一种γ-氨基丁酸的制备方法

1.一种γ-氨基丁酸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
将经过培养的γ-氨基丁酸生产菌株接种到发酵罐培养基中，进行有氧、厌氧两段组合发酵，第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1∶0.8的通风速率流入发酵罐培养基中，搅拌转速为300rpm；维持溶氧浓度为65～75％，温度控制在31℃，好氧培养18小时，当细胞光密度O.D.值达到28时，转入第二阶段厌氧发酵，厌氧培养直至发酵结束，厌氧阶段温度控制36℃，添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5.8，发酵40小时，得到γ-氨基丁酸；
在进行发酵培养之前，所述γ-氨基丁酸生产菌株先进行下述培养步骤：
1)平板培养：采用玉米芯水解液加氮源为平板培养基，将γ-氨基丁酸生产菌株接到含玉米芯水解液的平板培养基中，30℃培养24小时；
2)摇瓶种子培养：将平板培养的γ-氨基丁酸生产菌株接到含玉米芯水解液的摇瓶种子培养基中，33℃培养20小时，pH控制在5.5，摇床转速220rpm；
3)种子罐种子培养：将摇瓶种子培养基培养的γ-氨基丁酸生产菌株接到含玉米芯水解液的种子罐培养基中，33℃培养15小时，pH控制在5.0，搅拌转速100rpm，通风比
1∶0.7；
所述将经过培养的γ-氨基丁酸生产菌株接种到发酵罐培养基中为按体积比5％将种子罐培养的γ-氨基丁酸生产菌株接到发酵罐培养基中；
所述平板培养基包括下述重量百分比的组分：玉米芯水解液20％，酵母膏0.4％，蛋白胨0.8％，玉米浆0.3％，琼脂2％，其余为水；
所述摇瓶种子培养基包括下述重量百分比的组分：玉米芯水解液20％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.7％，玉米浆0.2％，其余为水；
所述种子罐培养基包括下述重量百分比的组分：玉米芯水解液30％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.5％，玉米浆0.2％，其余为水；
所述发酵罐培养基包括下述重量百分比的组分：玉米芯水解液20％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.2％，玉米浆0.5％，MgSO4·7H2O 0.002％，MnSO4 4H2O 0.005％，KH2PO4 0.03％，丁二酸钠0.6％，L-谷氨酸钠6％，其余为水；
所述玉米芯水解液含有8％的葡萄糖和2％的木糖及少量阿拉伯糖；
所述γ-氨基丁酸生产菌株为乳短杆菌Lactobacillus brevis CGMCC NO.1306。

一种γ-氨基丁酸的制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物发酵领域，本发明涉及一种γ-氨基丁酸的制备方法。\n背景技术\n[0002] γ-氨 基 丁 酸(γ-Aminobutanoic acid，简 称 GABA)又 名 4-氨 基 丁 酸(4-Aminobutanoica cid，4-AB)，γ-氨酪酸，分子式为C4H9NO2，相对分子量103.2，是一种白色或近白色结晶性粉末，极易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、苯、乙醚，熔点(mp)：\n203-204℃(分解)，熔化分解成毗咯烷酮和水，GABA的解离常数：pKCOOH＝4.03，pKNH3＝\n10.56，无旋光性。\n[0003] GABA是一种以自由态广泛存在于原核生物和真核生物的非蛋白质氨基酸。神经生理及神经医学的研究表明，GABA是中枢神经系统的抑制性传递物质，它是脑组织中最重要的神经递质之一，是在人脑能量代谢过程中起重要作用的活性氨基酸，它具有激活脑内葡萄糖代谢，促乙酰胆碱合成，降血氨，抗惊厥，降血压，恢复脑细胞的功能。最新的研究表明，GABA还有精神安定作用、肾机能和肝机能改善作用、促进酒精代谢作用和消臭以及高效减肥等作用。GABA既可以开发成为一种具有显著药理作用的药物，又可以开发成为一种具有保健性的食品，前景非常乐观。