一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其制备方法

1.一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒，包括：
1)重组乙型肝炎病毒x蛋白；
2)抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体阴、阳性对照品；
3)酶标记结合物；
4)显色底物；
5)浓缩洗涤液，
其中，所述酶标记结合物保存在酶标工作液中，所述酶标工作液为以三蒸水配PH7.2的磷酸盐缓冲液，内含0.5％～2％BSA；0.5％酶保护剂；0.05％Proclin-300及以0.1％Tween-
20。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述重组乙型肝炎病毒x蛋白序列如SEQ ID No.1所示。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包被所述重组乙型肝炎病毒x蛋白的固相载体为微孔板。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检测抗体。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
6.权利要求1-5任一项所述的试剂盒在检测抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体中的应用。
7.权利要求1-5任一项所述的试剂盒在制备用于肝癌诊断的试剂盒中的应用。
8.一种制备权利要求1-5任一项所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤:
1)通过原核载体表达重组乙型肝炎病毒x蛋白；
2)制备包被所述重组乙型肝炎病毒x蛋白的固相载体；
3)以抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体阴、阳性血清制备对照品；
4)以酶标记检测抗体；
5)配制显色底物；
6)配制浓缩洗涤液；
7)分装所述抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体阴、阳性对照品、酶标记结合物、显色底物及浓缩洗涤液；
8)组装为成品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，制备包被所述重组乙型肝炎病毒x蛋白的固相载体的步骤2)采用以下方法:
1)包被：用0.02M PH值为8.5的磷酸缓冲液配制成所需浓度的所述重组乙型肝炎病毒x蛋白包被液，并将包被液负载于固相载体上；
2)封闭：用含5％酪蛋白或5％脱脂奶粉PH值为6.8-7.3，浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液作为封闭液封闭所述固相载体。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述包被重组乙型肝炎病毒x蛋白的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检测抗体；所述显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。
12.一种用于肝癌诊断的定量检测试剂盒，包括相互独立的抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体定量检测单元和甲胎蛋白定量检测单元。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体定量检测单元至少包括包被抗乙型肝炎病毒x蛋白的固相载体和抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体阴、阳性对照品；所述甲胎蛋白定量检测单元至少包括包被甲胎蛋白抗体的固相载体和甲胎蛋白阴、阳性对照品。
14.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体定量检测单元是如权利要求1-4所述的抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒。
15.如权利要求12-14任一项所述的试剂盒在制备用于肝癌诊断的免疫测定试剂盒中的应用。

一种抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其制\n备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及生物技术和免疫学领域，具体涉及检测肝癌标志物乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)抗体的试剂盒。\n背景技术\n[0002] 人体我国每年约有11～13万人死于原发性肝癌，占全球肝癌死亡数的半数之多。\n近年来，通过提高肝癌早期诊断率、改进肝癌切除方法和实施肝移植等手段，我国部分肝癌高发地区的死亡率有所下降,但是肝癌总体的发病率仍然呈上升趋势。\n[0003] 目前，影像学诊断、细胞与组织学诊断及化学诊断是肿瘤诊断的三大主要方法。影像学诊断在肝癌诊断中起重要的作用，但是在诊断小肝癌及区分良恶性结节中均具有一定的局限。