一种检测胎膜早破的试剂盒及其制备方法

1.一种检测胎膜早破的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括有多孔板以及以下试剂：
A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径0.5μm-2μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为75-85个/μL；
所述磁性微球悬液中含有质量分数1％的牛血清白蛋白、0.05％的叠氮钠、0.02％的吐温-20以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液；
B、藻红蛋白标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为1.7-2mg/mL；藻红蛋白标记的链霉亲和素浓度为1-2μg/ml；
C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.2-1.5％的牛血清白蛋白、0.008-0.012％的吐温-20、0.04-0.05％的叠氮钠以及8-12mmol/L的磷酸盐缓冲液；
D、样本稀释液：所述样本稀释液含有质量分数为1％的牛血清白蛋白、0.05％的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的检测胎膜早破的试剂盒，其特征在于：所述A试剂磁性微球为直径1μm-2μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；
悬液中磁性微球的浓度为80个/μL。
3.根据权利要求1所述的检测胎膜早破的试剂盒，其特征在于：所述B试剂生物素标记的抗体的浓度为2mg/mL。
4.根据权利要求1所述的检测胎膜早破的试剂盒，其特征在于：所述C试剂标准品稀释液含有质量分数为1.5％的牛血清白蛋白、0.01％的吐温-20、0.05％的叠氮钠以及
10mmol/L的磷酸盐缓冲液。
5.一种权利要求1所述的检测胎膜早破的试剂盒的制备方法，其特征在于步骤如下：
a、磁性微球悬液的制备：先后用去离子水以及活化缓冲液对羟基化微球进行清洗，并将其重悬于活化缓冲液中；先后加入N-羟基硫代琥珀酸亚胺和碳二亚胺，振荡、离心分离得沉淀；所得沉淀用交联缓冲液洗涤后并重悬于磷酸盐缓冲液中，加入牛血清白蛋白以及叠氮钠制得磁性微球悬液；所述活化缓冲液为0.08-0.12mol/L的NaH2PO4的溶液；所述交联缓冲液为45-55mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液；
b、抗体的生物素标记：将鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体离心分离后用NaHCO3水溶液洗涤，加入N-羟基琥珀酸亚胺酯，N-羟基琥珀酸亚胺酯与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的质量比为1:4-5，混合静置得生物素标记的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；所述NaHCO3水溶液的浓度为45-55mmol/L；
c、配备标准品稀释液。
6.根据权利要求5所述的检测胎膜早破的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述a步骤中活化缓冲液为0.1mol/L的NaH2PO4的溶液；所述交联缓冲液为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液。
7.根据权利要求5所述的检测胎膜早破的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述b步骤中NaHCO3水溶液的浓度为50mmol/L。
8.根据权利要求5所述的检测胎膜早破的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述c步骤中标准品稀释液含有质量分数为1.5％的牛血清白蛋白、0.01％的吐温-20、0.05％的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。

一种检测胎膜早破的试剂盒及其制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种检测试剂盒及其制备方法，具体涉及一种检测胎膜早破的试剂盒及其制备方法。\n背景技术\n[0002] 医学上所使用的试剂盒为分析或检测某种参数时所必需试剂的成套组合，如疾病诊断试剂盒、核酸提取回收试剂盒、细菌鉴定试剂盒等。现有试剂盒大多为采用定量的检测方式，相对来说，试剂盒的检测较免疫层析试纸的定性检测方式更为准确。\n[0003] 胎膜破裂（Rupture of Fetal Membrane，简称ROM）在孕期可能随时发生，在临产前发生的胎膜破裂称为胎膜早破（PROM）。足月后（37孕周后）PROM的发生率约为10%，足月前（37孕周前）PROM的发生率为2-3.5%。胎膜早破是引起产科病人产前、产后并发症的主要因素，也是导致胎儿早产和新生儿必须入住重症监护室的主要原因。由于医务人员不得不在延长孕周与宫内及孕妇感染的风险和胎儿肺发育问题之间求平衡，因而对胎膜早破患者的管理成本高、难度大，准确及时诊断孕妇是否发生胎膜早破至关重要。\n[0004] 现有检测胎膜早破的方法中除以往的临床询问病史等方法外，主要以妊娠妇女阴道分泌物中的可溶性细胞间粘附分子-1（简称sICAM-1）为检测指标的检测工具为较新的方法。其中以sICAM-1为检测指标的检测胎膜早破免疫层析试纸对于产科病人及时诊断是否发生胎膜早破起到了较好的效果；所述免疫层析试纸的检测线内包被有羊抗人sICAM-1多克隆抗体工作液，质控线内包被有羊抗鼠IgG工作液，胶体金结合物中含有鼠抗人sICAM-1单克隆抗体。