\n[0004] GABA可以在专一性较强的谷氨酸脱羧酶作用下由谷氨酸转化而成，但GABA的积累会随着年龄的增长而变得困难，日常饮食可以有效改善这种情况，以有利于人体的健康。\n[0005] 由于GABA天然存在量低，很难从一些天然组织中大量提取分离，目前获得GABA的方法是化学合成法和生物法两大类，其中生物法包括植物中富集和微生物发酵法两种。\n[0006] GABA的化学合成已有百余年历史，主要是以邻苯二甲酰亚氨钾和γ-氯丁氰在强烈条件下(180℃)反应，产物与浓硫酸一起回流，再经过结晶提纯而得。另一种方法是通过吡咯烷酮经氢氧化钙、碳酸氢铵水解制得。总的来说，化学合成法制备GABA由于在生产工艺中使用了一些腐蚀性较强的溶剂，反应条件剧烈，以及得率较低等原因，使其很难在食品加工生产中得以应用，所得产品也不能被认为是一种天然的食品添加剂，存在一定的安全隐患。\n[0007] 植物中GABA富集与其所处的逆境条件下的应激反应有关，这些应激反应包括低+ 2+\n氧、低温、干旱、高H 浓度、机械损伤、黑暗和虫害等。逆境条件下，细胞内Ca 浓度快速增\n2+\n高，导致GABA的积累，而积累的GABA反过来刺激细胞内Ca 的继续释放，从而加大了植物体对逆境的反应。\n[0008] 发酵法是以L-谷氨酸钠为转化底物，添加碳源、氮源以及无机盐组成发酵培养基，利用γ-氨基丁酸生产菌株转化制备γ-氨基丁酸。相比而言，化学合成安全性较差，植物富集的GABA含量很低，而微生物发酵合成GABA就显得具有开发前景的。\n发明内容\n[0009] 本发明的目的是提供一种γ-氨基丁酸的制备方法，以提高γ-氨基丁酸的产率，降低生产成本。\n[0010] 本发明提供一种γ-氨基丁酸的制备方法，其包括如下步骤：\n[0011] 将经过培养的γ-氨基丁酸生产菌株接种到发酵培养基中，进行有氧、厌氧两段组合发酵，第一阶段为好氧发酵阶段，控制pH5.5～6.0，维持溶氧浓度为60～90％，温度控制在30～32℃，好氧培养10～20小时，当细胞浓度即光密度(O.D.)达到15～30时，转入第二阶段厌氧发酵，厌氧培养直至发酵结束，厌氧阶段温度控制在35～38℃，发酵40～\n50小时，即得到γ-氨基丁酸。\n[0012] 所述γ-氨基丁酸生产菌株为乳短杆菌CGMCC NO.1306(Lactobacillus brevis CGMCC NO.1306)。\n[0013] 所述发酵培养基中碳源为玉米芯水解液、植物秸秆水解液或甘蔗渣水解糖中的一种或几种及L-谷氨酸钠。\n[0014] 氮源为酵母膏，蛋白胨，玉米浆，尿素，硫酸铵，麸皮水解液或豆粕水解液中的一种或几种。\n[0015] 发酵培养基除添加碳源和氮源外，还需要添加下述重量百分比的其他无机离子成分：MgSO4·7H2O 0.001～0.003％，MnSO4·4H2O0.004～0.006％，KH2PO40.02～0.07％，丁二酸钠0.5～0.7％。\n[0016] 优选的是，发酵罐培养基包括下述重量百分比的组分：玉米芯水解液20～30％，酵母膏0.2～0.4％，蛋白胨0.1～0.3％，玉米浆0.4～0.6％，MgSO4·7H2O 0.001～\n0.003％，MnSO4·4H2O 0.004～0.006％，KH2PO40.02～0.07％，丁二酸钠0.5～0.7％，L-谷氨酸钠5～7％，其余为水。\n[0017] 其中，本发明所采用的玉米芯水解液的制备过程为：\n[0018] 1)玉米芯酸解：将玉米芯在体积百分浓度0.1～10％的硫酸溶液中进行水解得酸解液，水解温度为40～250℃，水解时间5～600分钟；\n[0019] 2)固液分离：酸解液固液分离，获得富含木糖的第一糖液和玉米芯酸解渣；\n[0020] 3)酸解渣酶解：用纤维素酶、木聚糖酶或纤维二糖酶中的一种或多种，对玉米芯酸解渣进行酶水解，得酶解液；酶用量为：每克酸解渣2～100PFIU纤维素酶，1～50IU纤维二糖酶，10～500PFIU木聚糖酶；酶解过程中控制pH为2.0～7.0，温度为20～80℃，酶解时间为10～240小时；\n[0021] 4)固液分离：酶解液固液分离得到富含葡萄糖的第二糖液和富含木质素的酶解渣。\n[0022] 第二糖液即为本发明所采用的玉米芯水解液，其中含有6～8％的葡萄糖和2～\n3％的木糖及少量阿拉伯糖。\n[0023] 本发明在第一阶段好氧发酵过程中，通过将无菌空气以通风比为1∶(0.8～1.2)的通风速率流入发酵培养基中，搅拌转速为300～500rpm，控制溶氧浓度60～90％。