大量生产属于桉树属木本植物的无性系植物幼苗的方法

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本发明涉及一种通过组织培养大量生产属于桉树属木本植物的 幼苗进行造林的方法。可应用于林业，生物，组织培养，农业等等。
桉树如柠檬桉(下文简称“E.citriodora”)是起源于澳大利亚 并属于桃金娘科的木本植物。它们主要被用作纸浆原材，取火木材 和建筑材料。已知有600多种桉树属木本植物品种，其中的一些价 值很高，因为它们有极好的基本密度和纸浆产量，而这些是生产纸 浆和纸的重要因素。也就是说，属于桉树属的木本植物是很好的纸 浆原材和森林资源，具有植树造林价值。因此在欧洲，南美和东南 亚，这些树已被大量造林。
在那些属于桉树属木本植物中，例如巨桉和赤桉，可容易地通 过剪枝繁殖而不需任何设备。因此在巴西和泰国，通过剪枝、增大 产量和改进树的质量已生产了有极好特性的这些树的无性系作为造 林的植物幼苗，但是也有一些品种很难通过剪枝繁殖，这些品种的 例子包括蓝桉(下文简单地称作“E.globulus”)，直杆蓝桉，bi- costata桉和柠檬桉，它们是极好的纸浆原材。因此应当通过种子 繁殖进行增殖，应用树苗来造林。
在这种情况下，植物幼苗在遗传上具有较少一致性，这导致个 体间生长差异，作为结果引发出的问题是：(1)总体上只能得到较 低的产量，(2)很难估计产量，(3)在生长等方面有极好特性的无性 繁殖系，如果有的话，不能繁殖。
因此在用剪枝很难繁殖的这些物种中，急需探索一种具有极好 遗传性并有同源特征的无性系繁殖方法。和剪枝方法一样，一般都 知道所谓的组织培养法可作为树无性系繁殖的方法，其中植物由植 物组织器官中再生。除上文提到的桉树外，剪枝繁殖主要被广泛用 于针叶树，如雪松，因为这种繁殖以低成本就易实现。
另一方面，组织培养方法具有优点，因为在重复植物再生前， 通过由植物组织器官得到的组织的继代培养，可在有限的地域内实 现大量繁殖。因此，最近几年，该方法被积极地研究。现在，通过 组织培养的无性繁殖系的繁殖方法已被应用到兰花，蔬菜等，一些 品种已经投入实际应用。近来也做了努力将这种方法应用于树，据 报导有些植物，例如麻栎(Quercus acutissima Carr)和白桦(Bet- ula platyphylla)，Sukatchev Var.，白桦(japonica Hara.)由 此成功再生(Propagation and Breeding of Arboreous Plant， Nogyo Tosho，pp.115-129，pp.157-165，1989)。
然而，在这些树品种中，植物只能在现期由植物器官再生。也 就是说，在实现大量生产体系之前还有很长的路要走。然而在这里 应该指出，除了通过组织培养的无性系繁殖方法外没有方法能提供 难以用剪枝繁殖的树的造林用植物幼苗。
通过接着原代培养的组织培养生产植物幼苗的过程包括四个步 骤，即芽的繁殖，芽的生长，生根，和水土适应。除外情况是，对 于一些植物(例如，烟草，胡罗卜，秋海棠，Saintpaulia)可以在 一个步骤中简单实现这些过程，其中繁殖，生长和生根在同种培养 基中进行，不需要移植。
另一方面，为生产许多其它植物的，特别是树的植物幼苗，上 面提到的每一步骤应该完全实施。而且，每一步骤的条件(例如繁 殖的条件)，在品种和品种间经常是不同的，这一点是公认的。所 有步骤中，大量生产植物幼苗中的最大障碍是由生根至水土适应阶 段，其中生长的芽已经生根，并且幼小植物使它们自身适应外部的 环境。这些步骤是复杂和繁琐的并且需要特定设备。因此，实践中 通过组织培养大量生产用于造林的植物幼苗的关键点，在于怎样容 易且高效地使其生根并水土适应。从这一点出发，已经讨论了通过 直接生根方法节省劳力和费用，其中生根和水土适应作为一步来完 成。但是，在植物组织培养基中使其生根，也作为各种细菌营养源 的蔗糖通常被用作碳源。因此，培养物应由熟练技术人员无菌制备。 而且因此需要劳力和设备。偶尔当这些组织是非无菌培养，则产生 问题：植物由于细菌污染而枯萎至死。因此不能得到健壮的植物幼 苗。
而且在生根培养物中使用了用琼脂或gellan gum固化的培养基， 生根步骤后需要通过冲洗去除这种固化剂。这一操作引起了其它问 题，根须因此被损伤，导致成活植物幼苗的比例降低，同时需要更 多的劳动(量)。特别是以纸浆原材为生产目的的造林，需要马上提 供几万至几百万植物幼苗，尽管植物幼苗数目根据要被种植的土地， 造林规模等等需要大的改变。为了通过组织培养方法提供植物幼苗 用于造林，因而希望迅速建立植物幼苗的大规模生产体系，它能实 现极高的繁殖效率，涉及较少步骤并在此方法中不需要繁琐程序。
