柑桔多甲氧基黄酮的提取及纯化方法

1.一种柑桔多甲氧基黄酮粗提物的提取与纯化方法，其特征在于：
(1)柑桔多甲氧基黄酮的提取：
1)柑桔皮的预处理：将柑桔皮干燥至含水量≤5％，磨粉过30目筛后，备用；
2)柑桔多甲氧基黄酮的粗提与萃取：将柑桔皮粉500g和水5.0L拌匀，加热到100℃提取1h、过滤得水提液；将水提液与正己烷按体积比1∶0.5混合、萃取；将萃取液在40℃下减压蒸干，得到柑桔多甲氧基黄酮粗提物；经HPLC分析，该粗提物中含川陈皮素为30.8％，桔皮素为22.7％；
(2)柑桔多甲氧基黄酮粗提物的柱层析纯化；
1)粗提物溶液的配制：将柑桔多甲氧基黄酮粗提物5g溶解50％乙醇溶液500ml中，滤纸过滤后，备用；
2)大孔树脂装柱：把预处理后的大孔树脂D-101装入层析柱中至柱高25cm，柱内填装树脂至紧实；
3)大孔树脂的吸附：把上述粗提物溶液500ml，用蠕动泵以1ml/min流速，花8.33h流经层析柱，并收集流出液；分析多甲氧基黄酮含量，可知层析柱对多甲氧基黄酮的总吸附率为99％；
4)大孔树脂的洗脱、收集与浓缩干燥：先用蒸馏水以1ml/min的流速冲洗步骤(2)-3)层析柱1～2h洗去杂质；然后以80％乙醇水溶液500ml为洗脱液，用蠕动泵以1ml/min流速流经层析柱，以每40ml为一管进行成分测定并收集，将1至6管的洗脱液合并得洗脱液
1，把其余的洗脱液合并得洗脱液2；将洗脱液1与2分别减压浓缩、回收乙醇，残留物烘干、粉碎后，从前者得到以川陈皮素为主的纯化物1为1.012g，其中桔皮素和川陈皮素的含量分别为18.2％和63.9％；从后者得到以桔皮素为主的纯化物2为0.49g，其中桔皮素和川陈皮素的含量分别为44％和33.5％；柑桔多甲氧基黄酮总回收率为68.6％。

柑桔多甲氧基黄酮的提取及纯化方法 \n技术领域\n[0001] 本发明涉及农副产品有效成分的提取及纯化技术领域，具体涉及一种从柑桔皮中提取及纯化活性成分多甲氧基黄酮的方法。 \n背景技术\n[0002] 我们知道，柑桔富含黄酮类物质，其中的多甲氧基黄酮是柑桔中所特有的，川陈皮素(Nobiletin)、桔皮素(Tangeretin)是其中的代表，它们主要分布在柑桔皮的油胞中，含量在0.4～0.6mg/g。这类物质由于其具有平面结构，含有多个甲氧基，极性低，因此具有多种药理作用如抗癌、抗炎、抗氧化、抗诱变以及降低胆固醇等作用，特别其在抗癌方面的作用要比其它黄酮类强。 \n[0003] 目前对柑桔多甲氧基黄酮主要采用溶剂提取法进行粗提，然后用超临界流体色谱和高效液相制备色谱法对粗提物进行分离纯化，这两种提纯方法虽然所得多甲氧基黄酮单体的含量较高(90％以上)，但都还存在设备价格昂贵，工艺步骤繁琐，制备成本高等缺点；\n还有是采用聚酰胺柱和葡聚糖凝胶柱两次纯化柑桔皮粗提物，虽然得到的多甲氧基黄酮含量也较高，但是分离工序较复杂，而且这两种分离介质价格也较昂贵。大孔树脂是一种多孔的聚合物吸附剂，通过选择适宜的树脂可以对目标分离物具有较好的吸附作用，然后通过适宜的洗脱剂洗脱下来达到分离纯化的目的，它具有成本低廉，易得，组装简单，分离效果好的优点，其纯化的纯度基本可以满足食品、保健品等的需要。因此，本发明针对这一现状，根据多甲氧基黄酮的特性设计出一种成本低廉、工艺简单、经济环保，并适用于工业化生产的方法，所得到的多甲氧基黄酮含量较高，可以进一步开发成功能食品添加剂、保健品或药品。 \n发明内容\n[0004] 本发明目的是，针对已有柑桔多甲氧基黄酮粗提物纯化设备昂贵，工艺繁杂，成本太高，难以实现工业化的缺陷，提出一种纯化工艺合理，产品纯度高、得率较高，成本低廉，能满足食品、保健品等的需要，能用于工业化生产的柑桔多甲氧基黄酮的提取及纯化方法。 [0005] 本发明的设计前期对柑桔多甲氧基黄酮吸附率与洗脱率均较高的大孔树脂进行了筛选，从中测定、筛选出对川陈皮素和桔皮素单体吸附率和洗脱率均较高的大孔树脂(见试验例1)，以用于对本发明柑桔多甲氧基黄酮粗提物的纯化。 \n[0006] 本发明目的通过以下技术方案得以实现： \n[0007] 柑桔多甲氧基黄酮粗提物的提取与纯化方法，该方法按以下步骤进行： [0008] (1)柑桔多甲氧基黄酮的提取： \n[0009] 1)柑桔皮的预处理：将柑桔皮干燥至含水量≤5％，磨粉过30目筛后，备用； [0010] 2)柑桔多甲氧基黄酮的粗提与萃取：将柑桔皮粉和水按重量体积500g∶5L比例拌匀，加热到100℃提取1h、过滤得水提液；将水提液与正己烷按体积1∶0.5比例混合、萃取；将萃取液在40℃下减压蒸干，得到柑桔多甲氧基黄酮粗提物； \n[0011] (2)柑桔多甲氧基黄酮粗提物的柱层析纯化； \n[0012] 1)粗提物溶液的配制：将柑桔多甲氧基黄酮粗提物5g溶解于30～50％乙醇溶液\n500ml中，过滤后，备用； \n[0013] 2)大孔树脂装柱：把大孔树脂装入层析柱中至柱高15～25cm； \n[0014] 3)大孔树脂的吸附：把粗提物溶液500ml，用蠕动泵以1～2.5ml/min流速流经层析柱，并收集流出液； \n[0015] 4)大孔树脂的洗脱、收集与浓缩干燥：以60～100％的乙醇溶液500ml为洗 脱液，用蠕动泵以1ml/min流速流经层析柱后，以每40ml为一管进行成分测定与收集，其中，将1至6～7管的洗脱液合并得洗脱液1，把其余洗脱液合并得洗脱液2；将洗脱液1与2分别减压浓缩、回收乙醇，残留物烘干、粉碎后，分别得到以川陈皮素为主的纯化物1和以桔皮素为主的纯化物2。 \n[0016] 所述的大孔树脂为AB-8、D-101、NKA-9和DM312中的任选一种。 \n[0017] 本发明的有益效果是： \n[0018] (1)在粗提物的水提液中，因为多甲氧基黄酮是一种低极性的物质，通过低极性正己烷的萃取后，使粗提物中川陈皮素和桔皮素两种多甲氧基黄酮成分含量得到提高，其中，川陈皮素含30.8％，桔皮素含22.7％(见实施例1)； \n[0019] (2)本发明粗提物的纯化工艺简单易行，无需大型、贵重的设备，只需层析柱和一些常规设备就可进行；且其所用的大孔树脂和溶剂乙醇都容易得到，对人体也较安全、可靠，并可重复多次利用，几乎没有排放； \n[0020] (3)本发明所选用的大孔树脂都是对多甲氧基黄酮具有较高的吸附率与洗脱率，因此对柑桔多甲氧基黄酮粗提物具有较高纯化效果，其总含量可达74.5-82.1％；总回收率可达45.9-68.6％(见表1)； \n[0021] 表1各实施例的纯化效果 \n[0022] \n[0023] (4)本发明是在对每管洗脱液进行分析检测后，明确洗脱纯化工艺的前半段以获得川陈皮素为主，后半段以获得桔皮素为主的基础上，通过将洗脱液分前后两段收集，并分别减压浓缩、回收乙醇、烘干粉碎后，得到纯度较高的川陈皮素和桔皮素的纯化物；这为今后对柑桔多甲氧基黄酮不同成分的分别利用 创造了条件； \n[0024] (5)综合以上几点，本发明方法投入低，见效快，易于工业化生产。 