超声检查或CT阳性结果，结合血清甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)水平高于400ng/ml的检测结果，可对肝癌做出确诊。但是，通常当这些条件都符合时，己经错过了治疗的最佳时机。无论是超声波检查、CT扫描还是核磁共振，对小病灶的鉴定都有一定的局限性，尤其是肝硬化结节在影象学上与小肝癌结节有许多的相似之处。因此，虽然影像学技术在今年来取得了巨大的进步，但临床上仍需结合肝癌的分子标志物，在较为复杂的病例中将良恶性肝病进行区分。\n[0004] 目前肝癌诊断最常用的标志物是甲胎蛋白(AFP)，在症状和影像学改变发生前数月即可出现异常。正常人血清中AFP含量一般小于10ng/ml。当AFP的诊断值定为20ng/ml时，其敏感性为50％-60％，但在肿瘤较小的病例中，敏感性显著降低，有报道仅为40％。单独使用AFP作为肝癌诊断标志物的另一个问题是缺乏特异性，在相当多的慢性肝炎患者尤其是肝硬化患者中，AFP含量也达20-200ng/ml。目前认为可与AFP互补诊断的标志物有AFP异质体、Y一谷氨酞转移酶同工酶Ⅱ和异常凝血酶原等，但由于它们在敏感性和特异性上的不足，以及检测方法的繁琐复杂，使其始终停留在实验室研究水平，未能转化成临床常规检查项目。因此，探索新的肿瘤分子标志物，以及建立相应的易于推广的检测方法，仍是当今肝癌研究领域的重要课题之一。\n[0005] 随着对HBV和原发性肝癌研究的深入，人们发现HBV中的x基因表达产物(HBx)在肝癌形成过程中起着关键的作用。在诱发肝细胞癌的众多因素中，乙型肝炎病毒感染占到\n50％以上。最新的研究显示，HBx具有广泛的基因转录调控作用，与慢性HBV感染者发展成为HCC密切相关。x基因位于HBV基因组的1374-1836位置，编码155个氨基酸的多肽，即HBx。x基因常随HBV基因组一同整合于肝细胞的染色体中，利用宿主细胞转录和翻译体系合成HBx。\nHBx具有广泛的基因转录调控作用，不仅能够激活病毒基因调控序列，而且能够与宿主细胞多种蛋白相互作用，从而影响宿主细胞周期、影响细胞增殖分化与凋亡、使肝细胞发生恶性转化。HBx可与转录因子XPA-1、DDB1、RPB5和TFIIB结合，以提高基因转录水平、抑制DNA的修复、促进病毒自身复制；HBx还具有反式激活作用，可上调多种细胞因子及其受体，如血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)及其受体的表达；激活C-myt、N-ras等癌基因，与抑癌基因p53结合，抑制P53的核转移及正常的转录调节功能。此外，HBx还可上调HepG-2的细胞端粒酶活性，改变抑癌基因p55负调控功能，抑制细胞凋亡，四细胞发生恶性转化，与HCC的发生密切相关。近几年国外研究显示，在HBV感染后约60％肝癌患者血清中可检测到HBx抗体。血清HBx抗体水平可能成为一种新型的肝癌标志物。\n[0006] 目前，免疫分析技术在乙型肝炎病毒x蛋白抗体免疫分析产品的应用方面仍未见。\n因此，本领域迫切需要开发可灵敏检测乙型肝炎病毒x蛋白抗体的检测系统及检测方法，为临床肿瘤的诊断提供良好的途径。\n发明内容\n[0007] 本发明提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测乙型肝炎病毒x蛋白抗体的试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。\n[0008] 本发明提供了一种抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒及其制备方法。\n[0009] 该抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒包括：1)重组乙型肝炎病毒x蛋白；2)抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体阴、阳性对照品；3)酶标记结合物；4)显色底物；5)浓缩洗涤液。\n[0010] 在本发明中，重组乙型肝炎病毒x蛋白包含至少一个乙型肝炎病毒x蛋白的抗原表位，以便结合于抗乙型肝炎病毒x蛋白的抗体。该重组乙型肝炎病毒x蛋白可进一步含有乙型肝炎病毒x蛋白的全长或部分氨基酸序列，以增加特异性免疫反应。并且各个该乙型肝炎病毒x蛋白的抗原表位之间、各个该乙型肝炎病毒x蛋白的部分氨基酸序列之间以及乙型肝炎病毒x蛋白的抗原决定位与乙型肝炎病毒x蛋白的部分氨基酸序列之间可进一步由连接片段连接。在本发明的一个实施例中，重组乙型肝炎病毒x蛋白序列如SEQ ID No.1所示。\n[0011] 理想的固相载体应与重组乙型肝炎病毒x蛋白有较高的结合容量，且结合稳定极少脱落；并且其可结合抗原或抗体免疫反应物，以及如亲和素或链霉亲和素等大分子蛋白质；重组乙型肝炎病毒x蛋白固相化后仍应保持活性，而且为有利于反应充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液；此外，固相化方法应简便易行、快速经济。在本发明中，固相载体可以采用塑料制品，使得重组乙型肝炎病毒x蛋白可通过非共价或物理吸附机制结合到固相载体表面，比如：聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板。