 小鼠被通过腹膜内、皮下、鼻内和直肠内给予VSSP结合的OVA (100ug/小鼠)。在单次接种30天后测定每组中的3-4只小鼠。与皮 内相似，ELISPOT检测到了所有途径均诱导了对于SIINFEKL或OVA 的分泌γ干扰素的T细胞(1/50,000到1/2,000脾细胞)。令人惊讶的 是，与用皮内注射的最初观察到的诱导了高水平的IgG但是很少或没 有IgA相反，这些途径给予的VSSP-OVA诱导了血清IgA应答，直 肠内和鼻内途径没有诱导可检测的IgG(滴度小于1/100)(表1)。因 此，通过直肠内、腹膜内、鼻内和皮下途径，VSSP能用于诱导对疾 病的保护性免疫，其中IgA扮演着保护作用，如粘膜感染(如肺内， 宫颈或肠道)。\n表1\n  途径   血清IgG滴度   血清IgA滴度   直肠内   ＜1/100、＜1/100、   ＜1/100   1/1280、1/640、1/1280   腹膜内   1/1640、1/100、1/400   ＞1/5120、＞1/5120、   ＞1/5120   鼻内   ＜1/100、＜1/100、   ＜1/100、＜1/100、   1/160、1/320、   1/320、1/640   皮下   1/800、1/200、1/6560   ＞1/5120、＞1/5120、＞   1/5120\n在两次剂量后的不同寻常的高IgG应答：\n用VSSP-OVA(100μg/小鼠，14天间隔)接种两次，引起了如 ELISA所检测到的令人惊异的滴度超过1/500,000的高水平血清Ig 和IgG抗体生成。用乳腺癌抗原nm23和疟疾抗原MSP4/5结合到 VSSP接种后，所得到的特异性IgG抗体的结果与此相似。\n实施例15：持久的免疫应答\nVSSP-OVA引起的应答出乎意料的长久。图16显示在单次皮内 接种(100μg/小鼠)1年后仍存在ELISA可测定的强OVA特异性IgG 抗体(组A)和干扰素γELISPOT可测定的应答于SIINFEKL的CD8 T细胞(组B)。组B还表明为了得到理想的免疫原性，抗原必须是 共价结合在实心颗粒上。\n实施例16：异源性初始/追加接种\n在未用，或用来自完全Freund佐剂的MUC1的肽cp13-32(cp13)， 结合有MUC1的甘露聚糖(重组MUC1-GST融合蛋白)(M-FP)或 0.1μmVSSP-MUCI(重组MUC1-GST融合蛋白)(VSSP)初始接 种的动物上追加接种牛痘-MUC1。图17显示比较于那些单独接受牛 痘-MUC1的动物(未处理/V比较VSSP/V)，对于MUC1的肽13-32 区段的应答在VSSP-MUC1初始，牛痘-MUC1追加组中增强。因此 VSSP抗原对于用于异源性初始-追加免疫方案是适合使用的。\n实施例17：VSSP实心核心的材料构成\n本发明者的假设是：0.04-0.05μm大小的实心核心是VSSP免疫 原性的首要决定因素，推测在这个大小范围内由除聚苯乙烯外的其他 材料构成的颗粒也将是高度免疫原性的。因此，她比较了给小鼠单次 皮内接种由聚苯乙烯(PS)或玻璃(G1或G2)构成的0.05μm的颗 粒的免疫原性，所述颗粒用相同的化学操作(G1)结合到OVA或用 戊二醛(G2)结合。图18表明聚苯乙烯和玻璃构成的VSSP都有相 似的高的免疫原性，包括ELISPOT检测到的、对SIINFEKL产生干 扰素γ的T细胞的高前体频率。因此，对于蛋白结合的VSSP的实心 核心能用玻璃和聚苯乙烯提供，预测其他用于实心核心的材料也是有 功能的，例如PLG。\n实施例18：抗原和VSSP的结合\n结果显示将抗原和0.05μm的颗粒混合使之比抗原本身具有更 多的免疫原性，但是共价结合对于理想的免疫原性是必要的。因此用 于将抗原结合到VSSP的化学操作理论上是免疫原性的决定因素。特 别的，颗粒的整体电荷将促进与特异血清或其他内源蛋白的反应。这 些反过来理论上能促进树突状细胞的摄取和引起高免疫原性。为了对 此进行测定，小鼠用具有不同表面电荷的50nm(也就是0.05μm) 的颗粒接种。OVA-VSSP有整体负电荷归结于使用了羧化修饰的纳米 颗粒和在OVA与甘氨酸结合后对活性羧酸基团的猝灭(甘氨酸，图 19)。通过与氨基乙醇猝灭反应，除结合后的OVA的净电荷以外的 电荷能被中和(乙醇，图19)。通过乙二胺的猝灭引进了阳性电荷 (胺，图19)。通过氨基乙醛二甲基乙缩醛(醛，图19)的猝灭引 入潜在有用的醛基团。所有对结合方案的三种修饰形成高免疫原性的 颗粒，与甘氨酸和醛比较，胺和乙醇修饰是稍小的免疫原性。由于在 颗粒中引入相反的电荷仍产生相同的免疫原性，因此不大可能由非特 异性吸附血清蛋白产生免疫原性。另外，可以采用一些对于结合过程 作出的选择性修饰和改变电荷，且不改变免疫原性。\n讨论\n考虑到上面的结果，本发明的组合物提供了一种进一步提高或改 良用于不同的感染，癌或其他疾病的疫苗或接种策略的方法。\nVSSP的理想大小和大多数已知病毒相同(30-150nm)。使用 VSSP具有生物学的重要意义是具有吸引力的设想。从上述观察，本 发明者相信免疫系统可以被启动去完全应答于VSSP大小范围内的颗 粒。在本发明之前，不知道或不了解免疫应答的刺激很大程度上依赖 于那些在病毒范围内的免疫刺激物的大小，尤其当来自其他病原体如 细菌，真菌的抗原决定簇是非常的大。