\n[0005] 现有的以sICAM-1为检测指标的检测胎膜早破免疫层析试纸虽然为产科病人提供了便利，但由于其本身仅是一种定性的检测方式，相对于定量检测的方式其在测定结果上存在一定程度的偏差，从而容易造成错判，导致检测结果的灵敏性以及特异性不够理想；\n尤其是对发生胎膜早破时，胎膜破口小，破口高导致的阴道羊水流量较小的产科病人而言。\n发明内容\n[0006] 有鉴于此，本发明提供一种检测胎膜早破的试剂盒，该试剂盒对于胎膜早破的检测结果的灵敏性和特异性有显著的提高，分别可达到99%和98%以上，从而减少误诊的发生率。\n[0007] 为解决以上技术问题，本发明的技术方案是采用一种检测胎膜早破的试剂盒，所述试剂盒包括有多孔板以及以下试剂：\n[0008] A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径0.5μm-2μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为75-85个/μL；\n[0009] 所述磁性微球悬液中含有质量分数0.8-1.2%的牛血清白蛋白、0.03-0.05%的叠氮钠、0.01-0.03%的吐温-20以及8-10mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0010] B、藻红蛋白标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为1.7-2mg/mL；所述藻红蛋白标记的链霉亲和素的浓度为1-2μg/ml；\n[0011] C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.2-1.5%的牛血清白蛋白、0.008-0.012%的吐温-20、0.04-0.05%的叠氮钠以及8-12mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0012] 优选的，所述A试剂磁性微球为直径1μm-2μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为80个/μL。\n[0013] 优选的，所述A试剂磁性微球悬液中含有质量分数1%的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠、0.02%的吐温-20以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0014] 优选的，所述B试剂生物素标记的抗体的浓度为2mg/mL。\n[0015] 优选的，所述标准品稀释液含有质量分数为1.5%的牛血清白蛋白、0.01%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0016] 优选的，所述试剂盒还含有试剂D：样本稀释液；所述样本稀释液含有质量分数为\n1%的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0017] 本发明与现有技术相比，其详细说明如下：\n[0018] 本发明主要采用的技术方案为：检测胎膜早破的试剂盒，所述试剂盒包括有多孔板以及以下试剂：\n[0019] A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径0.5μm-2μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为75-85个/μL。\n[0020] 所述磁性微球悬液中含有质量分数0.8-1.2%的牛血清白蛋白、0.03-0.05%的叠氮钠、0.01-0.03%的吐温-20以及8-10mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0021] B、藻红蛋白标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为1.7-2mg/mL；所述藻红蛋白标记的链霉亲和素的浓度为1-2μg/ml；\n[0022] C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.2-1.5%的牛血清白蛋白、0.008-0.012%的吐温-20、0.04-0.05%的叠氮钠以及8-12mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0023] 首先，细胞间粘附分子（intercellular adhesive molecule1，简称ICAM-1）是一种参与细胞与细胞之间以及细胞与外基质之间相互作用的分子统称，包括有存在于体液中的可溶性细胞间粘附分子（soluble intercellular adhesive molecule1，简称sICAM-1）和存在于细胞表面的膜型细胞间粘附分子（简称膜型ICAM-1）。其中，sICAM-1不仅保留了膜型ICAM-1的生物学特性，其还是膜型ICAM-1在体液中的可溶形式。本发明人经过充分的研究发现，发生胎膜早破的妊娠妇女受羊水中的单核细胞上sICAM-1的表达和中性粒细胞的影响，其阴道分泌物中的sICAM-1含量明显升高，现已有将sICAM-1为目标分子来检测胎膜早破的检测工具，如免疫层析试纸，但在实际应用过程中，其定性的分析，易造成灵敏性和特异性均较低，容易产生误诊。\n[0024] 本发明所述灵敏性为患病人群中得出阳性检测的样本占病人总数的百分比，特异性为健康人群中得出阴性检测的样本占健康人总数的百分比。影响本发明试剂盒检测结果灵敏性和特异性的因素较多，包括有试剂盒本身中各种试剂成分的选择以及试剂中各种成分的浓度的选择，另外，试剂本身的制作工艺也同样会对检测结果的灵敏性和特异性有一定的影响。\n[0025] 本发明人经过充分的研究发现，sICAM-1是妊娠晚期出现在羊水中的主要蛋白质之一，含量一般为14ng/mL左右；而发生胎膜早破时，羊水中含量较多的sICAM-1则会出现在阴道分泌物中。