在这些背景下，本发明人对属于桉树属木本植物的无性系植物 幼苗的大量生产方法进行了深入细致的研究。作为结果，本发明人 发现通过由属于桉树属木本植物的器官开始，培养，诱生聚花芽 (multiple shoots)，并且重复繁殖，在一步中非无菌条件下使其生 根并水土适应而不加任何碳源如蔗糖，因而使植物(即组织培养产物) 通过光合作用自己提供所需碳原子，而且使用了能使培养产物与培 养基载体一起移植的多孔培养基载体(porous medium support)， 可实现想要实现的大量生产。本发明是以这一发现为基础完成的。
因此，本发明的一个目的是提供一种属于桉树属木本植物无性 系植物幼苗大量生产的方法，它可实现极高繁殖效率，包括较少步 骤和不需要繁锁程序。
本发明的另一目的是提供一种属于桉树属木本植物无性系植物 幼苗的简便的大量生产法，而常规方法中要求的所有生根，生根后 洗去培养基，水土适应，移植步骤和每一步骤的麻烦过程，在不需 要任何特殊设备的情况下可被简化或省略。
本发明的这些和其它目的可以通过属桉树属木本植物的无性系 植物幼苗的大量生产方法来实现，其中所述方法包括以下步骤：将 通过无菌培养其器官产生的大量聚花芽的芽，或者由其种子进行无 菌培养的芽，移植到多孔培养基载体上，所述可渗透培养基载体用 含有无机盐且不含任何碳源如蔗糖的人工液体培养基浸润，在存在 湿度和二氧化碳气体条件下照射，使其非无菌生根和水土适应。
现在将更详细地描述本发明。
首先将要说明怎样由属于桉树属木本植物的器官得到芽。在本 发明中，可用常规方法得到芽。例如当使用户外培养或生长的桉树 属木本植物个体为起始原料时，由其枝干得到含有腋生芽的组织用 杀菌剂如安替佛民(antiformin)消毒。然后接种到固化培养基中(例 如，Murashige-Skoog培养基(1962)，T.Murashige和F.Skoog， Physiol.Plant，15：431-497，下文中将称为“MS培养基”)，在 照射条件下培养以使腋生芽生长。接着将如此生长的腋生芽移植到 含有植物生长调节剂，例如0.1至1mg/l 6-苄基氨基嘌呤(一种细 胞分裂素)的固体培养基中(例如，MS培养基)，在其中培养诱导生成 聚花芽。或者，摇动下在液体培养基(例如，含有0.1至1mg/l 6- 苄基氨基嘌呤的MS培养基)中培养如此生长的腋生芽以诱导形成大量 分生组织(即芽原基)，该组织通过移植到例如，含0.1至1mg/l 6- 苄基氨基嘌呤的固体培养基中并静态培养，能分化并生成芽。当使用 种子为起始材料时，将其接种到合适的固体培养基上，如MS培养基， 然后在照射的条件下培养使其萌芽而得到芽株。这样得到的芽上取下 芽尖或含芽尖的组织。通过使用这一组织，用上文描述的相同方法可 以生成大量的聚花芽。
下面将详细说明本发明的生根/水土适应步骤。将如此得到的 芽移植到多孔培养基载体上，该多孔培养基载体被含有无机盐且不 含任何碳源如蔗糖的人工液体培养基浸润，然后可在其中进行生根 和水土适应。
植物固有地不需要蔗糖作为碳源，因为它们独立地光合成它。 但是，培养组织或培养细胞一般具有较差的或不具有光合成能力。 因此向培养基中加入蔗糖作为所需的碳源以生成在这种组织培养方 法中细胞生长和代谢所必需的碳骨架和能量。然而在本发明中通过 提供二氧化碳(CO2)气体促进了培养组织的光合成，因此不需要 蔗糖作碳源。也就是说，本发明的生根/水土适应步骤是在只含有 无机盐和优选至少一种维生素的液体培养基中进行的。例如，用含 主要基本元素(H，O，N，P，K，S，Ca和Mg)试剂和含7种微量元素 (Fe，Mn，Cu，Zn，Mo，B和Cl)的试剂一起适当制备人工液体培养基。 在本发明中也能使用由已知成份(例如，MS培养基，Gamborg B5培养 基)组成的培养基或将这些培养基稀释2倍制得的培养基。
无机盐的例子包括NH4NO3，(NH4)2SO4，KNO3，KCl，K2SO4， CaCl2·2H2O，Ca(NO3)2·4H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4，NaH2PO4·H2O， NaH2PO4·2H2O，FeSO4·7H2O，Na2-EDTA，FeNa-EDTA，Fe-EDTA， MnSO4·H2O，MnSO4·4H2O，Na2SO4，ZnSO4·4H2O，ZnSO4·7H2O， CoCl2·6H2O，CuSO4·5H2O，Na2MoO4·2H2O，KI，H3BO3， 和MoO3。(EDTA为乙二胺四乙酸)
维生素的例子包括烟酸，盐酸吡哆素，盐酸硫胺素，肌醇，L -甘氨酸，L-谷氨酰胺，L-天冬酰胺，L-精氨酸，和L-蛋氨酸。
而且下面给出不含蔗糖的MS培养基和Gamborg B5培养基的组成。
              培养基组成(mg/l)
成份             MS培养基           Gamborg B5培养基
NH4NO3         1,650                    0
(NH4)2SO4     0                        134
KNO3            1,900                    3,000
CaCl2·2H2O    440                      150
