寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传递分子检测方法

1.一种寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传递分子检测方法， 包括下列步骤：
(1)在芯片基底表面覆盖上一层末端为反应活性官能团的有机 薄膜，通过共价键合，将一类序列已知的具有发卡形结构的第一单链 寡聚核苷酸固定在基底表面；
(2)将探针蛋白与另一类序列已知的第二单链寡聚核苷酸相连 做成复合探针分子，其中：该第二单链寡聚核苷酸和固定在芯片基底 上的第一单链寡聚核苷酸序列中存在一段完全互补的序列，而探针蛋 白能与待测目标蛋白特异性结合；
(3)将目标蛋白分子进行荧光标记；
(4)复合探针分子与荧光标记的待测目标蛋白在溶液中进行分 子识别，形成寡聚核苷酸-探针蛋白-目标蛋白复合物；
(5)将所述寡聚核苷酸-探针蛋白-目标蛋白复合物与步骤(1) 所得到的寡聚核苷酸固化的表面进行杂交反应；
(6)在杂交形成的寡聚核苷酸双链中嵌入特异发光的染料分子， 与目标蛋白上标记的荧光分子形成荧光共振能量传递的给体和受体；
(7)检测由于荧光共振能量传递产生的荧光信号。
2.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传 递分子检测方法，其特征在于：所述探针蛋白是可以与目标蛋白进行 特异性识别的蛋白大分子或多肽片段。
3.根据权利要求2所述的寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传 递分子检测方法，其特征在于：所述探针蛋白是抗体或受体。
4.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传 递分子检测方法，其特征在于：所述寡聚核苷酸是寡聚脱氧核糖核苷 酸、寡聚核糖核苷酸，或者是寡聚核苷酸的类似物，其中，所述的寡 聚核苷酸类似物包括多肽核苷酸。

技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种寡聚核苷酸嵌入染料荧 光共振能量传递分子检测方法。
背景技术
随着后基因组和蛋白质组工作的开展，研究人员们迫切需要一种 既高效又稳定的高通量蛋白分析技术。蛋白质芯片就是这样一种技 术，它在基因芯片的基础上继承发展而来。蛋白质是由氨基酸长链盘 绕折叠而成的一个三维的立体结构，通过这个立体结构蛋白质就可以 实现与其它分子识别等复杂的功能。
1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出蛋 白质组(Proteome)的概念(见文献Alan Dove，Nature Biotechnology， 17：233(1999))。最初的定义为：特定细胞在特定时间内所表达的所 有蛋白质。关于蛋白质组的研究则称为蛋白质组学。为了研究成千上 万的蛋白质的相互作用和运动规律，需要一种高通量、高灵敏度的分 析方法。基因芯片已经提供了一个高通量、高灵敏度分析基因序列的 成功范例。尤其是我们的两个专利申请(公开号分别为1373228和 1477210)，使高灵敏度低成本的基因芯片成为可能。蛋白质芯片可以 看成是基因芯片的延续和发展，成为生物芯片分析方法中一个非常重 要的组成部分。
蛋白质芯片的概念：
蛋白质芯片(Protein Chip)，又称为蛋白质微阵列(Protein Microarray)(参见文献MacBeath，G.and S.L.Schreiber，Science，2000. 289：1760(2000))。是20世纪90年代末提出的一个新概念，指将蛋白 质分子以微阵列的形式固化在基底表面，利用蛋白质分子的识别特性 来完成一定功能的集成装置。