固相载体也可以采用微颗粒，此类固相载体系由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米(μm)，由于带有能与蛋白质结合功能团(如－NH2、－COOH、－OH、－CHO或－NH－NH2等)，易与抗体(抗原)形成化学偶联，且结合容量大。并且，固相载体还可以采用膜载体，包括硝酸纤维素膜(nitrocellulose，NC)玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。优选地，在本发明的一个实施例中，包被所述重组乙型肝炎病毒x蛋白的固相载体为微孔板。\n[0012] 在本发明中，酶标记结合物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记结合物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。优选地，酶标记结合物为酶标记抗体，其将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。更优选地，酶标记结合物为辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。进一步优选地，酶标记结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检测抗体。\n[0013] 在本发明中，显色底物可以是易于配制、保存且产生的信号产物易于观察和检测并且对人无害且价廉、易得等特点的任何显色底物。优选地，显色底物为邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和对硝基苯磷酸酯(p-NPP)。更优选地，显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。\n[0014] 在本发明中，还提供了抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒在检测抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体中的应用。\n[0015] 在本发明中，又提供了抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒在制备用于肝癌诊断的试剂盒中的应用。\n[0016] 此外，本发明还进一步提供了一种制备抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒的方法，包括以下步骤：1)通过原核载体表达重组乙型肝炎病毒x蛋白；2)制备包被所述重组乙型肝炎病毒x蛋白的固相载体；3)以抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体阴、阳性血清制备对照品；4)以酶标记检测抗体；5)配制显色底物；6)配制浓缩洗涤液；7)分装所述抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体阴、阳性对照品、酶标记结合、显色底物及浓缩洗涤液；8)组装为成品。\n[0017] 其中，制备包被所述重组乙型肝炎病毒x蛋白的固相载体的步骤2)采用以下方法：\n1)包被：用0.02M PH值为8.5的磷酸缓冲液配制成所需浓度的所述重组乙型肝炎病毒x蛋白包被液，并将包被液负载于固相载体上；2)封闭：用含5％酪蛋白或5％脱脂奶粉PH值为6.8-\n7.3，浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液作为封闭液封闭所述固相载体。\n[0018] 在本发明中，优选地，包被重组乙型肝炎病毒x蛋白的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管；酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的检测抗体；显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。\n[0019] 本发明的抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒采用间接酶联免疫分析法，检测HBx抗体。样品中的抗体首先被包被于微孔板上的乙型肝炎病毒重组抗原捕获，在洗掉样品的其它部分，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人抗体，就可以形成标记物复合物，洗板加入显色液A、显色液B以及加入终止液后，用酶联免疫分析仪测量吸光值，吸光值与样本中抗体浓度呈正相关，与临界值相比较，从而判断阴阳性。\n[0020] 为了提高本发明的抗乙型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒的性能稳定性，本发明首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体(微孔板)的吸附性能和变异大小、酶的活性、显色底物的灵敏度及稳定性等，从而提高本发明的试剂盒的灵敏度和稳定性。并且还对包被方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被缓冲液和保护液，通过抗原不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。