因此，本发明主要采用以妊娠妇女阴道分泌物中的sICAM-1作为检测目标分子。\n[0026] 本发明经过蛋白芯片筛选试验发现，确诊的胎膜早破产妇与确诊的非胎膜早破产妇相比（两组产妇的年龄与妊娠周龄匹配，无基础疾病，无妊娠合并症），其阴道分泌物样本中sICAM-1的浓度具有明显差异；其中，确诊的胎膜早破产妇阴道分泌物样本中sICAM-1的浓度90%以上均在2ng/mL以上，而确诊的非胎膜早破产妇阴道分泌物样本中sICAM-1的浓度90%以上均在1ng/mL以下（详见实施例1）。\n[0027] 鉴于上述实验结果，为了提高本发明检测试剂盒对胎膜早破的检测结果的灵敏性和特异性，本发明人经过充分的研究，采用以磁性微球作为载体来进行定量的分析检测，从而获取更加准确的数据，从而对胎膜早破的诊断有定量的分析，提高检测结果的灵敏性和特异性。\n[0028] 磁性微球即磁性高分子微球，其是一种近几年发展起来的磁性材料，一般是采用将磁性无机粒子（例如Fe3O4等）与有机高分子材料相结合形成具有磁性的复合微球。现有磁性微球通过其表面改性等方式即可达到赋予其表面多种功能基的目的，从而其已被广泛运用到生物学、细胞学和分离工程等领域中。本发明所述磁性微球为采用表面羟基化的磁性微球，其直径为0.5μm-2μm，并将其与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联得本发明的磁性微球；本发明将所得磁性微球制成悬液，该悬液中磁性微球的浓度为75—85个/μL。\n[0029] 本发明所述磁性微球悬液中还含有一定浓度的牛血清白蛋白、叠氮钠以及PBS-TBN；本发明人经过充分而大量的研究发现，虽然磁性微球作为生物探针并用于吸附目标分子抗原或抗体的方式已较为常见，但其运用到某个具体疾病检测的时候，就需要经过大量的实验才能得到效果较好的具体方式。本发明人即是经过大量的实验研究发现，本发明所述的试剂盒对胎膜早破的检测效果较为理想，经过大量的验证实验发现，本发明试剂盒对于胎膜早破的检测结果的灵敏性和特异性分别可达到99%和98%以上。\n[0030] 本发明人经过充分的研究，对检测胎膜早破的试剂盒进行了改进，其改进主要体现在磁性微球悬液、生物素标记的抗体检测液以及标准品稀释液三种试剂上。\n[0031] 对于磁性微球悬液的改进主要是为了让所得磁性微球能够充分的吸附样本中的抗原成分即可溶性细胞间粘附分子，从而使得定量检测结果更加准确；本发明中对于羟基化磁性微球的直径、磁性微球的浓度以及悬液中其余辅助成分的浓度均有所调整，其探究实验过程是非常繁琐的，不仅需要对单因素进行选择，还要对三种因素联合进行选择；因此，本发明是建立在大量的实验基础之上的，所得结果也能很好的提高试剂盒检测结果的灵敏性和特异性。\n[0032] 对于生物素标记的抗体检测液的改进主要是为了让吸附于微球表面的抗原成分能够与检测液中抗体成分充分的结合，从而通过对抗体上标记的生物素成分来间接检测抗原的含量，从而有效的提高检测结果的灵敏性和特异性。\n[0033] 对于标准品稀释液的改进主要是为了避免可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品被污染，提高利用标准品制作的标准曲线的可信度，从而提高所检测样本中抗原成分含量的准确性，从而提高试剂盒检测结果的灵敏性和特异性。\n[0034] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用A试剂中羟基化磁性微球的直径为1μm-2μm，悬液中磁性微球的浓度为80个/μL的实施方式。\n[0035] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用A试剂磁性微球悬液中含有质量分数1%的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠、0.02%的吐温-20以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0036] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用B试剂生物素标记的抗体的浓度为2mg/mL。\n[0037] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用标准品稀释液含有质量分数为1.5%的牛血清白蛋白、0.01%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0038] 进一步的，本发明试剂盒还可采用更加优选的方式，即优选采用试剂盒还含有试剂D：样本稀释液；所述样本稀释液含有质量分数为1%的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0039] 本发明所述检测胎膜早破的试剂盒可以按照现有常用的制备方法进行制备所得，也可采用本发明提供的制备方法制备所得。\n[0040] 本发明的另一个目的还在于提供一种前述的检测胎膜早破的试剂盒的制备方法，步骤如下：\n[0041] a、磁性微球悬液的制备：先后用去离子水以及活化缓冲液对羟基化微球进行清洗，并将其重悬于活化缓冲液中；先后加入N-羟基硫代琥珀酸亚胺和碳二亚胺，振荡、离心分离得沉淀；所得沉淀用交联缓冲液洗涤后并重悬于磷酸盐缓冲液中，加入牛血清白蛋白以及叠氮钠制得磁性微球悬液；所述活化缓冲液为0.08-0.12mol/L的NaH2PO4的溶液；所述交联缓冲液为45-55mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液；\n[0042] b、抗体的生物素标记：将鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体离心分离后用NaHCO3水溶液洗涤，加入N-羟基琥珀酸亚胺酯，N-羟基琥珀酸亚胺酯与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的质量比为1:4-5；混合静置得生物素标记的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；所述NaHCO3水溶液的浓度为45-55mmol/L；\n[0043] c、配备标准品稀释液。