MgSO4·7H2O    370                      250
KH2PO4         170                      0
NaH2PO4·2H2O 0                        169.6
FeSO4·7H2O    27.8                     0
Na2-EDTA             37.3                  0
FeNa-EDTA             0                     40
MnSO4·4H2O         22.3                  13.2
ZnSO4·4H2O         8.6                   0
ZnSO4·7H2O         0                     2
CoCl2·6H2O         0.025                 0.025
CuSO4·5H2O         0.025                 0.025
Na2MoO4·2H2O      0.25                  0.25
KI                     0.83                  0.75
H3BO3               6.2                   3
烟酸                   0.5                   1
盐酸吡哆素             0.5                   1
盐酸硫胺素             0.1                   10
肌醇                   100                   100
L-甘氨酸               2                     0
在本发明中，由于不需要在培养基中有蔗糖为碳源，因此不向 其中加入蔗糖。作为结果，有可能使用本领域通常使用的工具进行 非无菌生根和水土适应。本发明生根步骤使用生长素作为植物生长 调节剂的例子包括吲哚丁酸(IBA)，萘乙酸，吲哚乙酸(IAA)和二氯 吲哚乙酸。为了促使生根，以0.01至10mg/l的量向培养基中加入 这种物质。
用含有无机盐的人工液体培养基浸润的多孔培养基载体的例子 包括渣棉，果肉，酚醛树脂，泥炭苔藓，蛭石和陶瓷纤维。
在植物的组织培养中，一般使用琼脂，gellan gum等类似物固 化的培养基。但在这些培养基中只能得到非常不理想的根生成比。 而且由于这些培养基没有中空，其中，属于桉树属木本植物的小根 的生成显著低劣。而且，当这样生成的植物幼苗被移植入小盆或类 似器皿中进行水土适应时，需要洗掉固化剂如琼脂，而这一程序会 损伤根茎。作为结果，在这一水土适应过程中许多植物枯萎而死。 而另一方面，本发明生根/水土适应步骤中，在供有CO2气体的 多孔培养基载体上培养组织，不加入任何蔗糖，因此实现了光自养。 所以生成了强健的根和叶上的正常气孔。而且，这样得到的植物幼 苗可处理成所谓的插入式植物幼苗，它可与培养基载体一起被移植。 因此这些植物幼苗可容易地移植到小盆或类似器皿中。而且这样得 到的无性系植物幼苗能极好生长，最后可得到坚硬的桉树属木本植 物的无性繁殖系植物幼苗。
优选生根/水土适应步骤是在照明度为1000至6000勒克司的照 射条件下进行的。当照明度小于1000勒克司时，光合成不能充分进 行，并且发现有胼胝体生成。另一方面，当照明度超过6000勒克司 时，生长受到抑制，另外增加了经济损失。另外照射优选通过16小 时光照期和8小时黑暗期重复进行。因为光合成是在光照期进行的， 因此优选只在光照期将CO2气体浓度调节在下述水平上。因此可加 速光合成，并经济地得到壮实的植物幼苗。也优选控制温度至22 至26℃，因为桉树属木本植物喜好温和气候，并且在18至28℃温度 范围内生长良好。
优选控制CO2气体浓度至200至3500ppm。当CO2气体浓度低于 200ppm时，没有充分的光合作用进行。另一方面，当CO2气体浓度 超过3500ppm，不能再提高光合成水平。偶然，当在生根一步中使 用了密封培养容器，随着培养组织生长，容器中CO2气体浓度低于 100ppm或更少，将导致降低光合成能力。因此，通常在称为异养 生物条件下进行该步骤，如同时加入碳源如蔗糖。
在生根/水土适应步骤中，优选调节湿度至70至100％高水平。 当湿度低于70％时，由于旺盛的蒸腾作用，植物常常枯萎至死。它 可在70％或更高湿度下很好生长。
通过下面的实施例可更详细地解释本发明，但应该认为本发明 并不局限于此。
                     实施例1
从柠檬桉成树(8年)上取当年生成的枝，并由其制备含腋生芽 的组织。用1％有效氯气浓度进行消毒处理15分钟后，将这些组织 接种到含0.1mg/l 6-苄基氨基嘌呤(BAP)的MS固体培养基中(ge- llan gum＝0.25％)。大约一个月后，腋生芽长长，且在一些组织 中，长出了新的腋生芽并长长。