蛋白质芯片要素：
基底：是蛋白质芯片的载体，它必须能够固定作为功能主体的蛋 白质，并尽可能地保持其生物活性。基底还应具有适合某种检测手段 的特性。现在普遍采用的基底有高分子(参见文献Zhang M.Q.et al. Biomaterials，19：953(1998))、金(参见文献Smith A.M.et al.Biosensors & Bioelectronics，15：183(2000))、玻璃(参见文献Boyle M.D.et al. Journal of Microbiological Methods，46：87(2001))、半导体材料(参 见文献Liao W et al.Sensors andActuators，101：361(2004))等。
蛋白质：是蛋白质芯片功能体现的主要承担者。也可以用蛋白质 的集合体(细胞，病毒，细菌，组织等)或类似物(短肽片段，适体， 锌指结构)来替代。
功能：显然，蛋白质芯片必须完成一定的功能，功能可以是合成， 筛选，分离，检测或者它们的综合。
蛋白质芯片特征：
蛋白质分子在基底上呈阵列排布，这样的排布有利于进行蛋白质 的多种类、高通量、平行检测。
固定在基底上和待测体系中的所需蛋白质的量都非常低，根据检 测手段的不同一般可达到μg-ng量级，以适应小剂量、高灵敏度检测 的要求。
蛋白质芯片技术难点：
蛋白质探针制备：如何获得大量高纯度的蛋白质探针分子，是蛋 白质芯片制备的生物学瓶颈。通常的方法有两种：一是生物技术方法， 经过质粒转染，表达，分离，提纯等步骤，耗时耗力，只能进行少数 蛋白的制备；二是利用化学多肽合成的方法，这种方法很难合成较大 的蛋白，只适合于合成较短的多肽片段。
蛋白质分子的高活性固定：蛋白质分子在固体表面，很容易由于 表面与蛋白相互作用而导致蛋白质分子变性和功能的损失。所以，如 何保持固定后蛋白质分子的活性是蛋白质芯片制备的化学瓶颈。通常 使用的固定方法有两类：一类是直接固定的方法，将蛋白质分子通过 物理吸附，化学键耦联等方法直接固定在固体基底表面，在这类方法 中，蛋白质分子与基底直接接触，容易变性而失活(参见文献Smith A.M.et al.Biosensors & Bioelectronics，15：183(2000))；第二类是间 接固定的方法，即在蛋白质分子与基底之间再加上一层生物连接分 子，以保持蛋白质分子的独立状态和活性，通常采用的方法是Protein G-IgG，生物素-抗生素，DNA-寡核苷酸等特异相互作用分子对，这 类方法需要额外的步骤，并且固定效率低(参见文献Baumann S.et al.Jornal of Immunological Methods，221：95(1998))。
高灵敏度检测方法：相对于传统的生物传感器，由于蛋白质芯片 上蛋白质的量更少，所以要求检测装置有更高的灵敏度。最通常使用 的是荧光标记激光扫描成像的方法。
我们已申请的基因芯片相关专利
1、发卡形探针基因芯片及其制备方法和检测方法
申请号：02116302.2
公开号：1373228
公开日期：2002-10-09
该发明涉及一种基因芯片，包括芯片基底和固化在其上的寡聚核 苷酸探针，探针包括探测区和茎杆区；茎杆区中的寡聚核苷酸序列和 与其匹配的寡聚核苷酸序列形成发卡形双链结构，其核苷酸的匹配方 式和碱基数目满足下列条件：发卡形寡聚核苷酸探针的解链温度，在 单点错配杂交状态的解链温度-5℃到完全匹配杂交状态的解链温度 +5℃的范围之间。本发明可通过对该基因芯片进行电位控制进一步优 化杂交条件。本发明基因芯片和样品都无须作任何标记，芯片可以重 复使用，制作和使用成本大大降低，且具有识别完全匹配和单点错配 的寡聚核苷酸序列的能力。可广泛应用于生物技术领域。