本发明对试剂盒的各个组件进行了优化，使得试剂盒在应用中每个步骤都发挥最优的效果，综合上提高试剂盒特异及高效的检测效果。\n[0021] 本发明的HBx抗体免疫分析测定试剂盒可以非常专一地检测出感染乙型肝炎病毒后人体中的HBx抗体，可以根据HBx抗体变化情况判断治疗效果及其病情的变化。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。且根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动分析仪，更能适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。\n[0022] 此外，本发明还证实了HBx抗体与AFP在肝癌中表达无相关性。因此，可以采用本发明的试剂盒和HCC肿瘤标记物AFP二者联合检测，并且通过本发明的实施例证实二者联合检测能够将敏感性提高到75.95％，漏诊率降至24.05％。因此，本发明在作为新型肝癌检测手段的同时，还可以通过肿瘤标志物的联合应用能提高肝癌的检出率，是解决AFP假阳性和假阴性问题的有效途径，是肝癌血清学诊断方法发展的必然趋势。\n[0023] 此外，本发明还提供了一种用于肝癌诊断的定量检测试剂盒，包括相互独立的抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体定量检测单元和甲胎蛋白定量检测单元。在本发明中，可以分别采用抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体定量检测单元和甲胎蛋白定量检测单元对样品进行检测，从而提高肝癌的检出率，解决AFP假阳性和假阴性问题。\n[0024] 在本发明的一个实施例中，抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体定量检测单元可以至少包括包被抗乙型肝炎病毒x蛋白的固相载体和抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体阴、阳性对照品；甲胎蛋白定量检测单元可以至少包括包被甲胎蛋白抗体的固相载体和甲胎蛋白阴、阳性对照品。其中，抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体定量检测单元还可以包括酶标记结合物、显色底物和浓缩洗涤液。甲胎蛋白定量检测单元还可以包括酶标记结合物、显色底物和浓缩洗涤液。通过抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体定量检测单元定量检测抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体，判断肝癌阳性的情况，并通过甲胎蛋白定量检测单元定量检测甲胎蛋白，判断肝癌阳性的情况。由于HBx抗体与AFP在肝癌中表达无相关性，因此二者联合检测能够最终提高肝癌的检出率，解决AFP假阳性和假阴性问题。\n[0025] 其中，所述抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体定量检测单元可以是如权利要求1-4所述的抗乙型肝炎病毒x蛋白抗体酶联免疫测定试剂盒。\n[0026] 在本发明中，还提供了用于肝癌诊断的定量检测试剂盒在制备用于肝癌诊断的免疫测定试剂盒中的应用。\n[0027] 本发明证实了HBx抗体与AFP在肝癌中表达无相关性。因此，可以采用本发明的联合检测试剂盒对HBx抗体与AFP二者联合检测，并且能够提高肝癌诊断的敏感性，解决AFP假阳性和假阴性问题。本发明的联合检测试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。且根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动分析仪，更能适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。\n附图说明\n[0028] 图1示出纯化HBx的SDS-PAGE图。\n[0029] 图2示出HBx抗体浓度与吸光度线性关系。\n具体实施方式\n[0030] 以下通过实施例并结合附图来进一步详细说明本发明，但不用来限制本发明的范围。\n[0031] 实施例1HBx重组蛋白诱导表达和纯化\n[0032] HBx的诱导表达：将已转化了含有HBx蛋白的PET-30a-X重组质粒的菌体挑单菌落接种于15ml含卡那抗性的LB溶液中，37℃振荡培养过液。次日，取10ml菌液转种于1000ml卡那抗性的LB培养液中，37℃继续振荡培养约2-3小时。当OD600达到0.4-0.6之间时，加入\n200mg/ml的IPTG 583μl，继续培养4小时以上。\n[0033] 其 中 ，H B x 重 组 蛋 白 的 氨 基 酸 序 列( S E Q   I D   N o .1 )为 ：\nMAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAESRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARSMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFPSA。\n[0034] HBx融合蛋白的纯化：8000r/min，10分钟离心收集经过IPTG诱导表达的菌体于\n50ml离心管中，倒去上清，用30ml洗涤缓冲液(缓冲液A)洗涤沉淀。洗涤两次后，10000r/min离心约10分钟，冰上超声破碎菌体，再离心，收集上清。沉淀即为包涵体，用于下一步的处理。\n[0035] 取适量的包涵体制备过程中的上清和包涵体沉淀，用2×SDS-PAGE缓冲液进行SDS-PAGE电泳。用考马斯亮蓝染色，确定目的蛋白位置。\n[0036] 包涵体的溶解：取部分制备好的包涵体沉淀，称湿重。每克菌体加入5ml缓冲液B，于室温轻轻混合，降低粘稠度，直至液体变透明状为止。离心除去残余的细胞碎片，取上清。\n置于冰上或-20℃保存。\n[0037] 亲和层析纯化HBx融合蛋白：采用PET系统表达出带6个组氨酸标记的融合蛋白是以包涵体形式存在，所以需在变性条件下用Ni-NTA树脂从包涵体中纯化带His-Tag的融合蛋白。\n[0038] 1)取4ml制得的包涵体的溶液，加入1ml 50％的Ni-NTA树脂，室温轻轻混合约30分钟。将以上混合液轻轻转移至一个空的层析柱管中。\n[0039] 2)除去柱管的底帽，收集流出液体，留待SDS-PAGE检测。\n[0040] 3)用4ml缓冲液C清洗2次，收集每一次流出液体，留待SDS-PAGE检测。\n[0041] 4)用0.5ml缓冲液D清洗4次，取样留待SDS-PAGE检测。\n[0042] 5)最后，用0.5ml缓冲液E清洗4次，取样留待SDS-PAGE检测。\n[0043] SDS-PAGE电泳：用SDS-PAGE确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况，通过对凝胶的扫描，检测纯化出蛋白的纯度。\n[0044] 通过SDS-PAGE电泳判断(图1)，将HBx重组载体在宿主菌中进行了高效表达。经过镍柱亲和层析纯化并透析复性脱盐，得到高纯度的HBx，纯度可达95％以上。\n[0045] 实施例2制备本发明的HBx抗体免疫分析测定试剂盒\n[0046] 在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体(微孔板)的吸附性能和变异大小、酶的活性、显色底物的灵敏度及稳定性等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被缓冲液和保护液，通过抗原不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。\n[0047] 一、酶标抗体制备\n[0048] 捕获抗体用高碘酸钠法与辣根过氧化物酶偶联，用PBS充分透析，加等体积甘油，-\n20℃以下保存。\n[0049] 二、HBx抗体阴、阳性对照品的制备\n[0050] 混合6份以上经western blot检测HBx抗体阳性血清或阴性血清，经HIV、TP以及HCV抗体测定均为阴性血清，60℃灭活1小时，过滤除菌、适度稀释、分装，低温冻存。\n[0051] 三、固相包被板的制备\n[0052] (1)包被：将纯化的HBx用50mmol/L碳酸盐缓冲液稀释，稀释至12μg/ml，然后加入包被板条各孔内，37℃放置1～2小时后2～8℃过夜，甩干；\n[0053] (2)封闭：按150μl/孔用含5％酪蛋白或5％脱脂奶粉的PH7.4的磷酸盐缓冲液，37℃封闭1小时，甩干；\n[0054] (3)保护：按150μl/孔用含20％蔗糖的PH7.4的磷酸盐缓冲液室温保护3小时；\n[0055] (4)干燥：置干燥室干燥后，按48～96孔/包来装入含干燥剂的包装袋中，封口并冷藏备用。\n[0056] 四、酶标抗体浓度选定\n[0057] 酶标抗体稀释液：为硼砂1.43049、硼酸5.25649、小牛血清200ml、甘油20ml、Proclin300lml，双蒸水溶解，定溶1000ml。\n[0058] 采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度1:10000。\n[0059] 五、试剂配制\n[0060] (1)浓缩洗涤液：含1％Tween-20的PH7.4Tris-HCl缓冲液；\n[0061] (2)样品稀释液：以三蒸水配内含0.5％～2％BSA的PH7.4磷酸盐缓冲液；\n[0062] (3)酶标工作液：以三蒸水配PH7.2的磷酸盐缓冲液，内含0.5％～2％BSA；0.5％酶保护剂；0.05％Proclin-300及以0.1％Tween-20，以适当的浓度稀释冻存标记的酶；\n[0063] (4)显色剂A：以三蒸水配PH 5.0醋酸盐缓冲液，内含0.05％过氧化脲；\n[0064] (5)显色剂B：用甲醇配0.16％四甲基联苯胺，溶解后对倍加甘油；\n[0065] (6)终止液：以三蒸水配2mol/L硫酸溶液；\n[0066] (7)阳性对照：取筛出的阳性血清(OD≥0.500)加少量红色染料并按1000单位/ml加青霉素和链霉素，无菌过滤；\n[0067] (8)阴性对照：取筛出的阴性血清(OD≤0.100)，按1000单位/ml加青霉素和链霉素，无菌过滤。\n[0068] 六、半成品及成品组成\n[0069] 按每盒1包48～96孔/包的抗原预包被条、1瓶浓缩洗涤液、1瓶样品稀释液、1瓶酶结合物工作液、1瓶显色剂A、1瓶显色剂B、1瓶终止液、1瓶阳性对照、1瓶阴性对照和1份使用说明书组装。