\n[0044] 本发明所述试剂盒优选采用本发明提供的制备方法，其与现有制备方法的不同之处在于各步骤中所使用试剂的选择以及其浓度的选择；本发明所述制备方法中a、b两步骤中均对所使用的试剂及其浓度有一定的改进，因此，按本发明制备方法制备出的试剂盒对胎膜早破的检测结果的灵敏性和特异性均有一定程度的提升。\n[0045] 优选的，所述a步骤中N-羟基硫代琥珀酸亚胺和碳二亚胺均为使用时配制的。\n[0046] 优选的，所述a步骤中活化缓冲液为0.1mol/L的NaH2PO4的溶液；所述交联缓冲液为50mmol/L的MES（2-吗啉乙磺酸）溶液。\n[0047] 优选的，所述b步骤中NaHCO3水溶液的浓度为50mmol/L。\n[0048] 优选的，所述c步骤中标准品稀释液含有质量分数为1.5%的牛血清白蛋白、0.01%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0049] 本发明所述的磷酸盐缓冲液可以是现有检测试剂盒中常用的磷酸盐缓冲液，还可以是采用以下配方：水溶液含有磷酸二氢钾0.24g/L、磷酸氢二钠1.44g/L、氯化钠8.0g/L，pH为7.2-7.4。\n附图说明\n[0050] 图1是胎膜早破组阴道分泌物样本的细胞因子/趋化因子抗体芯片检测结果图；\n[0051] 图2是健康对照组阴道分泌物样本的细胞因子/趋化因子抗体芯片检测结果图；\n[0052] 图3是健康妊娠妇女羊水样本的细胞因子/趋化因子抗体芯片检测结果图；\n[0053] 图4是sICAM-1的酶联免疫吸附法的检测结果图。\n具体实施方式\n[0054] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。\n[0055] 实施例1\n[0056] 以四川大学华西第二医院门诊及住院的产妇为实验对象，根据现有检测方法将实验对象分为胎膜早破组、健康对照组和羊水样本组。\n[0057] 胎膜早破组：110例胎膜早破妊娠妇女（其中80例足月胎膜早破和30例足月前胎膜早破）；\n[0058] 健康对照组：110例分娩前的胎膜完整妊娠妇女；\n[0059] 羊水样本组：30例行剖宫产的胎膜完整妊娠妇女。\n[0060] 实验对象临床筛选标准：\n[0061] 胎膜早破组—（i）临产前观察到羊水漏出；\n[0062] （ii）阴道分泌物样本pH试纸检测阳性；\n[0063] （iii）羊齿植物叶状结晶检测阳性。\n[0064] 健康对照组—（i）临产前未观察到羊水漏出；\n[0065] （ii）阴道分泌物样本pH试纸检测阴性；\n[0066] （iii）羊齿植物叶状结晶检测阴性。\n[0067] 实验对象年龄分布：80例足月胎膜早破平均年龄28岁（年龄范围19-35岁），30例足月前胎膜早破平均年龄31岁（年龄范围19-45岁），健康对照组平均年龄30岁（年龄范围\n18-43岁）。\n[0068] 样本收集方法：妊娠妇女取膀胱截石位（以平仰卧位躺下，双下肢分开屈曲，暴露外阴），窥开阴道后，用一次性无菌棉签伸入阴道后穹窿处，旋转5圈取样。将棉签头插入\n1mL样本稀释液（磷酸盐缓冲系统）中，旋转5次后，紧贴管壁挤压旋转2次，获得待测样本。\n[0069] A、实验方法：细胞因子/趋化因子抗体芯片定性检测\n[0070] 实验条件：\n[0071] 1)将预先标记有174个细胞因子抗体的膜（RayBiotech，美国）放入检测盒中，然后加入2ml封闭液，室温封闭6小时；\n[0072] 2)弃去封闭液，加入1.2ml待检样本1份，4℃过夜孵育；\n[0073] 3)弃去样本，用2ml洗涤缓冲液清洗5次；\n[0074] 4)加入1ml生物素偶联的检测抗体，室温孵育2小时；\n[0075] 5)弃去抗体，用2ml洗涤缓冲液清洗5次；\n[0076] 6)加入2ml辣根过氧化物酶（HRP）偶联的链霉素亲和素，室温孵育2小时；\n[0077] 7)弃去液体，用2ml洗涤缓冲液清洗5次；\n[0078] 8)在膜上加入化学发光试剂500μl，避光作用2分钟，观察结果。\n[0079] 从胎膜早破组、健康对照组和羊水样本组中各收集的待测样本均采用上述实验条件进行检测，所得结果如图1、图2和图3所示。\n[0080] 实验结果：图1、图2和图3中的标记1为IGFBP-1的表达信号，标记2为sICAM-1的表达信号，标记3为Axl的表达信号。从图1、图2和图3中可以看出，胎膜早破组的阴道分泌物和羊水样本组中IGFBP-1、sICAM-1、Axl的表达较强，而健康妊娠妇女阴道分泌物样本中上述三者的表达较弱，上述三者中，又以sICAM-1的表达最强。\n[0081] B、实验方法：酶联免疫吸附法定量检测\n[0082] 实验条件：\n[0083] 实验材料：sICAM-1ELISA检测试剂盒（R&D公司）\n[0084] 1.试剂的配制\n[0085] 洗涤缓冲液（Wash Buffer）\n[0086] 底物溶液（Substrate Solution）：使用前，将试剂盒中的显色剂A和显色剂B等量、避光混合15分钟，每个孔需要两种显色剂的混合物200μl。\n[0087] sICAM-1标准品：用1ml去离子水将sICAM-1标准品稀释。稀释后的标准品原液浓度为250ng/ml。为确保标准品充分混匀，在进一步稀释前，将标准品放于摇床上轻轻晃动混匀至少15分钟以上。\n[0088] 分别将250ng/ml的标准品配置成浓度为50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.13ng/ml、1.56ng/ml的sICAM-1检测标准品；RD5-7校准稀释剂作为空白对照（0ng/ml）\n[0089] 2.检测程序\n[0090] 向每个微孔中加入100μl sICAM-1Conjugate；标准品、对照物、样本的加入量为\n100μl，并加入到对应的微孔中。