寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传递分子检测方法

1.一种寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传递分子检测方法， 包括下列步骤：
(1)在芯片基底表面覆盖上一层末端为反应活性官能团的有机 薄膜，通过共价键合，将一类序列已知的具有发卡形结构的第一单链 寡聚核苷酸固定在基底表面；
(2)将探针蛋白与另一类序列已知的第二单链寡聚核苷酸相连 做成复合探针分子，其中：该第二单链寡聚核苷酸和固定在芯片基底 上的第一单链寡聚核苷酸序列中存在一段完全互补的序列，而探针蛋 白能与待测目标蛋白特异性结合；
(3)将目标蛋白分子进行荧光标记；
(4)复合探针分子与荧光标记的待测目标蛋白在溶液中进行分 子识别，形成寡聚核苷酸-探针蛋白-目标蛋白复合物；
(5)将所述寡聚核苷酸-探针蛋白-目标蛋白复合物与步骤(1) 所得到的寡聚核苷酸固化的表面进行杂交反应；
(6)在杂交形成的寡聚核苷酸双链中嵌入特异发光的染料分子， 与目标蛋白上标记的荧光分子形成荧光共振能量传递的给体和受体；
(7)检测由于荧光共振能量传递产生的荧光信号。
2.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传 递分子检测方法，其特征在于：所述探针蛋白是可以与目标蛋白进行 特异性识别的蛋白大分子或多肽片段。
3.根据权利要求2所述的寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传 递分子检测方法，其特征在于：所述探针蛋白是抗体或受体。
4.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸嵌入染料荧光共振能量传 递分子检测方法，其特征在于：所述寡聚核苷酸是寡聚脱氧核糖核苷 酸、寡聚核糖核苷酸，或者是寡聚核苷酸的类似物，其中，所述的寡 聚核苷酸类似物包括多肽核苷酸。

技术领域\n本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种寡聚核苷酸嵌入染料荧 光共振能量传递分子检测方法。\n背景技术\n随着后基因组和蛋白质组工作的开展，研究人员们迫切需要一种 既高效又稳定的高通量蛋白分析技术。蛋白质芯片就是这样一种技 术，它在基因芯片的基础上继承发展而来。蛋白质是由氨基酸长链盘 绕折叠而成的一个三维的立体结构，通过这个立体结构蛋白质就可以 实现与其它分子识别等复杂的功能。\n1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出蛋 白质组(Proteome)的概念(见文献Alan Dove，Nature Biotechnology， 17：233(1999))。最初的定义为：特定细胞在特定时间内所表达的所 有蛋白质。关于蛋白质组的研究则称为蛋白质组学。为了研究成千上 万的蛋白质的相互作用和运动规律，需要一种高通量、高灵敏度的分 析方法。基因芯片已经提供了一个高通量、高灵敏度分析基因序列的 成功范例。尤其是我们的两个专利申请(公开号分别为1373228和 1477210)，使高灵敏度低成本的基因芯片成为可能。蛋白质芯片可以 看成是基因芯片的延续和发展，成为生物芯片分析方法中一个非常重 要的组成部分。\n蛋白质芯片的概念：\n蛋白质芯片(Protein Chip)，又称为蛋白质微阵列(Protein Microarray)(参见文献MacBeath，G.and S.L.Schreiber，Science，2000. 289：1760(2000))。