\n[0070] 上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成HBx抗体测定试剂盒。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。\n[0071] 实施例3本发明试剂盒的使用方法\n[0072] 以上实施例2制备的HBx抗体测定试剂盒的具体操作如下：\n[0073] (1)洗涤液：浓缩洗液以1:20稀释作为工作洗涤液备用；\n[0074] (2)将试剂及所需数量的微孔反应条置室温平衡；\n[0075] (3)吸取100μl乙型肝炎病毒HBx抗体阴阳性对照品及待检样本，按顺序加入微孔反应条小孔中并加贴封片；\n[0076] (4)37℃水浴孵育30分钟；\n[0077] (5)在第一次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液200μl，再吸干各孔，重复以上洗涤5次，最后一次将微孔反应条拍干；\n[0078] (6)每孔中加入100μl标记物工作液，并加贴封片；\n[0079] (7)37℃水浴孵育30分钟；\n[0080] (8)第二次孵育结束后，小心将微孔反应条上的封片揭下并弃掉，将微孔反应条放入洗板机吸干各孔并每孔注入洗涤液200μl，再吸干各孔，重复以上洗涤6次，最后一次将微孔反应条拍干；\n[0081] (9)每孔加显色液A一滴(约50μl)，加显色液B一滴(约50μl)。封板膜封板后37℃避光显色10分钟；\n[0082] (10)每孔加终止液一滴(约50μl)，终止反应。用空白孔调零，于450nm波长(建议使用双波长，参考波长为620nm)酶标仪上读取0D值；\n[0083] (11)与临界值比较后判断结果。\n[0084] 实施例4本发明试剂盒的方法学鉴定\n[0085] 按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例2中制备的试剂盒进行检定，见下表1:\n[0086] 表1 HBx抗体检测试剂盒性能分析\n[0087]\n[0088] 说明本发明中HBx抗体免疫分析测定试剂盒的灵敏度、特异性、精密性以及稳定性完全符合检定要求。\n[0089] 实施例5本发明试剂盒定量检测性能的测试\n[0090] HBx抗体检测标准曲线如图2所示，当HBx抗体浓度范围从0IU/ml至150IU/ml时，其测定浓度与吸光度成较好的线性关系，剂量-反应曲线相关系数(r)大于0.99。\n[0091] 实施例6HBx抗体检测在肝癌诊断中的应用\n[0092] 采用本发明人建立的HBx抗体间接ELISA检测试剂盒，分别对200例正常样本、150例乙肝样本、150例肝硬化样本以及158例肝癌样本进行分析，HBx抗体浓度大于10IU/ml的样本中，正常样本符合率达到97.50％，乙肝、肝硬化和肝癌样本的检出率分别达12.42％、\n20.35％、53.16％(表2)，肝癌样本中HBx抗体检测率显著高于乙肝和肝硬化，能够有效区分肝癌与其他肝病样本。因此，HBx抗体可作为肝癌的诊断指标。\n[0093] 表2 四种样本中HBx抗体的检测结果\n[0094]\n浓度(IU/ml) 正常 乙肝 肝硬化 肝癌\n<10 97.50％ 87.33％ 79.33％ 46.84％\n>10 2.50％ 12.67％ 20.67％ 53.16％＊\n[0095] 注：通过t检验分别将肝癌样本检测结果与乙肝和肝硬化样本检测结果进行差异分析，p值﹤0.05，表明肝癌样本与乙肝和肝硬化样本检测结果具有显著性差异。\n[0096] 实施例7HBx抗体与AFP的肝癌互补性诊断\n[0097] 采用本发明人建立的HBx抗体间接ELISA检测试剂盒，并且采用检测AFP指标的AFP检测酶免试剂盒(购自上海生物制品所)，对158份病理诊断明确的肝细胞肝癌同时进行了AFP与HBx抗体的检测。\n[0098] 结果，当AFP和HBx抗体的阳性判定值分别定为20ng/ml和10IU/ml时，本实验AFP的敏感性为48.10％(76/158)，漏诊率为51.90％，HBx抗体的敏感性为53.16％(84/158)，漏诊率为46.84％(表3)。AFP阴性肝癌患者血清有较高的HBx抗体检出率(53.66％)，两者比较，无显著性差异，表明HBx抗体与AFP在肝癌中表达无相关性。二者联合检测，可使敏感性提高到75.95％，漏诊率降至24.05％。肿瘤标志物的联合应用能提高肝癌的检出率，是解决AFP假阳性和假阴性问题的有效途径，是肝癌血清学诊断方法发展的必然趋势。\n[0099] 表3 AFP、HBx抗体检测结果\n[0100]\n  AFP“+” AFP“-” 合计\nHBx Ab“+” 40 44 84\nHBx Ab“-” 36 38 74\n合计 76 82 158\n[0101] 若采用HBx抗体作为肝癌血清标志物与AFP联合检测用于临床，可更进一步提高肝癌诊断的阳性率，尤其是AFP阴性患者的诊断率。HBx抗体、AFP可以起到较好的互补作用，特别是在当前国内肝癌有上升趋势，早期、快速、准确的筛查发现肝癌，这一方法具有重要价值。\n[0102] 所以为提高肝癌的诊断灵敏度、准确性和鉴别诊断价值，减少漏诊率，故应采用HBx抗体、AFP联合检测。\n[0103] 以上，基于本发明的实施方式进行了说明，但本发明不限定于此，本领域的技术人员应该明白，在本发明的主旨的范围内能够以进行变形和变更的方式实施，这样的变形和变更的方式，理应属于本发明的保护范围。