\n[0024] 所述发酵培养基pH调节剂选自氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钙、氢氧化钙中的一种或多种。\n[0025] 本发明发酵过程中经有氧、厌氧两个阶段将发酵温度从30℃升至38℃。\n[0026] 具体地说，本发明的一种玉米芯水解液制备γ-氨基丁酸的方法，其包括如下步骤：\n[0027] 1)平板培养：采用玉米芯水解液加氮源为平板培养基，将γ-氨基丁酸生产菌株接到含玉米芯水解液的平板培养基中，30℃培养18～26小时；\n[0028] 2)摇瓶种子培养：将平板培养的γ-氨基丁酸生产菌株接到含玉米芯水解液的摇瓶种子培养基中，30～33℃培养20～24小时，pH控制在5.0～5.5，摇床转速180～\n220rpm；\n[0029] 3)种子罐种子培养：将摇瓶种子培养基培养的γ-氨基丁酸生产菌株接到含玉米芯水解液的种子罐培养基中，接种量为5～10％(v/v)，30～33℃培养15～20小时，pH控制在5.0～5.5，搅拌转速75～100rpm，通风比1∶(0.6～0.8)；\n[0030] 4)发酵罐培养：将种子罐培养基培养的γ-氨基丁酸生产菌株接到含有玉米芯水解液的5L发酵罐中进行有氧、厌氧两段组合发酵，第一阶段为好氧发酵阶段，控制pH5.5～\n6.0，维持溶氧浓度为60～90％，温度控制在30～32℃，好氧培养10～20小时，当细胞浓度即光密度(O.D.)达到15～30时，转入第二阶段厌氧发酵，厌氧培养直至发酵结束，厌氧阶段温度控制在35～38℃，发酵40～50小时，即得到γ-氨基丁酸。\n[0031] 其中，所述平板培养基包括下述重量百分比的组分：玉米芯水解液20～30％，酵母膏0.3～0.5％，蛋白胨0.7～0.9％，玉米浆0.2～0.4％，琼脂2％，其余为水。\n[0032] 所述摇瓶种子培养基包括下述重量百分比的组分：玉米芯水解液20～30％，酵母膏0.3～0.5％，蛋白胨0.7～0.9％，玉米浆0.2～0.4％，其余为水。\n[0033] 所述种子罐培养基包括下述重量百分比的组分：玉米芯水解液20～30％，酵母膏\n0.2～0.4％，蛋白胨0.4～0.6％，玉米浆0.1～0.3％，其余为水。\n[0034] 本发明经发酵结束后，可将发酵液经过交换树脂吸附，浓缩、结晶，得γ-氨基丁酸晶体。\n[0035] 本发明的γ-氨基丁酸制备方法利用玉米芯水解液发酵生产γ-氨基丁酸，其根据该种微生物在生长、代谢的不同阶段对氧气、各种营养元素、各种碳源、氮源的需求差异进行有氧、厌氧发酵。发酵过程中分段控温，在对氧的需求上采取分段调控的手段，使得γ-氨基丁酸在厌氧状态下代谢产生γ-氨基丁酸。\n[0036] 本发明的γ-氨基丁酸制备方法具有以下有益效果：\n[0037] 1)本发明的生物发酵法是利用以粗放的含有葡萄糖和木糖的玉米芯水解液为底物来生产菌体，将玉米芯水解液变废为宝，降低了环境污染，并可有效降低γ-氨基丁酸的生产成本。\n[0038] 2)生物技术生产γ-氨基丁酸是在微生物细胞里谷氨酸脱羧酶将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸，生产过程简单、安全、节能，是一种很有前途的生产方法。\n[0039] 3)本发明发酵技术采用有氧、厌氧两段组合发酵，发酵过程中分段控温，在对氧的需求上采取分段调控的手段，使得γ-氨基丁酸生产菌株在厌氧状态下代谢产生γ-氨基丁酸，分段通风和高温发酵，缩短了发酵周期，减少了冷却水用量，降低了成本，提高了γ-氨基丁酸的产率。\n[0040] 4)生产过程简单、安全、节能，还避免了传统方法中的腐蚀性溶剂的使用，保护了环境。\n具体实施方式\n[0041] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。\n[0042] 实施例1\n[0043] 本实施例所采用的玉米芯水解液的制备过程为：\n[0044] 1)玉米芯酸解：将玉米芯在体积百分浓度5％的硫酸溶液中进行水解得酸解液，水解温度为200℃，水解时间300分钟；\n[0045] 2)固液分离：酸解液固液分离，获得富含木糖的第一糖液和玉米芯酸解渣；\n[0046] 3)酸解渣酶解：用纤维素酶、木聚糖酶或纤维二糖酶中的一种或多种，对玉米芯酸解渣进行酶水解，得酶解液；酶用量为：每克酸解渣50PFIU纤维素酶，30IU纤维二糖酶，\n200PFIU木聚糖酶；酶解过程中控制pH为7.0，温度为60℃，酶解时间为240小时；\n[0047] 4)固液分离：酶解液固液分离得到富含葡萄糖的第二糖液(即玉米芯水解液)和富含木质素的酶解渣。