附图说明\n[0025] 图1：柑桔多甲氧基黄酮粗提物的提取与纯化的流程示意图 \n[0026] 图2：川陈皮素的标准图谱 \n[0027] 图3：桔皮素的标准图谱 \n[0028] 图4：以川陈皮素为主的纯化物的高效液相图谱 \n[0029] 图5：以桔皮素为主的纯化物的高效液相图谱 \n具体实施方式\n[0030] 通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。 [0031] 材料说明： \n[0032] 层析柱：内径26mm，长度30cm，上海厦美生化科技发展有限公司。 [0033] 大孔树脂：AB-8、NKA-9、D-101为南开大学化工厂生产，DM312为沧州宝恩吸附材料科技有限公司生产。 \n[0034] 蠕动泵：BT00-300T保定兰格恒流泵有限公司生产。 \n[0035] 实施例1：(柑桔多甲氧基黄酮粗提物的提取与纯化方法1)\n[0036] (1)柑桔多甲氧基黄酮的提取： \n[0037] 1)柑桔皮的预处理：将柑桔皮干燥至含水量≤5％，磨粉过30目筛后，备用； [0038] 2)柑桔多甲氧基黄酮的粗提与萃取：将柑桔皮粉500g和水5.0L拌匀，加热到\n100℃提取1h、过滤得水提液；将水提液与正己烷按体积比1∶0.5混合、萃取；将萃取液在\n40℃下减压蒸干，得到柑桔多甲氧基黄酮粗提物；经HPLC分 析，该粗提物中含川陈皮素为\n30.8％，桔皮素为22.7％； \n[0039] (2)柑桔多甲氧基黄酮粗提物的柱层析纯化； \n[0040] 1)粗提物溶液的配制：将柑桔多甲氧基黄酮粗提物5g溶解50％乙醇溶液500ml中，滤纸过滤后，备用； \n[0041] 2)大孔树脂装柱：把预处理后的大孔树脂D-101装入层析柱中至柱高25cm，并要求柱内填装树脂至紧实； \n[0042] 3)大孔树脂的吸附：把上述粗提物溶液500ml，用蠕动泵以1ml/min流速，化\n8.33h流经层析柱，并收集流出液；经分析多甲氧基黄酮含量，可知层析柱对多甲氧基黄酮的总吸附率为99％； \n[0043] 4)大孔树脂的洗脱、收集与浓缩干燥：先用蒸馏水以1ml/min的流速冲洗步骤(2)-3)层析柱1～2h洗去杂质；然后以80％乙醇水溶液500ml为洗脱液，用蠕动泵以1ml/min流速流经层析柱，以每40ml为一管进行成分测定并收集，其中，将1至6管的洗脱液合并得洗脱液1，把其余的洗脱液合并得洗脱液2；将洗脱液1与2分别减压浓缩、回收乙醇，残留物烘干、粉碎后，从前者得到以川陈皮素为主的纯化物1为1.012g，其中桔皮素和川陈皮素的含量分别为18.2％和63.9％；从后者得到以桔皮素为主的纯化物2为0.49g，其中桔皮素和川陈皮素的含量分别为44％和33.5％；柑桔多甲氧基黄酮总回收率为68.6％。 [0044] 实施例2：(柑桔多甲氧基黄酮粗提物的提取与纯化方法2)\n[0045] 本例中，步骤(2)柑桔多甲氧基黄酮粗提物的柱层析纯化； \n[0046] 1)粗提物溶液的配制：将柑桔多甲氧基黄酮粗提物5g溶解于30％乙醇溶液\n500ml中； \n[0047] 2)大孔树脂装柱：把预处理后的大孔树脂DM312装入层析柱中至柱高20cm； [0048] 3)大孔树脂的吸附：把粗提物溶液500ml，用蠕动泵以1.5ml/min流速，化5.56h流经层析柱，并收集流出液；经分析多甲氧基黄酮含量，可知层析柱对多甲氧基黄酮的总吸附率为80％； \n[0049] 4)大孔树脂的洗脱、收集与浓缩干燥：以100％的乙醇500ml为洗脱液；将1至6管的洗脱液合并得洗脱液1，把其余的洗脱液合并得洗脱液2；从洗脱液1得到纯化物1为\n0.824g，其中桔皮素和川陈皮素的含量分别为20.6％和59.7％；从洗脱液2得到纯化物2为0.41g，其中桔皮素和川陈皮素的含量分别为38％和36.5％；柑桔多甲氧基黄酮的总回收率为56.4％； \n[0050] 其余步骤工艺同于实施例1。 \n[0051] 实施例3：(柑桔多甲氧基黄酮粗提物的提取与纯化方法3)\n[0052] 本例中，步骤(2)柑桔多甲氧基黄酮粗提物的柱层析纯化； \n[0053] 1)粗提物溶液的配制：将柑桔多甲氧基黄酮粗提物5g溶解40％乙醇溶液500ml中； \n[0054] 2)大孔树脂装柱：把预处理后的大孔树脂AB-8装入层析柱中至柱高15cm； [0055] 3)大孔树脂的吸附：把粗提物溶液500ml，用蠕动泵以2.0ml/min流速，化4.17h流经层析柱，并收集流出液；经分析多甲氧基黄酮含量，可知层析柱对多甲氧基黄酮的总吸附率为68％； \n[0056] 4)大孔树脂的洗脱、收集与浓缩干燥：以60％的乙醇500ml为洗脱液；将1至7管的洗脱液合并得洗脱液1，把其余的洗脱液合并得洗脱液2；从洗脱液1得到纯化物1为\n0.684g，其中桔皮素和川陈皮素的含量分别为18.3％和55.8％；从洗脱液2得到纯化物2为0.32g，其中桔皮素和川陈皮素的含量分别为34.5％和35.6％；柑桔多甲氧基黄酮的总回收率为45.9％； \n[0057] 其余步骤工艺同于实施例1。 \n[0058] 试验例1：(大孔树脂对柑桔多甲氧基黄酮吸附率与洗脱率的筛选) [0059] 参筛大孔树脂的种类；AB-8、NKA-II、NKA-9、D-101、HPD100、HPD300、D312、DM312 [0060] 筛选的目标：筛选出对川陈皮素和桔皮素具有较高的吸附和洗脱率的树脂。 [0061] 1)吸附液的预备：分别以含川陈皮素单体5～10g/L的30～50％的乙醇溶液，和含桔皮素单体1.9～3g/L的30～50％的乙醇溶液为吸附液，备用； \n[0062] 2)树脂吸附率的测定：取上述两种吸附液各20ml，分别加入已装有经预处理(方法：先用95％的乙醇浸泡8～12h，用水洗净乙醇，再用2％的NaOH溶液浸泡4～8h，水洗至中性，最后用5％的盐酸溶液浸泡2～4h，水洗至中性即可)大孔吸附树脂2～8g的容器中，经摇床处理24h后，吸取上清液各10ml，分别蒸干后称得残渣重量X1和X2，以C1和C2为吸附液中川陈皮素和桔皮素单体的原始重量，则树脂吸附量分别为C1-X1和C2-X2，并计算出树脂对两种单体的吸附率； \n[0063] 3)树脂洗脱率的测定：将步骤2)的树脂沥干，先用10～20ml的蒸馏水洗涤1-2次，以除去杂质，再将70～100％的乙醇20ml为洗脱液加入树脂中，经摇床处理24h后，吸取10ml上清液、蒸干，称得残渣重量G1和G2，并计算解吸率； \n[0064] 经上述方法测定后，从参筛大孔树脂中筛选出对柑桔多甲氧基黄酮吸附率与洗脱率均较高的大孔树脂——AB-8、NKA-9、D-101和DM312。 \n[0065] 试验例2：(柑桔多甲氧基黄酮粗提物采用不同纯化方法的效果比较) [0066] 本例把本发明的纯化效果与目前报道的各种纯化方法的纯化效果作一对 比，具体见表2。 \n[0067] 其中，①、②、③为本发明实施例1、2、3的纯化样品，川陈皮素与桔皮素的含量分别为纯化物1和纯化物2中的含量，总含量指纯化物1中两种黄酮的总含量。 [0068] 表2多甲氧基黄酮不同纯化该法的效果对比 \n[0069]