一种降解菲的Terrimonas菌及其应用

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一种降解菲的Terrimonas菌及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于环境修复和生物技术领域，具体涉及一种用于降解环境有机污染物——菲的菌株及其应用，本发明还涉及一种降解菲的方法和一种用于降解土壤菲的微生物菌剂。\n背景技术\n[0002] 多环芳香烃化合物(PAHs)是一类由两个或两个以上苯环以线性排列、弯接或者簇聚等不同方式排列形成的有机化合物。根据PAHs分子量的大小，可以将多环芳烃分为低分子量的PAHs(如萘、菲，芴等)和高分子量的PAHs(如荧蒽、芘、苯并芘等)。多环芳烃的来源主要包括两个方面：一方面是自然界自身的活动，如森林火灾、动植物遗体腐烂、石油煤炭形成、火山喷发等；另外一个方面是人类污染行为，如化石燃料的不完全燃烧、城市固体废弃物的焚烧、石油开采、加工运输以及化工生产和汽车尾气的排放等。人类活动向环境贡献了绝大多数的多环芳烃污染，是公认的环境多环芳烃主要污染来源。PAHs已经广泛存在于空气，水体和土壤及其河流湖泊的沉积物。随着全球人口数量的不断爆炸式增长以及城市化、工业化的进程的不断加剧，人类生存环境中的多环芳烃污染的控制和修复已经变得刻不容缓。\n[0003] 菲是一类环境持久性污染物，由于其独特的化学结构，菲具有低水溶性，高疏水性和强化学稳定性，在自然界中难以被生物体利用。同时，菲也是被广泛证实的具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应的污染物。由于其独特的化学稳定性和环境持久性，传统的物理化学处理方法(挥发、光解、化学氧化、电修复以及混凝絮凝等方法)不能将其完全去除，同时处理成本高昂，容易产生二次污染。\n[0004] 微生物修复的实质是利用土壤微生物专一性代谢土壤中的有机污染物，将其转化为细胞其它碳基大分子和二氧化碳的过程。因此实施和建立一套土壤有机污染物的微生物修复方法的核心是筛选代谢速度快，环境适应性强的污染物降解菌。直接从环境中富集筛选土著微生物，避免了基因工程菌在实际应用中难以回避的生物安全的问题，是一种简单方便理想的技术手段。同时从土壤中分离获得的微生物还具有定植能力强，环境适应性广等特点。目前人们已经从各类生态环境中筛选获得一批多环芳烃降解菌，包括假单胞菌(Pseudomonas)、红球菌(Rhodococcus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、气单胞菌(Aeromonas)、拜叶林克氏菌(Beijerinckia)、拟诺卡氏菌(Nocardioides)、解环菌(Cycloclasticus)、伯克氏菌(Burkholderia)、丛毛单胞菌(Polaromonas)以及一些嗜热厌氧的菌属如嗜油菌(Neptunomonas)、两面神菌(Janibacter)、诺卡氏菌(Nocardia)、变性菌(Deltaproteobacteria)和产碱菌(Alcaligenes)等。\n发明内容\n[0005] 本发明的一个目的是提供一种新的用于降解菲的菌株。\n[0006] 本发明的另一个目的是提供所述菌株在降解菲中的应用。\n[0007] 本发明的第三个目的是提供一种降解菲的方法。\n[0008] 本发明的第四个目的是提供一种用于降解土壤菲的微生物菌剂。\n[0009] 为实现第一个目的，申请人从石油污染的土壤中分离获得一株能够快速降解菲的菌株，通过生理生化鉴定和核糖体16S rDNA基因序列分析将其鉴定为Terrimonas属。命名为Terrimonas sp.WP1，该菌株已于2015年5月11日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2015292。\n[0010] 该菌株在pH在5-10范围，盐离子浓度为5％以下，及温度在16-37℃范围内具有对菲的高效降解能力，具有广泛的环境适应性。同时，该菌株在代谢菲的过程中不会产生羟基化菲代谢中间产物的蓄积，不会造成环境的二次污染，是对土壤或环境菲污染物进行生物修复的优秀微生物材料。\n[0011] 同时，本发明还提供了一种基于Terrimonas sp.WP1菌株的菲降解方法和一种用于降解土壤菲的微生物菌剂。