玉米芯水解液含有8％的葡萄糖和2％的木糖及少量阿拉伯糖。\n[0048] 本实施例的γ-氨基丁酸制备过程如下：\n[0049] 先将γ-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO.1306(Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306)接到含玉米芯水解液20％，酵母膏0.4％，蛋白胨0.8％，玉米浆0.3％，琼脂\n2％的平板培养基中，30℃培养24小时。\n[0050] 然后采用平板培养的γ-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液20％，酵母膏\n0.3％，蛋白胨0.7％，玉米浆0.2％的液体种子培养基中培养，pH控制在5.5，摇床培养20小时，摇床转速220rpm，培养温度33℃。\n[0051] 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解液30％，酵母膏0.3％，蛋白胨\n0.5％，玉米浆0.2％的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度33℃，pH控制在5.0，搅拌转速100rpm，无菌空气通风比1∶0.7(v/v)，培养周期15小时。\n[0052] 种子罐种子培养好后按5％(v/v)接种量接种于含有玉米芯水解液20％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.2％，玉米浆0.5％，MgSO4·7H2O0.002％，MnSO4·4H2O 0.005％，KH2PO40.03％，丁二酸钠0.6％，L-谷氨酸钠6％的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1∶0.8的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为\n300rpm，维持溶氧浓度(DO)为65～75％，温度控制在31℃，好氧培养18小时，当细胞浓度即光密度(O.D.)达到28时，转入第二阶段发酵；在第二阶段为厌氧发酵阶段，厌氧培养直至发酵结束，温度控制在36℃。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5.8，发酵40小时，γ-氨基丁酸产率达到3.7％。\n[0053] 发酵结束后，将发酵液经过D061型交换树脂吸附，最佳吸附条件为pH＝4.0，温度\n40℃，平衡吸附时间17min，吸附量为0.83mol/L。γ-氨基丁酸发酵液上样的流速为1BV/h。\n洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L，流速为1BV/h。经旋转蒸发仪浓缩、醇沉结晶后，可得γ-氨基丁酸晶体，其回收率达到80％。\n[0054] 实施例2\n[0055] 本实施例的γ-氨基丁酸制备过程如下：\n[0056] 先将γ-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO.1306(Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306)接到含玉米芯水解液20％，酵母膏0.4％，蛋白胨0.8％，玉米浆0.3％，琼脂\n2％的平板培养基中，30℃培养26小时。\n[0057] 然后采用平板培养的γ-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液25％，酵母膏\n0.4％，蛋白胨0.8％，玉米浆0.2％的液体种子培养基中培养，pH控制在5.2，摇床培养20小时，摇床转速220rpm，培养温度33℃。\n[0058] 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解液30％，酵母膏0.3％，蛋白胨\n0.5％，玉米浆0.2％的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度30℃，pH控制在5.5，搅拌转速75rpm，无菌空气通风比1∶0.8(v/v)，培养周期16小时。