2、基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法
申请号：03142612
公开号：1477210
公开日期：2004-02-25
该发明涉及一种基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法，采用发 卡形探针基因芯片，首先用标靶配制标准溶液，将标准溶液与探针杂 交，并加入嵌入式荧光染料，对芯片基底施加电位和进行电位扫描， 记录扫描下的探针与标准溶液杂交的荧光信号标准曲线；然后将待测 样品DNA溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交，并加 入嵌入式荧光染料；同样对芯片基底施加电位和进行电位扫描，记录 扫描下的探针与待测样品杂交的荧光信号变化的曲线；将该曲线与标 准曲线进行比较，给出识别结果。本发明可确切和可靠地实现单核苷 酸多态性(SNP)的识别，探针和样品都无需进行特殊的标记，大大 降低了成本。可广泛应用于生物芯片技术领域。
蛋白质在固体表面容易由于疏水相互作用而导致其三维结构的 破坏，从而导致其生物功能的丧失。所以，蛋白在固体表面的失活， 是制约蛋白质芯片技术的一个重大瓶颈。我们从制备和检测思路上进 行创新，发明了先识别后固定的新型蛋白质芯片，即探针蛋白与目标 蛋白先在溶液中进行识别，然后通过耦联在探针蛋白上的寡聚核苷酸 与芯片基底表面的寡聚核苷酸杂交，将识别后的复合物固定在芯片上 的指定位置，这样就从根本上有效地解决了蛋白在表面失活的问题。
这样的蛋白芯片又引入了一个新的问题，即寡聚核苷酸杂交特异 性的问题。非特异性杂交将会给蛋白质芯片引入更大的误差。本发明 可以有效地解决这一问题。
发明内容
在本发明中，我们将荧光共振能量传递(FRET)的技术引入到 蛋白质芯片的制备和检测中。
FRET是指激发态能量从初始激发的给体(donor)向受体 (acceptor)的传递。(参见文献Joseph R.Lakowicz，Principles of Fluorescence Spectroscopy，Kluwer Academic/Plenum Publisher，1999) 一般来说，给体的发射光谱与受体的吸收光谱有重叠。当给体和受体 之间的距离在10纳米数量级时，FRET便会发生，给体所吸收的能量 将传递给受体，再由受体发射出光子，产生荧光。
通过设计，我们使特异嵌入寡聚核苷酸双链而发光的染料分子， 与目标分子上标记的荧光分子形成FRET的给体和受体。这样，只有 当寡聚核苷酸双链完全杂交和探针目标分子特异识别，这两个条件同 时满足的情况下，蛋白芯片才能产生FRET信号。通过引入FRET，大 大提高了蛋白芯片的特异性，是先识别后固定方法的延续和发展。
本发明的一个目的是，提供一种基于荧光共振能量传递的蛋白质 芯片，根据本发明的蛋白质芯片包括芯片基底和固化在其上的发卡形 寡聚核苷酸，复合探针分子包括蛋白质以及与其相连的寡聚核苷酸， 荧光标记的目标蛋白分子，和特异嵌入寡聚核苷酸双链而发光的染料 分子。引入荧光共振能量传递后，实现高特异性和高灵敏度蛋白检测。
本发明的另一个目的在于，提供一种能够固定和检测蛋白质的方 法。根据本发明的固定和检测蛋白质的方法，采用发卡形寡聚核苷酸 以及电位控制技术耦联蛋白质分子，实现溶液中识别后到表面寻址， 最大程度地避免蛋白质在表面的变性，并克服蛋白传感器和蛋白芯片 无法长期保存的困难。
根据本发明的固定和检测蛋白质的方法，具体包括以下步骤：
(1)固化寡聚核苷酸片段。