将微孔用试剂盒提供的胶条盖好。将微孔板在室温条件下置于水平摇床上500±50转/分钟培育1.5小时。洗板；每孔加底物溶液（Substrate Solution）200μl，室温条件下，避光、平放培育30分钟；每孔加50μl终止液（Stop Solution）。孔中溶液的颜色将由蓝色变为黄色。如果孔中溶液颜色为绿色或颜色变化不一致，轻轻拍打平板，以确保溶液充分混匀；30分钟内测450nm吸光值。\n[0091] 3.制作标准曲线，计算样本含量。\n[0092] 4.将计算所得的每个待测样本的含量统计并绘制成图表，所得图表见附图4。\n[0093] 实验结果：图4中，AF of control为羊水样本，CVF of PROM为胎膜早破组的阴道分泌物，CVF of control为健康对照组的阴道分泌物。从图4可以看出，sICAM-1在健康妊娠妇女羊水样本中的浓度最高，平均可达到80ng/mL；sICAM-1在胎膜早破组阴道分泌物样本中的浓度90%以上可达到2ng/mL以上；sICAM-1在健康对照组阴道分泌物样本中的浓度90%以上在1ng/mL以下。\n[0094] 从实施例1的实验结果可知，发生胎膜早破妊娠妇女的阴道分泌物中主要发生含量变化之一的是可溶性细胞间粘附分子sICAM-1，而sICAM-1主要来自于胎膜破裂的羊水中。\n[0095] 以下是以妊娠妇女阴道分泌物中sICAM-1为检测目标分子，并按照一定的制备方法制备所得的试剂盒的对照例，各对照例除多孔板以外，含有的试剂如下：\n[0096] 对照例1\n[0097] A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径10-20μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为60个/μL；\n[0098] 所述磁性微球悬液中含有质量分数1.5%的牛血清白蛋白、0.1%的叠氮钠、0.01%的吐温-20以及12mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0099] B、藻红蛋白标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为3.5mg/mL；所述藻红蛋白标记的链霉亲和素的浓度为1-2μg/ml；\n[0100] C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为2%的牛血清白蛋白、0.02%的吐温-20、0.2%的叠氮钠以及5mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0101] 对照例2\n[0102] A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径1-5μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为90个/μL。\n[0103] 所述磁性微球悬液中含有质量分数0.5%的牛血清白蛋白、0.01%的叠氮钠、0.03%的吐温-20以及5mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0104] B、藻红蛋白标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为2.5mg/mL；所述藻红蛋白标记的链霉亲和素的浓度为1-2μg/ml；\n[0105] C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为0.8%的牛血清白蛋白、0.005%的吐温-20、0.07%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0106] 对照例3\n[0107] A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径0.5-1.2μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为70个/μL。\n[0108] 所述磁性微球悬液中含有质量分数0.8%的牛血清白蛋白、0.06%的叠氮钠、0.01%的吐温-20以及12mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0109] B、藻红蛋白标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为1.5mg/mL；所述藻红蛋白标记的链霉亲和素的浓度为1-2μg/ml；\n[0110] C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.2%的牛血清白蛋白、0.015%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及14mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0111] 对照例4\n[0112] A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径0.5μm-2μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为75个/μL；\n[0113] 所述磁性微球悬液中含有质量分数0.8%的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠、0.03%的吐温-20以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0114] B、藻红蛋白标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为1.7mg/mL；所述藻红蛋白标记的链霉亲和素的浓度为1-2μg/ml；\n[0115] C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.5%的牛血清白蛋白、0.008%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及8mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0116] 