一种促进木本植物不定根发生和生长的培养基及其应用

1.一种促进木本植物不定根发生和生长的培养基，其特征在于所述培养基包括以下组分：无机盐A、无机盐B、有机化合物、50-150 mg/L水溶性碳纳米管、0.5-1.5 mg/L吲哚丁酸、100 mg/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸、30000 mg/L蔗糖、5000 mg/L琼脂，其中，无机盐A、无机盐B和有机化合物分别由下表所示的组分构成：
无机盐A
成分 浓度 mg/L
硝酸铵 500.0
磷酸二氢钾 250.0
硫酸钾 500.0
硝酸钙 500.0
硫酸镁 250.0
；
无机盐B
成分 浓度 mg/L
六水硝酸锌 10.0
一水硫酸锰 15.0
硼酸 5.0
五水硫酸铜 0.25
Na2-EDTA 15.0
七水硫酸铁 10.0
硅酸 40.0
钼酸钠 0.25
六水硫酸镍 0.005
；
有机化合物
成分 浓度 mg/L
盐酸硫胺素 0.1
盐酸吡哆醇 0.5
烟酸 0.5
阿魏酸 20.0
。
2.一种促进木本植物不定根发生和生长的培养基的应用，其特征在于利用权利要求1所述的培养基促进木本植物不定根的发生和生长，培养基的pH值范围在5.5-6.0之间。

一种促进木本植物不定根发生和生长的培养基及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于植物生长领域，尤其涉及一种特殊培养基、该培养基促进植物不定根的发生和生长以及在生根方面的应用。\n技术背景\n[0002] 不定根是指植物非根组织（叶、嫩茎、枝条、地上茎、地下茎等) 上形成的根。其发生方式分直接发生和间接发生两种：直接发生指在无性繁殖扦插时不定根从插穗（茎、枝条、叶等）直接形成；间接发生是指从插穗上先产生愈伤组织,愈伤组织分化再产生不定根，或在组织培养过程中从外植体先产生愈伤组织，再形成拟分生组织，产生不定芽、然后不定根原基， 最后产生不定根。植物种类不同，比如木本与草本、单子叶和双子叶，不定根发生方式的不同，不定根产生难易程度的差异极大。\n[0003] 随着现代生物学的发展，通过组织培养进行无性繁殖越来越广泛。组培繁殖具有时间短、繁殖系数高、植株无病毒污染，可进行大量育苗和多季育苗，既经济又简单，并且保持母体的优良性状，因而被广泛用于多种植物的种质保存、植株脱毒及农业、园艺和林业等生产领域。一般来说，植物快繁过程包括愈伤组织/体细胞胚胎形成、不定芽（苗）的产生、不定根的发生和试管苗移栽。其中不定根的发生是组培繁殖过程中的重要阶段，因为根具有吸收、输送和贮藏水分和养分、合成多种化合物的功能，不定根发生率的高低以及根系的发达与否决定着试管苗移栽的成活率。\n[0004] 在组培繁殖方面，木本植物不定根发生和生长又比其他植物困难。这一方是由于木本植物具有生命周期长、遗传杂合几率高、变异性大的原因;另一方面是木本植物组培研究起步较晚，许多问题还不清楚。不定根的发生受诸多因素影响，其中主要是培养基的组成和外源激素。例如，大多数草本植物组培繁殖可以采用MS(Murishige and Skoog， 1962)基本培养基，但是MS基本培养基对许多木本植物不适合。木本植物不定芽在MS培养基上易出现褐变、玻璃化和生根难等现象，严重影响了木本植物组培快繁的发展和应用。\n发明内容\n[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷并提供一种促进不定根发生和生长的生根的培养基。\n[0006] 实现本发明目的的技术解决方案是：一种促进木本植物不定根发生和生长的培养基，所述的培养基包括以下成分：无机盐A、无机盐B、有机化合物、50-150 mg/L水溶性碳纳米管、0.5-1.5 mg/L吲哚丁酸、100 mg/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸和30000 mg/L蔗糖、5000 mg/L琼脂，其余为去离子水，其中无机盐A、无机盐B和有机化合物分别由下表所示的组分构成：\n[0007] 表1.无机盐A \n[0008] \n成分 浓度 (mg/L)\n硝酸铵 500.0\n磷酸二氢钾 250.0\n硫酸钾 500.0\n硝酸钙 500.0\n硫酸镁 250.0\n[0009] 表 2.无机盐B\n[0010] \n成分 浓度 (mg/L)\n六水硝酸锌 10.0\n一水硫酸锰 15.0\n硼酸 5.0\n五水硫酸铜 0.25\nNa2-EDTA 15.0\n七水硫酸铁 10.0\n硅酸 40.0\n钼酸钠 0.25\n六水硫酸镍 0.005\n[0011] 表 3.有机化合物 \n[0012] \n成分 浓度 (mg/L)\n盐酸硫胺素（维生素B1） 0.1\n盐酸吡哆醇（维生素B6） 0.5\n烟酸（维生素B5） 0.5\n阿魏酸 (Ferulic acid) 20.0\n[0013] 一种促进木本植物不定根发生和生长的培养基的应用，所述的培养基促进木本植物不定根的发生和生长，培养基的pH值范围在5.5-6.0之间。\n[0014] 本发明的创新在于：\n[0015] 1）开发出一种促进木本植物不定根发生和生长的培养基。经过多次筛选，本培养基首先大幅降低了盐浓度，防治了生理失水。其次，添加了MES缓冲剂，避免了酸碱度波动。\n此外减少了EDTA浓度，EDTA主要是络合铁；但是，当EDTA浓度太高会抑制乙烯合成，乙烯的减少会影响生根。\n[0016] 2）本培养基的另一创新是添加了阿魏酸，一种天然酚化合物，阿魏酸保护吲哚丁酸免于脱羧化，使吲哚丁酸充分发挥诱导作用。