的确，通过这途径的靶抗原不 可思议地引发了广泛的(包括免疫系统的体液和细胞两方面)和强烈 的应答(诱导快速持久的高效应T细胞前体频率)，提示免疫系统可 以被启动完全应答于病毒大小的颗粒。以往利用VLP(也就是没有连 接于颗粒的纯抗原)包括HepB表面蛋白或酵母菌逆转录蛋白(Ty) 的研究也已经显示单次接种剂量诱导了广泛和持久的免疫，尽管应答 是比用VSSP低10-100倍[1，2，3，19，20]。然而已经假设除了大 小外的其他的特性，如其脂质或甘露聚糖成分，或膜结合蛋白形成了 VLP诱导I型限制性T细胞应答的能力[1]。不希望被理论所限制， 本发明者认为在体内通过VSSP将有效的靶抗原合并于抗原呈递细胞 如树突状细胞，之后通过VSSP上的蛋白裂解造成的抗原缓慢潜在的 释放可能形成特别有力的免疫原。\n在OVA模型中单次接种剂量保护性对抗了随后的肿瘤细胞的挑 战的能力证实了利用VSSP做为新疫苗。本发明者也已经观察到对乳 腺癌表达抗原，粘蛋白1(MUC1)的广泛和强烈的免疫原性和保护。 在它们的动物研究中利用的注射的皮内途径在人类中可以容易实现。 VSSP因此可以提供了一种特别具有吸引力并简单的人类疫苗发展的 策略，尤其对那些体液和细胞免疫参与产生保护的疾病，如疟疾、癌 和病毒疾病，特别的，AIDS和肝炎[10，12，21，25-28]。靶向于I 型呈递途径的重组抗原也提供了诱导针对多种抗原决定簇的T细胞 应答的可能性，因此将扩展这些疫苗在MHC多变的靶向人群中的使 用。\n目前，有效的CTL刺激物激活DC是通过离体处理DC，但是这 是昂贵的和相当困难的。本发明提供了一种在体内将抗原有效地传递 给DC的不同方法，导致随后的高数目的抗原特异性CD8T细胞和免 疫保护的诱导。在0.04-0.05μm狭窄大小范围内的VSSP可诱导不可 思议的高水平的CD8T细胞的能力是抗原呈递细胞或有效亚群的有 效摄取的结果，靶向于I型加工途径和/或直接的刺激APC功能。在 淋巴结中发现比较于其他大小，VSSP的摄取被增强了。这种增强归 功于增加的颗粒阳性的DEC205+细胞(一种DC的标记物)的频率。 树突状细胞是一种强有力的抗原呈递细胞，且CD60与CD80的表达 进一步确定可能有效的启动CD8T细胞的亚群。这些标记物在高比 例的VSSP阳性细胞被发现。因此，在体内在这个潜在的DC亚群摄 取和选择性定位VSSP可以解释根据本发明的微颗粒的免疫原性。\n本发明的VSSP的其他优点包括诱导免疫应答，包括通过多种途 径注射后IgA的生成的能力，和它们对于初始/追加免疫策略的合适 性。\n进一步的研究将包括利用VSSP确定使得它们引发获得的独特免 疫应答的生理机制。\n需要理解的是，本领域技术人员在不脱离于本发明的核心概念 下，可以获得这里描述的本发明的其他不同的实施方案。\n参考文献：\n1.Reimann J，Shirmbeck R.加工能生成用于MHCI型限制性呈递 的肽的外源性和内源性抗原的旁路途径。Immunol.Rev.1999；172： 131-152.\n2.Schirmbeck R，Melber K，Reimann J.乙型肝炎病毒小表面抗原 颗粒通过新的内体途径被加工为了主要组织相容性复合物I型限制性 抗原决定簇的呈递。Eur.J.Immunol.1995；25：1063-1070.\n3.Plebanski M，Gilbert SC，Schneider J，Hannan CM，Layton G， Blanchard T，Becker M，Smith G， Butcher G， Sinden RE，Hill AV.通过用 适合于人类使用的重组载体的单一I型限制性抗原决定簇初始和追加 激活T细胞保护berghei疟原虫的感染。Eur J Immunol 1998；28： 4345-55.\n4.P，Johansen，B.Gander，HP Merkle and D Sesardic，微颗粒疫苗 临床前期质量评价的不定性。TIBTECH 2000，18：203.\n5.Lu L，McCaslin D，Starzl TE，Thomson AW.骨髓来源的DC前 体细胞(NLDC 145+、MHC II+型、B7-1 dim、B7-2-)诱导了小鼠T 淋巴细胞的异型抗原特异性的低应答性。Transplantation 1995；60： 1539-45.\n6.Plebanski.淋巴细胞制备和淋巴细胞中淋巴亚群的确定：1999 年实践探讨；Edited by Rowland-Jones，SL and McMichael，AJ：1-26.\n7.Pietersz GA，Li W， Popovski V，Caruana J-A，Apostolopoulos V， McKenzie IFC.利用甘露聚糖-MUC1融合蛋白诱导细胞免疫的参数。 Cancer Immunol Immunother 1998；45：321-326.\n8.Fazekas de St.Groth S.有限稀释检测的评价。J immunol 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