即芯片基底表面覆盖上一层末端为反应活性官能团的有机薄膜， 通过共价键合，将至少一类序列已知的寡聚核苷酸片段固定在基底表 面。
(2)探针蛋白与另一类序列已知的寡聚核苷酸耦联形成复合探 针分子。
探针蛋白与寡聚核苷酸耦联可以采取共价和非共价两种方式。
(3)复合探针与目标蛋白分子识别。
将步骤(2)中所得的探针蛋白-寡聚核苷酸复合物，与待测荧 光标记目标蛋白溶液混合。
(4)复合物固化在表面。
将步骤(3)中所得到的混合溶液，与步骤(1)中所得到的寡聚 核苷酸固化的表面进行杂交反应。
(5)荧光信号检测。
将捕捉了目标蛋白的芯片置于缓冲溶液中，并加入特异嵌入寡聚 核苷酸双链发光的荧光染料。嵌入染料与目标蛋白上标记的荧光分子 发生荧光共振能量传递，可以通过激光激发荧光检测来读数或成像。
(6)表面电位扫描
通过表面电位扫描，可以进一步提高检测的特异性和识别能力。
与传统的蛋白芯片检测相比，本发明的嵌入式染料与荧光标记分 子通过荧光共振能量传递来产生荧光信号，由于嵌入式染料是特异地 嵌入双链之中，加上FRET发生的物理条件，大大降低了非特异识别 和非特异杂交所带来的假阳性背景，从而提高了信噪比和检测的准确 度。
在传统的基于荧光的蛋白检测方法中，都是以荧光强度的绝对数 值来表征蛋白的数量，这样容易受偶然误差，环境因素的影响，并且 所有的反应在同一条件下进行并不能保证蛋白芯片中所有识别体系 都处于最佳识别条件。该发明可以采用传统的强度法，也可以在蛋白 检测过程中，引入电位扫描的因素，用荧光强度随电位的变化谱线代 替单一的绝对强度，来对特异与非特异反应进行区分。这样，可以得 到非常清晰的区别谱，极大地消除了反应条件和荧光强度的影响。
另外，传统的蛋白芯片检测采取先固定后识别的方法，本发明采 取先识别后固定的方法，从根本上尽可能地避免了蛋白表面变性的影 响，最大限度地保护了蛋白质的活性。在本发明的方法中，探针与目 标分子首先在溶液中进行特异识别反应(以前的方法中，这个过程是 在表面发生的，既有蛋白变性的成胁，也有空间位阻因素)，识别后 的复合物再通过寡聚核苷酸的特异识别作用而在基底表面寻址。与传 统方法不同的是，保存蛋白芯片时不需要保存固化有蛋白的表面，而 只要保存固化有寡聚核苷酸的基底及蛋白质溶液就可以了。
附图说明
下面结合附图对本发明进一步详细地说明：
图1是蛋白芯片结构示意图；
图2是蛋白芯片制备和反应步骤流程示意图；
图3是没有电位扫描下的荧光光谱对比结果；
图4是荧光强度随电位扫描的变化曲线。
最佳实施例详细描述
下面参照本发明的附图，更详细的描述出本发明的最佳实施例。
图1所示为根据本发明的蛋白芯片结构示意图，其中A为芯片检测 前的状态，B为芯片检测后的状态。该蛋白质芯片包括芯片基底1和固 化在其上的发卡形寡聚核苷酸2，复合探针分子3包括蛋白质以及与其 耦连的寡聚核苷酸4，荧光标记的待测目标蛋白分子5，和特异嵌入寡 聚核苷酸双链而发光的染料分子6。
芯片基底1表面覆盖上一层末端为反应活性官能团的有机薄膜， 通过共价键合，将发卡形寡聚核苷酸2固定在基底表面。
该蛋白质芯片各个部分具体描述如下：
1、芯片基底和固化在其上的发卡形寡聚核苷酸或类似物
芯片基底1为芯片的固体支撑平面，可以由多种材料构成，包括 金属、玻璃、高分子材料，以及我们现在所使用的硅。在这些材料表 面可以覆盖一层有助于寡聚核苷酸固化的膜，既可以采用共价连接的 方法，又可以采用物理吸附的方法进行固化。设计合成后的寡聚核酸 探针具有如下结构：存在一段或若干段与复合探针分子中的序列完全 互补的寡聚核酸序列，称为探测区；存在一段或若干段寡聚核酸序列 以及与该序列相匹配的寡聚核酸序列，称为茎杆区；茎杆区中的寡聚 核酸序列和与其匹配的寡聚核酸序列形成“发卡形”双链结构。寡聚 核苷酸可以是寡聚脱氧核糖核苷酸，可以是寡聚核糖核苷酸，也可以 是寡聚核苷酸的类似物，如多肽核苷酸(PNA)。