\n[0017] 3）更重要的是本发明首次开发利用碳纳米管诱导不定根发生和生长。本发明合成的培养基在没有碳纳米管的情况下，就明显优于常见培养基。当培养基再添加碳纳米管后，其优越性更加明显。一方面碳纳米管穿破不定芽基部细胞壁，加快了水分和养分地吸收；同时碳纳米管巨大的表面积会吸附吲哚丁酸，让吲哚丁酸尽快进入细胞、加速了脱分化，诱导细胞分裂形成根原基，从而根的发生。不定根发生早于对照处理就是其道理。不定根的数量和长度的增加可能与碳纳米管诱导植物其它内源激素形成的协同效应有关。\n[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：\n[0019] 1）本发明首次开发和利用碳纳米管诱导植物不定根发生。我们前期用MS，WPM (Lioyd and McCown，1981)和DKW (Drive and Kuniyuki，1984)培养基诱导澳洲鸭脚木（Schefflera actinophylla）产生不定根，生根率最高的是DKW培养基达70%。而澳洲鸭脚木不定芽在本发明的培养基上，生根率为100%，说明本培养基特别适合不定根的发生。\n[0020] 2）本发明的培养基更能促进不定根生长。澳洲鸭脚木不定芽在含100 mg/L碳纳米管的培养基产生的不定根比对照（同样培养基但不含碳纳米管）要高近1倍。\n[0021] 3）为木本植物不定根的发生和生长建立了一个可靠的培养基。不定根的发生和生长是木本植物无性繁殖最大的难题，本培养基不仅对澳洲鸭脚木不定芽的生根，还对金银花，蓝莓，小桐子，光皮树，单面针等植物不定根的发生和生长有同样的促进作用。\n附图说明\n[0022] 图1为本发明的所述培养基在澳洲鸭脚木产生不定根的培养结果。\n具体实施方式\n[0023] 本发明所述的植物不定根发生和生长的培养基主要由以下方法制得：以配制1L培养基为例：取600 ml去离子水，首先加入表1所示的无机盐A(硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸钾、硝酸钙、硫酸镁)、表2所示的无机盐B(六水硝酸锌、一水硫酸锰、硼酸、五水硫酸铜、Na2-EDTA、七水硫酸铁、硅酸、钼酸钠、六水硫酸镍)搅拌使之溶解，再加入30000 mg/L蔗糖、\n100 mg/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸、50、100、或150 mg/L水溶性碳纳米管（市售）和加热溶解后的5000 mg/L 琼脂，补足去离子水至1L，用1M KOH调节pH值至5.8。将配置的植物调节o\n剂装入2L三角瓶，封口，在121 C，0.1Mpa下灭菌20分钟。将灭菌后的三角瓶置于加温水\n o\n浴锅内（水浴锅温度设在50-60 C）。将过滤灭菌后的0.5-1.5 mg/L吲哚丁酸、表3所示的有机化合物（盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、阿魏酸）加入高压灭菌过的未凝固培养基中，混匀后分装于培养皿或者培养瓶 （每培养皿或瓶20-30 mL）。这一过程应在超净工作台中进行，避免污染培养基。对照培养基配置不含水溶性碳纳米管（见实施例1）。具体的配方见表4：\n[0024] 表4.各实施例中促生长不定根的发生和生长的培养基组分及其组成含量 (mg/L)[0025] \n[0026] 将组培通过愈伤组织获得的不定芽，高2 cm，在无菌的条件下接种到培养瓶内。培养瓶分别装有配制的对照培养基（实施例1）和含50、100和150 mg/L水溶性碳纳米管的培养基（分别为实施例2，3，和4）。每个培养瓶4株不定芽，每处理重复5次。培养瓶封口后，o 2\n放在特定的组织培养室内，温度25 C，光下培养： 50 μmol/m/s的光照，12小时光周期。\n[0027] 表5为澳洲鸭脚木不定芽在对照培养基和含水溶性碳纳米管培养基上发生不定根时间、不定根根数和根长以及根的鲜重和干重。\n[0028] 表5.不定根时间、不定根根数和根长结果表\n[0029] \n[0030] 结果表明在本发明的培养基上，所有澳洲鸭脚木不定芽都产生了不定根，但不定芽在含碳纳米管培养基上发生不定根的时间比对照提前2天。\n[0031] 不定芽在对照培养基上培养12，15天后每株分别产生不定根8和20根（图1），根平均长度0.551 cm； 所有根鲜重0.0942 g, 干重0.0043 g。 \n[0032] 在含50 mg/L碳纳米管的培养基上，不定芽培养12，15天后每株分别产生不定根\n12和28根（图1），根平均长度0.754 cm； 所有根鲜重0.1566 g, 干重0.0067 g。 [0033] 不定芽在含100 mg/L碳纳米管的培养基上生长12，15天后，每株分别产生不定根\n22和39根（图1），根平均长度0.776 cm； 所有根鲜重0.3269 g, 干重0.0131 g。 [0034] 当培养基碳纳米管浓度增加到150 mg/L时，不定芽在12，15天后每株分别产生不定根23和38根，根平均长度0.724 cm； 所有根鲜重0.3158 g, 干重0.0124 g。说明碳纳米管浓度高于100 mg/L，对不定根发生和生长影响不再明显。\n[0035] 结论：碳纳米管促进澳洲鸭脚木不定根发生和生长的最佳浓度为100 mg/L，在此浓度的培养基上，澳洲鸭脚木不定芽出根时间比对照提前两天，经15天生长后产生的不定根几乎是对照的1倍，平均根长度比对照长41%， 总鲜重和干重分别增加3.5倍。