是20世纪90年代末提出的一个新概念，指将蛋白 质分子以微阵列的形式固化在基底表面，利用蛋白质分子的识别特性 来完成一定功能的集成装置。\n蛋白质芯片要素：\n基底：是蛋白质芯片的载体，它必须能够固定作为功能主体的蛋 白质，并尽可能地保持其生物活性。基底还应具有适合某种检测手段 的特性。现在普遍采用的基底有高分子(参见文献Zhang M.Q.et al. Biomaterials，19：953(1998))、金(参见文献Smith A.M.et al.Biosensors & Bioelectronics，15：183(2000))、玻璃(参见文献Boyle M.D.et al. Journal of Microbiological Methods，46：87(2001))、半导体材料(参 见文献Liao W et al.Sensors andActuators，101：361(2004))等。\n蛋白质：是蛋白质芯片功能体现的主要承担者。也可以用蛋白质 的集合体(细胞，病毒，细菌，组织等)或类似物(短肽片段，适体， 锌指结构)来替代。\n功能：显然，蛋白质芯片必须完成一定的功能，功能可以是合成， 筛选，分离，检测或者它们的综合。\n蛋白质芯片特征：\n蛋白质分子在基底上呈阵列排布，这样的排布有利于进行蛋白质 的多种类、高通量、平行检测。\n固定在基底上和待测体系中的所需蛋白质的量都非常低，根据检 测手段的不同一般可达到μg-ng量级，以适应小剂量、高灵敏度检测 的要求。\n蛋白质芯片技术难点：\n蛋白质探针制备：如何获得大量高纯度的蛋白质探针分子，是蛋 白质芯片制备的生物学瓶颈。通常的方法有两种：一是生物技术方法， 经过质粒转染，表达，分离，提纯等步骤，耗时耗力，只能进行少数 蛋白的制备；二是利用化学多肽合成的方法，这种方法很难合成较大 的蛋白，只适合于合成较短的多肽片段。\n蛋白质分子的高活性固定：蛋白质分子在固体表面，很容易由于 表面与蛋白相互作用而导致蛋白质分子变性和功能的损失。所以，如 何保持固定后蛋白质分子的活性是蛋白质芯片制备的化学瓶颈。通常 使用的固定方法有两类：一类是直接固定的方法，将蛋白质分子通过 物理吸附，化学键耦联等方法直接固定在固体基底表面，在这类方法 中，蛋白质分子与基底直接接触，容易变性而失活(参见文献Smith A.M.et al.Biosensors & Bioelectronics，15：183(2000))；第二类是间 接固定的方法，即在蛋白质分子与基底之间再加上一层生物连接分 子，以保持蛋白质分子的独立状态和活性，通常采用的方法是Protein G-IgG，生物素-抗生素，DNA-寡核苷酸等特异相互作用分子对，这 类方法需要额外的步骤，并且固定效率低(参见文献Baumann S.et al.Jornal of Immunological Methods，221：95(1998))。\n高灵敏度检测方法：相对于传统的生物传感器，由于蛋白质芯片 上蛋白质的量更少，所以要求检测装置有更高的灵敏度。最通常使用 的是荧光标记激光扫描成像的方法。\n我们已申请的基因芯片相关专利\n1、发卡形探针基因芯片及其制备方法和检测方法\n申请号：02116302.2\n公开号：1373228\n公开日期：2002-10-09\n该发明涉及一种基因芯片，包括芯片基底和固化在其上的寡聚核 苷酸探针，探针包括探测区和茎杆区；茎杆区中的寡聚核苷酸序列和 与其匹配的寡聚核苷酸序列形成发卡形双链结构，其核苷酸的匹配方 式和碱基数目满足下列条件：发卡形寡聚核苷酸探针的解链温度，在 单点错配杂交状态的解链温度-5℃到完全匹配杂交状态的解链温度 +5℃的范围之间。本发明可通过对该基因芯片进行电位控制进一步优 化杂交条件。本发明基因芯片和样品都无须作任何标记，芯片可以重 复使用，制作和使用成本大大降低，且具有识别完全匹配和单点错配 的寡聚核苷酸序列的能力。