2、复合探针分子
复合探针分子3包括蛋白质以及与其相连的寡聚核苷酸4。其中， 蛋白质可以是抗体、受体，以及可以与蛋白进行识别的蛋白大分子或 多肽片段。与蛋白相连的寡聚核苷酸4为设计合成的存在一段能与固 化在基底表面的发卡形寡聚核苷酸的探测区互相匹配的片段。蛋白质 与寡聚核苷酸4的连接可以采取共价结合，即利用蛋白质表面的活性 基团与寡聚核苷酸4末端的活性基团形成共价键来进行连接；也可以 采用非共价的连接方式，即对蛋白和寡聚核苷酸都进行小分子标记， 然后通过特异识别的大分子将二者连接起来，利用的是大分子与小分 子之间的特异相互作用。
3、荧光标记的目标蛋白分子
荧光标记的待测目标蛋白分子5为所有能与探针蛋白分子3特异 相互作用的小分子和大分子。目标蛋白分子5存在于用户提供的待测 溶液中，即所需要探测的物质。荧光标记为经典的标记方法，不属于 本发明的蛋白芯片的制备过程。所标记的荧光分子须满足与嵌入双链 的染料分子6发生荧光共振能量传递的条件。
4、特异嵌入寡聚核苷酸双链而发光的染料分子
当耦联了寡聚核苷酸链的探针蛋白分子3与芯片基底1表面固定 的发卡形寡聚核苷酸2杂交时，这种染料分子6就会嵌入到双链中，激 光激发后即可发出荧光，而这种染料分子6在非嵌入状态下，受激光 激发只有非常弱的荧光。
5、电位控制装置和荧光检测系统
本发明中所使用电位控制装置与发明专利CN1477210中所使用 的装置相同，即对芯片基底施加电位和进行电位扫描，记录扫描下的 探针与待测样品杂交的荧光信号变化的曲线；将该曲线与标准曲线进 行比较，给出识别结果。但不限于此装置，所有能控制芯片基底1表 面电位变化的装置均可使用。在我们的实验中，我们使用Renishaw Raman 1000系统进行的荧光检测，其它荧光显微镜和生物芯片扫描仪 都可用于本蛋白芯片的荧光检测。
图2所示为蛋白芯片制备和反应步骤流程示意图，下面参照图2具 体说明，根据本发明的蛋白质芯片的制备和检测方法的具体步骤：
1、固化寡聚核苷酸片段
固化寡聚核苷酸片段的步骤为(图2中7)，芯片基底1表面覆盖上 一层末端为反应活性官能团的有机薄膜，通过共价键合，将至少一种 寡聚核苷酸片段固定在基底表面。基底可采用硅、玻璃、金属、高分 子材料等不同的材料，固化方法也可以选择与基底相对应的方法。我 们采用的是硅基底，基本固化过程如下。首先将覆盖有自然氧化硅层 的单晶硅片在皮卡试剂(70％浓硫酸：30％双氧水)中95度高温氧化， 然后通过NH4F的腐蚀，形成氢终止的硅表面，在紫外光引发下，具 有酯基官能团的不饱和烷烃链与Si-H表面反应，形成致密的酯基终止 的有机膜。酯基酸化成羧基后，与含有活化剂(NHS和EDC)的寡聚 核苷酸溶液反应，洗脱后，寡聚核苷酸便固定在硅基底1的表面。
2、探针蛋白与寡聚核苷酸耦联
探针蛋白分子3与寡聚核苷酸4耦联(图2中8)可以采取共价和非 共价两种方式。非共价方式是将蛋白与寡聚核苷酸都标记上生物素， 通过生物素与抗生素(亲核素)的特异识别作用，将蛋白与寡聚核苷 酸以非共价的方式连接起来。在专利申请中，我们采用的是共价连接 方式。在活化剂(NHS和EDC)的催化下，将纯化的探针蛋白分子3 与寡聚核苷酸4在溶液中进行反应。耦联后的溶液经过超滤和高速离 心，收集滤膜上的探针蛋白-寡聚核苷酸复合物。
3、探针与目标蛋白分子识别
如图2中9为探针与目标蛋白分子识别，将步骤2中所得的探针蛋 白-寡聚核苷酸复合物，与待测荧光标记目标蛋白分子5溶液混合。 其中，特异识别的探针蛋白和目标蛋白将形成寡聚核苷酸-探针蛋白 -目标蛋白复合物。
4、复合物固化在表面