\n[0059] 种子罐种子培养好后接种于含有玉米芯水解液20％，酵母膏0.3％，蛋白胨\n0.2％，玉米浆0.5％，MgSO4·7H2O 0.001％，MnSO4·4H2O0.005％，KH2PO40.04％，丁二酸钠\n0.6％，L-谷氨酸钠6％的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1∶0.9的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为300rpm，维持溶氧浓度(DO)为60～70％，温度控制在31℃，好氧培养18小时，当细胞浓度即光密度(O.D.)达到\n28时，转入第二阶段发酵；在第二阶段为厌氧发酵阶段，厌氧培养直至发酵结束，温度控制在36℃。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5.7，发酵50小时，γ-氨基丁酸产率达到3.9％。\n[0060] 发酵结束后，将发酵液经过D061型交换树脂吸附，最佳吸附条件为pH＝4.0，温度\n40℃，平衡吸附时间17min，吸附量为0.83mol/L。γ-氨基丁酸发酵液上样的流速为1BV/h。\n洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L，流速为1BV/h。经旋转蒸发仪浓缩、醇沉结晶后，可得γ-氨基丁酸晶体，其回收率达到80％。\n[0061] 实施例3\n[0062] 本实施例的γ-氨基丁酸制备过程如下：\n[0063] 先将γ-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO.1306(Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306)接到含玉米芯水解液25％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.8％，玉米浆0.3％，琼脂\n2％的平板培养基中，30℃培养18小时。\n[0064] 然后采用平板培养的γ-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液20％，酵母膏\n0.3％，蛋白胨0.7％，玉米浆0.4％的液体种子培养基中培养，pH控制在5.5，摇床培养24小时，摇床转速180rpm，培养温度30℃。\n[0065] 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解液25％，酵母膏0.2％，蛋白胨\n0.5％，玉米浆0.2％的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度33℃，pH控制在5.2，搅拌转速80rpm，无菌空气通风比1∶0.8(v/v)，培养周期15小时。\n[0066] 种子罐种子培养好后接种于含有玉米芯水解液25％，酵母膏0.2％，蛋白胨\n0.1％，玉米浆0.5％，MgSO4·7H2O 0.001％，MnSO4·4H2O0.006％，KH2PO40.05％，丁二酸钠\n0.6％，L-谷氨酸钠6％的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1∶0.8的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为500rpm，维持溶氧浓度(DO)为70～80％，温度控制在31℃，好氧培养10小时，当细胞浓度即光密度(O.D.)达到\n20时，转入第二阶段发酵；在第二阶段为厌氧发酵阶段，厌氧培养直至发酵结束，温度控制在37℃。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5.8，发酵40小时，γ-氨基丁酸产率达到3.5％。\n[0067] 发酵结束后，将发酵液经过D061型交换树脂吸附，最佳吸附条件为pH＝4.0，温度\n40℃，平衡吸附时间17min，吸附量为0.83mol/L。γ-氨基丁酸发酵液上样的流速为1BV/h。