可广泛应用于生物技术领域。\n2、基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法\n申请号：03142612\n公开号：1477210\n公开日期：2004-02-25\n该发明涉及一种基因芯片电位扫描无标记荧光检测方法，采用发 卡形探针基因芯片，首先用标靶配制标准溶液，将标准溶液与探针杂 交，并加入嵌入式荧光染料，对芯片基底施加电位和进行电位扫描， 记录扫描下的探针与标准溶液杂交的荧光信号标准曲线；然后将待测 样品DNA溶液装入荧光法测量芯片杂交的装置，与探针杂交，并加 入嵌入式荧光染料；同样对芯片基底施加电位和进行电位扫描，记录 扫描下的探针与待测样品杂交的荧光信号变化的曲线；将该曲线与标 准曲线进行比较，给出识别结果。本发明可确切和可靠地实现单核苷 酸多态性(SNP)的识别，探针和样品都无需进行特殊的标记，大大 降低了成本。可广泛应用于生物芯片技术领域。\n蛋白质在固体表面容易由于疏水相互作用而导致其三维结构的 破坏，从而导致其生物功能的丧失。所以，蛋白在固体表面的失活， 是制约蛋白质芯片技术的一个重大瓶颈。我们从制备和检测思路上进 行创新，发明了先识别后固定的新型蛋白质芯片，即探针蛋白与目标 蛋白先在溶液中进行识别，然后通过耦联在探针蛋白上的寡聚核苷酸 与芯片基底表面的寡聚核苷酸杂交，将识别后的复合物固定在芯片上 的指定位置，这样就从根本上有效地解决了蛋白在表面失活的问题。\n这样的蛋白芯片又引入了一个新的问题，即寡聚核苷酸杂交特异 性的问题。非特异性杂交将会给蛋白质芯片引入更大的误差。本发明 可以有效地解决这一问题。\n发明内容\n在本发明中，我们将荧光共振能量传递(FRET)的技术引入到 蛋白质芯片的制备和检测中。\nFRET是指激发态能量从初始激发的给体(donor)向受体 (acceptor)的传递。(参见文献Joseph R.Lakowicz，Principles of Fluorescence Spectroscopy，Kluwer Academic/Plenum Publisher，1999) 一般来说，给体的发射光谱与受体的吸收光谱有重叠。当给体和受体 之间的距离在10纳米数量级时，FRET便会发生，给体所吸收的能量 将传递给受体，再由受体发射出光子，产生荧光。\n通过设计，我们使特异嵌入寡聚核苷酸双链而发光的染料分子， 与目标分子上标记的荧光分子形成FRET的给体和受体。这样，只有 当寡聚核苷酸双链完全杂交和探针目标分子特异识别，这两个条件同 时满足的情况下，蛋白芯片才能产生FRET信号。通过引入FRET，大 大提高了蛋白芯片的特异性，是先识别后固定方法的延续和发展。\n本发明的一个目的是，提供一种基于荧光共振能量传递的蛋白质 芯片，根据本发明的蛋白质芯片包括芯片基底和固化在其上的发卡形 寡聚核苷酸，复合探针分子包括蛋白质以及与其相连的寡聚核苷酸， 荧光标记的目标蛋白分子，和特异嵌入寡聚核苷酸双链而发光的染料 分子。引入荧光共振能量传递后，实现高特异性和高灵敏度蛋白检测。\n本发明的另一个目的在于，提供一种能够固定和检测蛋白质的方 法。根据本发明的固定和检测蛋白质的方法，采用发卡形寡聚核苷酸 以及电位控制技术耦联蛋白质分子，实现溶液中识别后到表面寻址， 最大程度地避免蛋白质在表面的变性，并克服蛋白传感器和蛋白芯片 无法长期保存的困难。\n根据本发明的固定和检测蛋白质的方法，具体包括以下步骤：\n(1)固化寡聚核苷酸片段。\n即芯片基底表面覆盖上一层末端为反应活性官能团的有机薄膜， 通过共价键合，将至少一类序列已知的寡聚核苷酸片段固定在基底表 面。\n(2)探针蛋白与另一类序列已知的寡聚核苷酸耦联形成复合探 针分子。\n探针蛋白与寡聚核苷酸耦联可以采取共价和非共价两种方式。