\n[0012] 更详细的技术方案见《具体实施方案》所述。\n附图说明\n[0013] 图1是根据WP1菌株16S rRNA编码基因序列的系统进化树。\n[0014] 图2是WP1菌株在200mg/L菲浓度下的生长和降解曲线图，图中三角符号数据代表培养过程中残留菲的浓度，正方形符号数据代表培养体系在OD600吸光值。\n[0015] 图3是WP1菌株在不同pH条件下对菲的降解能力柱状图。\n[0016] 图4是WP1菌株在不同钠离子浓度条件下对菲的降解能力柱状图。\n[0017] 图5是WP1菌株在不同温度条件下对菲的降解能力柱状图。\n具体实施方式\n[0018] 以下结合实施例对本发明进行详细地说明。需要说明的是，本发明的实施例仅限于对本发明进行说明，而没有限制作用。实施例中所涉及的有关筛选方法、缓冲液配制和常见培养基配方等可参照赵斌，何绍江主编的《微生物学实验》以及《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。\n[0019] 实施例1 WP1菌株的分离鉴定\n[0020] 采用来自长庆油田长期受石油污染的土壤为筛选土壤，具体筛选方案如下：\n[0021] 1)取10g土壤，加入到含有200mg/L菲的无机盐MSM中，28℃震荡培养7天，再以10％的接种量接到含有200mg/L菲的无机盐MSM培养基中；连续转接5次。\n[0022] 2)取0.1ml步骤1)所得到的富集培养液，涂布到含菲的MSM固体平板上，28℃静止培养5天后，将平板上长出来的菌落转接到含菲的MSM固体平板上，继续培养生长，直到平板上出现单一的菌落。\n[0023] 3)挑取含菲的MSM固体平板上生长出来的单菌落，接种到含有200mg/L菲的MSM液体培养基中，28℃震荡培养5天，获得本发明的菌株。\n[0024] 进一步对菌株进行了形态学和分子生物学鉴定。\n[0025] 首先，对菌株的形态学特征进行了初步的观察，结果表明，该菌株为革兰氏阴性菌，杆状；菌落为红色。\n[0026] 同时，发明人分离所获菌株的基因组DNA，然后以细菌16S rRNA基因的通用引物\n27F和1492R引物对DNA进行PCR扩增；将获得的PCR扩增产物进行测序，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示。然后，利用NCBI核酸数据库，根据菌株16S rRNA基因序列进行了BLAST分析，结果表明菌株的16S rRNA基因序列与Terrimonas属的Strain M-8菌株同源性高达99％的相似性。同时，选取所有Terrimons属已经报道的菌株的16S rRNA编码序列，同属于泉发菌科(Crenotrichaceae)的菌株，以及部分相似的未确定分类地位的菌株的16S rRNA编码序列一起构建系统发育树，如图1所示，WP1菌株与所有Terrimonas属菌株聚为一个分支，且与其它菌株明显属于不同分子。因此，发明人根据上述分子鉴定结果，结合革兰氏染色和形态学观察，将该菌株命名为Terrimonas sp.WP1。\n[0027] 实施例2 WP1菌株对菲的降解特征\n[0028] 以菲为唯一碳源，MSM培养基为基础培养基，对WP1菌株降解菲的能力进行了测试。\n首先，从-80℃取出保藏的菌株，然后接种到R2A固体培养基中活化3天；挑取单菌落接种到5毫升R2A液体培养基中培养至OD600＝0.5；然后取0.5ml菌液接种到25ml含有200mg/L的菲的MSM培养基中，置于28℃震荡培养。24小时取出一瓶培养物，分别测定OD600，并利用丙酮/正己烷(1:1)萃取三角瓶中所有残留的菲，然后利用GC-FID进行菲含量分析。每次取三瓶进行平行分析。\n[0029] 如图2所示，接种WP1菌株后第二天，培养基中的菲被降解50％左右，随后，体系中的菲降解速率下降，菌株的生长逐渐进入平台期。最终在五天的培养过程中，超过70％的菲得到降解。\n[0030] 实施例3 pH值、钠离子和温度对WP1菌株菲降解能力的影响\n[0031] 首先将MSM培养基用盐酸或氢氧化钠溶液调整pH分别为4、5、6、7、8、9、10，然后按照实施例2的操作方法接种WP1菌株，28℃震荡培养五天后分析培养体系中残留菲的浓度。\n如图3所示，在pH为4-10范围内，WP1菌株均能够维持对菲的降解效果，但是当pH低于5或高于10的时候，其降解能力将受到显著抑制。