\n洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L，流速为1BV/h。经旋转蒸发仪浓缩、醇沉结晶后，可得γ-氨基丁酸晶体，其回收率达到80％。\n[0068] 实施例4\n[0069] 本实施例的γ-氨基丁酸制备过程如下：\n[0070] 先将γ-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO.1306(Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306)接到含玉米芯水解液30％，酵母膏0.4％，蛋白胨0.9％，玉米浆0.2％，琼脂\n2％的平板培养基中，30℃培养20小时。\n[0071] 然后采用平板培养的γ-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液25％，酵母膏\n0.5％，蛋白胨0.9％，玉米浆0.3％的液体种子培养基中培养，pH控制在5.0，摇床培养24小时，摇床转速200rpm，培养温度33℃。\n[0072] 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解糖20％，酵母膏0.3％，蛋白胨\n0.5％，玉米浆0.2％的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度33℃，pH控制在5.4，搅拌转速100rpm，无菌空气通风比1∶0.6(v/v)，培养周期20小时。\n[0073] 种子罐种子培养好后接种于含有玉米芯水解液25％，酵母膏0.4％，蛋白胨\n0.3％，玉米浆0.4％，MgSO4·7H2O 0.002％，MnSO4·4H2O0.005％，KH2PO40.002％，丁二酸钠\n0.6％，L-谷氨酸钠6％的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1∶1.2的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为300rpm，维持溶氧浓度(DO)为75～85％，温度控制在31℃，好氧培养15小时，当细胞浓度即光密度(O.D.)达到\n15时，转入第二阶段发酵；在第二阶段为厌氧发酵阶段，厌氧培养直至发酵结束，温度控制在36℃。添加氨水或氢氧化钠将发酵体系pH控制在5.6，发酵45小时，γ-氨基丁酸产率达到3.97％。\n[0074] 发酵结束后，将发酵液经过D061型交换树脂吸附，最佳吸附条件为pH＝4.0，温度\n40℃，平衡吸附时间17min，吸附量为0.83mol/L。γ-氨基丁酸发酵液上样的流速为1BV/h。\n洗脱剂氨水浓度为1.2mol/L，流速为1BV/h。经旋转蒸发仪浓缩、醇沉结晶后，可得γ-氨基丁酸晶体，其回收率达到80％。\n[0075] 实施例5\n[0076] 本实施例的γ-氨基丁酸制备过程如下：\n[0077] 先将γ-氨基丁酸生产菌株乳短杆菌CGMCC NO.1306(Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306)接到含玉米芯水解液20％，酵母膏0.4％，蛋白胨0.7％，玉米浆0.4％，琼脂\n2％的平板培养基中，30℃培养22小时。\n[0078] 然后采用平板培养的γ-氨基丁酸接种一环到含有玉米芯水解液30％，酵母膏\n0.5％，蛋白胨0.9％，玉米浆0.3％的液体种子培养基中培养，pH控制在5.4，摇床培养22小时，摇床转速200rpm，培养温度32℃。\n[0079] 待摇瓶种子培养好后，再接种到含有玉米芯水解液30％，酵母膏0.4％，蛋白胨\n0.6％，玉米浆0.2％的种子罐液体种子培养基中通风培养，培养温度33℃，pH控制在5.2，搅拌转速90rpm，无菌空气通风比1∶0.6(v/v)，培养周期15小时。\n[0080] 种子罐种子培养好后接种于含有玉米芯水解液26％，酵母膏0.3％，蛋白胨\n0.2％，玉米浆0.6％，MgSO4·7H2O 0.002％，MnSO4·4H2O0.005％，KH2PO40.07％，丁二酸钠\n0.5％，L-谷氨酸钠7％的5L发酵罐中培养，在第一阶段为好氧发酵阶段，无菌空气以通风比为1∶0.8的通风速率流入发酵罐的发酵培养基中，搅拌转速为400rpm，维持溶氧浓度