对照例5\n[0117] A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径1μm-2μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为85个/μL；\n[0118] 所述磁性微球悬液中含有质量分数1.2%的牛血清白蛋白、0.03%的叠氮钠、0.01%的吐温-20以及8mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0119] B、藻红蛋白标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为2mg/mL；所述藻红蛋白标记的链霉亲和素的浓度为1-2μg/ml；\n[0120] C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.2%的牛血清白蛋白、0.012%的吐温-20、0.04%的叠氮钠以及12mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0121] 对照例6\n[0122] A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径0.5μm-1μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为80个/μL；\n[0123] 所述磁性微球悬液中含有质量分数1%的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠、0.03%的吐温-20以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0124] B、藻红蛋白标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为2mg/mL；所述藻红蛋白标记的链霉亲和素的浓度为1-2μg/ml；\n[0125] C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.5%的牛血清白蛋白、0.01%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0126] 对照例7\n[0127] A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径1μm-2μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为80个/μL；\n[0128] 所述磁性微球悬液中含有质量分数1%的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠、0.02%的吐温-20以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0129] B、藻红蛋白标记的链霉亲和素和生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为2mg/mL；所述藻红蛋白标记的链霉亲和素的浓度为1-2μg/ml；\n[0130] C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.5%的牛血清白蛋白、0.01%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0131] 对照例8\n[0132] A、磁性微球悬液：所述磁性微球为直径1μm-2μm的羟基化磁性微球与N-羟基硫代琥珀酸亚胺、碳二亚胺共同交联所得；悬液中磁性微球的浓度为80个/μL；\n[0133] 所述磁性微球悬液中含有质量分数1%的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠、0.02%的吐温-20以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0134] B、生物素标记的抗体检测液：所述生物素为N-羟基琥珀酸亚胺酯；所述抗体为鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；生物素标记的抗体的浓度为2mg/mL；所述藻红蛋白标记的链霉亲和素的浓度为1-2μg/ml；\n[0135] C、可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品以及标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.5%的牛血清白蛋白、0.01%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液；\n[0136] D、样本稀释液：所述样本稀释液含有质量分数为1%的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0137] 上述对照例1-8分别按照以下不同方法进行制备所得，不同方法制备出来的同一对照例虽所含有的试剂大体相同，但由于制备方法的不同从而造成了一定的差别。