因此，本发明所提供的菲降解菌的合适处理环境的pH应该调整为5-9之间，并且，当处理样品的pH调整为7～8的时候，WP1菌株将处于最佳的降解效果的状态。\n[0032] 类似的，在MSM培养基中添加NaCl，使其重量浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％、\n6％、7％，然后按照实施例2的操作方法接种WP1菌株，28℃震荡培养7天后分析培养体系中残留菲的浓度。如图4所示，当培养体系中的NaCl浓度小于2％的时候，在五天内能够完成不低于60％的菲的降解，超过最大降解率的85％；随着NaCl浓度继续增加，降解率显著下降，这表明在氯化钠浓度低于2％条件下能够维持WP1菌株较高的菲降解速率。\n[0033] 此外，发明人按照实施例2的操作方法接种WP1菌株，然后分别置于4℃、16℃、28℃、37℃、42℃震荡培养7天，然后分析培养体系中残留菲的浓度。如图5所示，在16℃、28℃、\n37℃培养温度下，WP1菌株对菲的降解速率没有显著差异；当温度降至4℃的时候，降解速率下降，但仍然能够维持43％左右的降解率；随着培养温度升高到42℃，降解率能够稳定在\n80％以上。这表明WP1菌株具有广泛的温度适应性，将温度提高能够增强菌株的菲降解效果。\n[0034] 因此本发明所提供的WP1菌株具有广泛的pH，温度和盐度适应性，适用于不同土壤和水体环境。\n[0035] 实施例4 WP1土壤降解菌剂的制备\n[0036] 首先，从-80℃取出保藏的菌株WP1，然后接种到R2A固体培养基中活化3天；挑取单菌落接种到5毫升R2A液体培养基中培养至OD600＝0.5。\n[0037] 然后，取上述活化的菌株1ml，接种到100ml含有2％(w/v)糊化的玉米淀粉作为碳源的MSM培养基中，28℃震荡培养24小时(OD600＝～0.4～0.5)。\n[0038] 将20g自然干燥的水稻秸秆粉碎；加入5g硅藻土，拌匀，灭菌，烘干。然后与上述培养的100ml WP1菌株培养液混合均匀，继续置于28℃，静止培养48小时候，30℃恒温干燥至无明显液体存在，即为半干型菌剂。经过平板计数，上述培养方法所获得的菌剂的活菌数为\n2.8×109cfu/g。\n[0039] 实施例5 WP1菌株对菲的代谢中间产物分析\n[0040] 多环芳烃类化合物代谢中间产物可能会积累产生羟基菲等生物活性更高、毒害作用更强的化合物，从而造成对环境的二次污染。\n[0041] 为考察菲的代谢中间产物蓄积情况，以菲为唯一碳源，利用MSM培养基为基础培养基，对WP1菌株降解菲的中间产物积累能力进行了测试。首先，从-80℃取出保藏的菌株，然后接种到R2A固体培养基中活化3天；挑取单菌落接种到5毫升R2A液体培养基中培养至OD600＝0.5；取0.5ml菌液接种到25ml含有200mg/L菲的MSM培养基中，置于28℃震荡培养到OD600＝0.2-0.3左右。\n[0042] 将上述在含有200mg/L菲的MSM培养基中活化生长的WP1菌株培养物接种到50ml含有200mg/L菲的MSM培养基中，28℃震荡培养7天后进行代谢中间产物萃取。\n[0043] 萃取过程是这样进行的：向上述50ml WP1菌株菲培养物中加入50ml乙酸乙酯，室温萃取30min后，分离有机相；萃取三次，合并有机相作为中性萃取物；然后将下层水相部分用6M盐酸调整pH到2.0，同样用50ml乙酸乙酯萃取三次，合并有机相作为酸性萃取物。将中性萃取物和酸性萃取物分别进行旋转蒸发浓缩，然后合并，并用氮气吹干。然后用1ml乙酸乙酯重新溶解后，利用液相色谱质谱联用技术进行代谢中间产物分析。结果如下表所示：\n[0044]\n[0045] 在WP1菌株降解菲的代谢中间产物中，可能与菲代谢相关的化合物一共有10种，分别为：xanthone，vitamin K3，lawsone，1-hydroxy-2-napthoic acid，2-hydroxyxanthone，o-desmethynaproxen，3-desmethl-5-deshydroxyscleroin，3-hydroxy-phenylglycol，juglone，2,3-naphthalene dicarboxulic acid，这些物质属于多环芳烃降解常见中间代谢产物。同时，更为重要的是，没有发现菲的羟基化化合物在代谢过程中的积累。这表明，WP1菌株在对菲进行生物降解过程中，不会导致羟基化菲代谢中间产物的积累，不会产生二次污染。