将如此长长的这些腋生芽接种到含0.2mg/l BAP的MS固体培养 基中(见上述)，然后，大约一个月后，生成了聚花芽。以一个月的 间期继代培养繁殖这样生成的聚花芽。同时这些聚花芽的每一芽继 续长长。接连剪下这些长长的芽，并种植到用液体培养基湿润的渣 棉块上，所述液体培养基是用于生根和水土适应的，通过将不含蔗 糖的MS培养基稀释2倍，并向其中加入0，0.01，0.02或0.2mg/l IBA而制得的。
在大约2000勒克司(光照期：每天16小时)的照射，湿度为80± 10％，温度为24±1℃的条件下，同时调节CO2气体浓度至300±100 ppm，非无菌条件进行生根和水土适应。为了对照，使用含0.02mg /l IBA作为植物生长调节剂，除用培养基载体中的gellan gum代替 渣棉，或除了不调节CO2气体浓度外，用相同方法进行了该过程。
大约2至3星期后，在其中使用了渣棉并调节了CO2气体浓度 的试验地片，发现生根的比例至少为90％。特别是，在其中使用了 含0.1至0.2mg/l IBA液体培养基的地片得到了形态极好的植物幼苗。 大约4周后(从为生根和适应水土而培植芽算起)，出现根生成的植物 幼苗与培养基载体一起移植到装有土壤的苗圃小盆中，用常规方法 使其在温室中生长。大约1个月后，这些植物幼苗长至15cm高，可用 于造林。
结果可见下面表1。
                               表1
                         植物小苗成活比例
IBA       培养基载体      被试验外      生根的植       成活的植物
                        植体数目      物幼苗数       幼苗比例**
(mg/l)                                                          
                                                          (％)
0         渣棉               50             36             72
0.01      渣棉               50             45             90
0.02      渣棉               50             49             98
0.2       渣棉               50             48             96
0.02*    渣棉               50             0              0
0.02      gellan gum         50             6              12
*：没有调节CO2气体浓度

如表1所示，在其中调节CO2气体浓度且使用渣棉的被试地块中， 无论加入IBA与否，都可得到超过70％的存活植物幼苗的最终比例。 相反，在使用gellan gum培养基的对比地块中，只能得到大约10％ 的低的成活植物幼苗比例。而且，在其中未调节CO2气体浓度的对 照地块，发现没有根生成，即成活植物幼苗比例为0％。这里所用的 术语“成活植物幼苗比例”是指在生根/水土适应这步中，在根生成 后移植到苗圃小盆，并使其在温室中正常生长的植物幼苗(表1中称 为“生根植物幼苗”)与用于生根/水土适应步骤的芽(表1中称为“被 试验外植体”)之间的比率。
当如此再生用于造林的植物幼苗在户外种植时，与籽苗相比， 它们更均匀而茁壮地成长。
                       实施例2
将长长的芽从按照实施例1相同的方法得到的聚花芽上剪切下 来，并接种到用不含蔗糖的MS培养基浸润的果肉上，所述MS培养基 已被稀释2倍，含有0.2mg/lIBA。
然后在大约2000勒克司的照射条件下(光照时间：每天16小时)， 并且湿度80±10％，同时调节CO2气体浓度为300±100ppm，在24 ±1℃温度下非无菌进行生根和水土适应。作为结果，大约2至3周 后发现根生成。生根/水土适应步骤开始后大约4周，这些生根的植 物幼苗和培养基载体一起移植到苗圃小盆中以常规方式生长。一个 月后，得到15cm高用于造林的植物幼苗。在这种情况下，可得到 高达95％的成活植物幼苗比例。
                       实施例3
从蓝桉成树(6年)上取当年生成的枝，并由其制备含腋生芽的 组织。用有效氯气浓度为1％进行消毒处理20分钟后，将这些组织 接种到含0.1mg/l BAP的MS固体培养基中(琼脂＝0.85％)。然后大 约一个月后，得到长长的腋生芽。