\n[0138] 方法（1）\n[0139] a、磁性微球悬液的制备：先后用去离子水以及活化缓冲液对羟基化微球进行清洗，并将其重悬于活化缓冲液中；先后加入N-羟基硫代琥珀酸亚胺和碳二亚胺，振荡、离心分离得沉淀；所得沉淀用交联缓冲液洗涤后并重悬于磷酸盐缓冲液中，加入牛血清白蛋白以及叠氮钠制得磁性微球悬液；所述活化缓冲液为0.05mol/L的NaH2PO4溶液；所述交联缓冲液为70mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液；\n[0140] b、抗体的生物素标记：将鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体离心分离后用NaHCO3水溶液洗涤，加入N-羟基琥珀酸亚胺酯，N-羟基琥珀酸亚胺酯与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的质量比为1:10，混合静置得生物素标记的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；所述NaHCO3水溶液的浓度为80mmol/L；\n[0141] c、配备标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为2%的牛血清白蛋白、\n0.02%的吐温-20、0.1%的叠氮钠以及8mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0142] 方法（2）\n[0143] a、磁性微球悬液的制备：先后用去离子水以及活化缓冲液对羟基化微球进行清洗，并将其重悬于活化缓冲液中；先后加入N-羟基硫代琥珀酸亚胺和碳二亚胺，振荡、离心分离得沉淀；所得沉淀用交联缓冲液洗涤后并重悬于磷酸盐缓冲液中，加入牛血清白蛋白以及叠氮钠制得磁性微球悬液；所述活化缓冲液为0.2mol/L的NaH2PO4的溶液；所述交联缓冲液为30mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液；\n[0144] b、抗体的生物素标记：将鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体离心分离后用NaHCO3水溶液洗涤，加入N-羟基琥珀酸亚胺酯，N-羟基琥珀酸亚胺酯与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的质量比为1:6，混合静置得生物素标记的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；所述NaHCO3水溶液的浓度为35mmol/L；\n[0145] c、配备标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.5%的牛血清白蛋白、\n0.01%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0146] 方法（3）\n[0147] a、磁性微球悬液的制备：先后用去离子水以及活化缓冲液对羟基化微球进行清洗，并将其重悬于活化缓冲液中；先后加入N-羟基硫代琥珀酸亚胺和碳二亚胺，振荡、离心分离得沉淀；所得沉淀用交联缓冲液洗涤后并重悬于磷酸盐缓冲液中，加入牛血清白蛋白以及叠氮钠制得磁性微球悬液；所述活化缓冲液为0.08mol/L的NaH2PO4的溶液；所述交联缓冲液为45mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液；\n[0148] b、抗体的生物素标记：将鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体离心分离后用NaHCO3水溶液洗涤，加入N-羟基琥珀酸亚胺酯，N-羟基琥珀酸亚胺酯与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的质量比为1:4，混合静置得生物素标记的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；所述NaHCO3水溶液的浓度为45mmol/L；\n[0149] c、配备标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为2%的牛血清白蛋白、\n0.02%的吐温-20、0.07%的叠氮钠以及8mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0150] 方法（4）\n[0151] a、磁性微球悬液的制备：先后用去离子水以及活化缓冲液对羟基化微球进行清洗，并将其重悬于活化缓冲液中；先后加入N-羟基硫代琥珀酸亚胺和碳二亚胺，振荡、离心分离得沉淀；所得沉淀用交联缓冲液洗涤后并重悬于磷酸盐缓冲液中，加入牛血清白蛋白以及叠氮钠制得磁性微球悬液；所述活化缓冲液为0.12mol/L的NaH2PO4的溶液；所述交联缓冲液为55mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液；\n[0152] b、抗体的生物素标记：将鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体离心分离后用NaHCO3水溶液洗涤，加入N-羟基琥珀酸亚胺酯，N-羟基琥珀酸亚胺酯与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的质量比为1:5，混合静置得生物素标记的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；所述NaHCO3水溶液的浓度为55mmol/L；\n[0153] c、配备标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.5%的牛血清白蛋白、\n0.02%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0154] 