将步骤3中所得到的混合溶液，与步骤1中所得到的寡聚核苷酸固 化的表面进行杂交反应。混合溶液中寡聚核苷酸-探针蛋白-目标蛋 白复合物的寡聚核苷酸与表面固化的寡聚核苷酸特异杂交，从而将寡 聚核苷酸-探针蛋白-目标蛋白复合物固化在芯片基底1表面上(如 图2中10)。
5、荧光信号检测
荧光信号检测11为，将捕捉了目标蛋白的芯片置于缓冲溶液中， 并加入特异嵌入寡聚核苷酸双链发光的荧光染料。由于嵌入染料与目 标蛋白上标记的荧光分子发生荧光共振能量传递，因而可以通过激光 激发检测荧光共振能量传递荧光来读数或成像。
荧光共振能量传递(FRET)是指激发态能量从初始激发的给体 (donor)向受体(acceptor)的传递，一般来说，给体的发射光谱与 受体的吸收光谱有重叠。当给体和受体之间的距离在10纳米数量级 时，FRET便会发生，给体所吸收的能量将传递给受体，再由受体发 射出光子，产生荧光。
6、表面电位扫描
可以通过表面电位扫描12，分析荧光强度随电位变化的曲线，来 准确区分特异识别与非特异识别反应，进一步提高检测的特异性和识 别能力。
图3所示为没有电位扫描下的荧光光谱对比结果，在五个对比实 验中，利用发明专利CN1373228中的方法在羧基终止的硅表面上共价 固定寡聚核苷酸序列oligo-1，在mouse IgG(mIgG，探针蛋白)上耦 联上寡聚核苷酸序列oligo-2，检测在MES缓冲溶液中进行，检测时缓 冲溶液中加入嵌入式染料分子PicoGreen。图中，曲线13为oligo-1与 oligo-2完全互补，溶液中加入荧光标记的goat anti-mouse IgG (AF-GAM，目标蛋白分子)与mIgG特异识别，即阳性对照的结果。 其余为各种阴性对照的结果。曲线15为oligo-1与oligo-2不匹配，而 AF-GAM与mIgG特异识别，即识别不杂交的阴性对照。曲线14为 oligo-1与oligo-2完全互补配对，而AF-GAM与rIgG不特异识别，即杂 交不识别的阴性对照。曲线17为溶液中不加入目标蛋白分子，oligo-1 与oligo-2完全互补配对，即无FRET只有嵌入式染料的阴性对照。曲 线16为基底未固定寡聚核苷酸，即目标蛋白分子非特异吸附的阴性对 照。从结果中可以明显看出，阳性结果明显高于其它阴性对照，但有 些阴性结果所带来的背景较大。
图4所示为荧光强度随电位扫描的变化曲线。在这组实验中，我 们对比三个体系在电位扫描下的变化曲线。分别在羧基终止的硅表面 上共价固定寡聚核苷酸序列oligo-1，在mouse IgG(mIgG，探针蛋白) 或rabbit IgG(rIgG，探针蛋白)上耦联上寡聚核苷酸序列oligo-2，检 测在MES缓冲溶液中进行，检测时缓冲溶液中加入嵌入式染料分子 PicoGreen，进行电位扫描检测荧光强度。图中，曲线18为阳性对照， 曲线19为杂交不识别的阴性对照，曲线20为识别不杂交的阴性对照。 我们用半高电位ΔE1/2来对扫描曲线进行表征，依次为-0.71V，-0.01V， 0.15V，与实施例1相比，区分程度大大提高，并且半高电位作为体系 内在属性的表现，受环境因素影响非常小，可作为区分阳性阴性的重 要参数。
本发明的蛋白质探针不需要先固定在表面上，而是可以高活性的 方法长期保存。表面固定的是寡聚核苷酸，寡聚核苷酸在基底表面比 蛋白质要稳定很多，所以芯片可以长期保存而不失效。
尽管为说明目的公开了本发明的最佳实施例和附图，但是本领域 的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范 围内，各种替换、变化和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于 最佳实施例和附图所公开的内容。