将这些腋生芽接种到含0.1mg/l BAP的MS固体培养基中(gell- an gum＝0.25％)。大约一个月后，由这些芽的基部生出了新鲜的 芽，因而形成聚花芽。然后将这样生成的聚花芽移植到含0.2至1.0 mg/l N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS固体培养基中(见上文)。以一 个月的间隔断代培养繁殖，同时这些聚花芽的每一芽继续长长。随 后，剪切下这些长长的芽，并在泡沫酚醛树脂块上(OASISTM，由Ni- ppon Soda Co.Ltd.制造)种植。所述酚醛树脂块被向用于生根和水 土适应的四倍稀释的不含蔗糖的MS培养基中加入1.0mg/l IBA，0.2， 0.5或1.0mg/l 5，6-二氯吲哚乙酸(Cl2-IAA)；或10mg/l IAA 而制得的液体培养基润湿而成。
在大约5000勒克司照射下(光照期：每天16小时)，湿度为80％ 或更高，同时调节CO2气体浓度至300，1000或3000±100ppm，在 24±1℃温度下非无菌进行生根和水土适应。为了对照，除不调节 CO2气体浓度外，用含有0.2或0.5mg/l Cl2-IAA作为植物生长调节 剂的培养基以相同方法进行这些程序。
大约4周后，除对照地块以外的植物芽都生了根。然后将这些 植物幼苗与培养基载体一起被移植到含土壤的苗圃盒中并以常规方 式在温室中生长，一个半月后，其长至20cm高可用于造林。
下面的表2给出结果。成活植物幼苗比例的含义与实施例1相同。
                             表2
                       成活植物幼苗比例
植物生长调     CO2      被试外      生根植       成活植物
节剂           浓度     植体数      物幼苗数     幼苗比例**
(mg/l)        (ppm)                                 (％)
IBA      1.0   300        36           13            36
IBA      1.0   1000       36           18            50
IBA      1.0   3000       36           15            42
Cl2-IAA 0.2   300        36           19            53
Cl2-IAA 0.2   1000       36           33            92
Cl2-IAA 0.2   3000       36           28            78
Cl2-IAA 0.5   300        36           18            50
Cl2-IAA 0.5   1000       36           35            97
Cl2-IAA 0.5   3000       36           26            72
Cl2-IAA 1.0   300        36           14            39
Cl2-IAA 1.0   1000       36           24            67
Cl2-IAA 1.0   3000       36           20            56
Cl2-IAA 0.2   *          36           0             0
Cl2-IAA 0.5   *          36           0             0
IAA      10    300        36           21            58
IAA      10    1000       36           27            75
IAA      10    3000       36           22            61
*：没有调节CO2气体浓度

从表2可清楚地看出，在CO2气体浓度被调节的试验地块可得到 超过35％的成活植物幼苗比例。与之相反，与上面提到的实施例1 相似，在二氧化碳浓度未被调节的对照地块，没有发现出根(即成 活植物幼苗比例＝0％)。
当在户外种植这样再生的用于造林的植物幼苗时，与籽苗相比， 它们更均匀、茁壮地成长。
如上文所讨论的，本发明提供了一种非常方便的桉树属树无性 繁殖系植物幼苗的生产方法，简化或省略了常规方法中全部需要做 的生根，生根后洗去培养基，水土适应，移植步骤和每一步骤中存 在的繁锁程序，而不需要任何特定设备。而且，在本发明中，出现 根生成的植物幼苗可容易地与培养基载体一起被移植到苗圃小盆中， 在合适的土壤中用与籽苗相同的方法(培养)生长。因此，能大量提 供具有极好性能的纸浆原材，使本发明方法从造林角度看具有很高 价值。