方法（5）\n[0155] a、磁性微球悬液的制备：先后用去离子水以及活化缓冲液对羟基化微球进行清洗，并将其重悬于活化缓冲液中；先后加入N-羟基硫代琥珀酸亚胺和碳二亚胺，振荡、离心分离得沉淀；所得沉淀用交联缓冲液洗涤后并重悬于磷酸盐缓冲液中，加入牛血清白蛋白以及叠氮钠制得磁性微球悬液；所述活化缓冲液为0.1mol/L的NaH2PO4的溶液；所述交联缓冲液为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸溶液；\n[0156] b、抗体的生物素标记：将鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体离心分离后用NaHCO3水溶液洗涤，加入N-羟基琥珀酸亚胺酯，N-羟基琥珀酸亚胺酯与鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体的质量比为1:5，混合静置得生物素标记的鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体；所述NaHCO3水溶液的浓度为50mmol/L；\n[0157] c、配备标准品稀释液：所述标准品稀释液含有质量分数为1.5%的牛血清白蛋白、\n0.01%的吐温-20、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的磷酸盐缓冲液。\n[0158] 上述对照例1-8以及方法1-5中的材料来源如下：\n[0159] 可溶性细胞间粘附分子-1蛋白标准品：购自R&D公司；\n[0160] 鼠抗人可溶性细胞间粘附分子-1单克隆抗体：购自R&D公司；\n[0161] N-羟基硫代琥珀酸亚胺、N-羟基琥珀酸亚胺酯、2-吗啉乙磺酸：购自Sigma公司；\n[0162] 藻红蛋白标记的链霉亲和素：购自Molecular Probes公司；\n[0163] 碳二亚胺：购自Pierce公司；\n[0164] 牛血清白蛋白（BSA）：Roche公司。\n[0165] 实施例2\n[0166] 将不同方法制备而成的对照例1-8总共40例试剂盒分别用于检测同样的妊娠妇女阴道分泌物的临床样本，包括有胎膜早破组和健康对照组，其中胎膜早破组为500例，健康对照组为500例，试验对象均采用实施例1的方法进行临床诊断和筛选。其中胎膜早破组中70%以上为胎膜破口小或者破口高导致的阴道羊水流量较小的产科病人。\n[0167] 样本收集：妊娠妇女取膀胱截石位（以平仰卧位躺下，双下肢分开屈曲，暴露外阴），窥开阴道后，用一次性无菌棉签伸入阴道后穹窿处，旋转5圈取样。将棉签头插入1mL样本稀释液（含有质量分数为15的牛血清白蛋白、0.05%的叠氮钠以及10mmol/L的PBS）中，旋转5次后，紧贴管壁挤压旋转2次，获得样本。\n[0168] 利用方法1-5分别制备出来的对照例1-8分别对所收集的1000例样本进行检测，检测步骤如下：\n[0169] 多孔板上可先加入样本稀释液预湿润，抽滤取出液体（若试剂盒中没有样本稀释液，则省略该步骤）；各孔分别加入25uL标准品、待检样本、或者样本稀释液；样本稀释液可作为空白对照，待检样本可预先用样本稀释液进行稀释；最后在上述每孔中加入25uL磁性微球悬液，室温避光振荡孵育60min。\n[0170] 抽滤去除孔内液体，在自动洗板机上设置清洗程序，每孔用100uL洗涤液（0.05%吐温-20,10mmol/L磷酸盐缓冲液）进行清洗；随后每孔加入25uL生物素标记的抗体检测液，室温避光振荡孵育60min。同前抽滤并洗涤，每孔加入25uL藻红蛋白标记的链霉亲和素，室温避光振荡孵育30min，再次抽滤并洗涤，每孔加入洗涤液重悬微球，并在Bio-Plex检测系统上检测各孔荧光值。\n[0171] 将标准品检测所得的荧光值制作标准曲线（有样本稀释液作为空白对照的则扣除空白对照的荧光值后制作标准曲线），将待测样本所得的荧光值利用标准曲线进行换算，从而获得各待检样本中可溶性细胞间黏附分子-1的浓度值，各对照例所得结果列表如下：\n[0172] 表一\n[0173] \n[0174] 表二\n[0175] \n[0176] 表三\n[0177] \n[0178] \n[0179] 表四\n[0180] \n[0181] 表五\n[0182] \n[0183] 表六\n[0184] \n[0185] 表七\n[0186] \n[0187] 表八\n[0188] \n[0189] \n[0190] 上表一至八中，表一至表八分别为对照例1-8采用不同的制备方法（1）至（5）制备所得，不同制备方法制备出的不同对照例分别用于检测相同的已确诊的胎膜早破组和健康对照组的阴道分泌物样本；对照例1-3为普通的检测试剂盒，其同样采用了磁性微球检测的方式；对照例4-8为本发明实施方式的检测试剂盒，其采用了本发明的主要改进方式；制备方法（1）-（2）为普通的制备检测试剂盒的制备方式，制备方法（3）-（5）为本发明优选的制备本发明检测试剂盒的制备实施方式。\n[0191] 从表一至表八中的结果可以看出，本发明的检测试剂盒无论采用普通的制备方式或者本发明的优选制备方式，其所得到的检测试剂盒用于检测胎膜早破，所得检测结果的灵敏性和特异性均高于普通的磁性微球检测试剂盒，分别可达到99%和98%以上。\n[0192] 另外，从表一至表八的结果中还可看出，本发明所述优选的制备方法实施方式（3）-（5）所制备出的对照例4-8用于检测胎膜早破的灵敏性和特异性与普通的制备方法实施方式所制备出的对照例相比，具有明显更显著的效果。\n[0193] 另外，从表一和表八中的检测结果可以看出，本发明主要改进点在于所述磁性微球悬液、生物素标记的抗体检测液以及标准品稀释液的结合改进方式，若单独采用其中一种的改进方式，其得到的试剂盒检测胎膜早破的检测结果的灵敏性和特异性仍然不能够达到本发明较为理想的效果，可参照对照例3。鉴于该结果，本发明是在大量的实验研究基础上才得到本发明较为理想的效果，因为本发明试剂盒中所述试剂的任一种参数的改变均会对本发明的效果产生一定的影响。\n[0194] 制备方法（3）-（5）为本发明优选制备方法的优选实施方式；对照例4-8为本发明检测试剂盒的实施方式。\n[0195] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。