\n(3)复合探针与目标蛋白分子识别。\n将步骤(2)中所得的探针蛋白-寡聚核苷酸复合物，与待测荧 光标记目标蛋白溶液混合。\n(4)复合物固化在表面。\n将步骤(3)中所得到的混合溶液，与步骤(1)中所得到的寡聚 核苷酸固化的表面进行杂交反应。\n(5)荧光信号检测。\n将捕捉了目标蛋白的芯片置于缓冲溶液中，并加入特异嵌入寡聚 核苷酸双链发光的荧光染料。嵌入染料与目标蛋白上标记的荧光分子 发生荧光共振能量传递，可以通过激光激发荧光检测来读数或成像。\n(6)表面电位扫描\n通过表面电位扫描，可以进一步提高检测的特异性和识别能力。\n与传统的蛋白芯片检测相比，本发明的嵌入式染料与荧光标记分 子通过荧光共振能量传递来产生荧光信号，由于嵌入式染料是特异地 嵌入双链之中，加上FRET发生的物理条件，大大降低了非特异识别 和非特异杂交所带来的假阳性背景，从而提高了信噪比和检测的准确 度。\n在传统的基于荧光的蛋白检测方法中，都是以荧光强度的绝对数 值来表征蛋白的数量，这样容易受偶然误差，环境因素的影响，并且 所有的反应在同一条件下进行并不能保证蛋白芯片中所有识别体系 都处于最佳识别条件。该发明可以采用传统的强度法，也可以在蛋白 检测过程中，引入电位扫描的因素，用荧光强度随电位的变化谱线代 替单一的绝对强度，来对特异与非特异反应进行区分。这样，可以得 到非常清晰的区别谱，极大地消除了反应条件和荧光强度的影响。\n另外，传统的蛋白芯片检测采取先固定后识别的方法，本发明采 取先识别后固定的方法，从根本上尽可能地避免了蛋白表面变性的影 响，最大限度地保护了蛋白质的活性。在本发明的方法中，探针与目 标分子首先在溶液中进行特异识别反应(以前的方法中，这个过程是 在表面发生的，既有蛋白变性的成胁，也有空间位阻因素)，识别后 的复合物再通过寡聚核苷酸的特异识别作用而在基底表面寻址。与传 统方法不同的是，保存蛋白芯片时不需要保存固化有蛋白的表面，而 只要保存固化有寡聚核苷酸的基底及蛋白质溶液就可以了。\n附图说明\n下面结合附图对本发明进一步详细地说明：\n图1是蛋白芯片结构示意图；\n图2是蛋白芯片制备和反应步骤流程示意图；\n图3是没有电位扫描下的荧光光谱对比结果；\n图4是荧光强度随电位扫描的变化曲线。\n最佳实施例详细描述\n下面参照本发明的附图，更详细的描述出本发明的最佳实施例。\n图1所示为根据本发明的蛋白芯片结构示意图，其中A为芯片检测 前的状态，B为芯片检测后的状态。该蛋白质芯片包括芯片基底1和固 化在其上的发卡形寡聚核苷酸2，复合探针分子3包括蛋白质以及与其 耦连的寡聚核苷酸4，荧光标记的待测目标蛋白分子5，和特异嵌入寡 聚核苷酸双链而发光的染料分子6。\n芯片基底1表面覆盖上一层末端为反应活性官能团的有机薄膜， 通过共价键合，将发卡形寡聚核苷酸2固定在基底表面。\n该蛋白质芯片各个部分具体描述如下：\n1、芯片基底和固化在其上的发卡形寡聚核苷酸或类似物\n芯片基底1为芯片的固体支撑平面，可以由多种材料构成，包括 金属、玻璃、高分子材料，以及我们现在所使用的硅。在这些材料表 面可以覆盖一层有助于寡聚核苷酸固化的膜，既可以采用共价连接的 方法，又可以采用物理吸附的方法进行固化。设计合成后的寡聚核酸 探针具有如下结构：存在一段或若干段与复合探针分子中的序列完全 互补的寡聚核酸序列，称为探测区；存在一段或若干段寡聚核酸序列 以及与该序列相匹配的寡聚核酸序列，称为茎杆区；茎杆区中的寡聚 核酸序列和与其匹配的寡聚核酸序列形成“发卡形”双链结构。寡聚 核苷酸可以是寡聚脱氧核糖核苷酸，可以是寡聚核糖核苷酸，也可以 是寡聚核苷酸的类似物，如多肽核苷酸(PNA)。\n2、复合探针分子\n复合探针分子3包括蛋白质以及与其相连的寡聚核苷酸4。其中， 蛋白质可以是抗体、受体，以及可以与蛋白进行识别的蛋白大分子或 多肽片段。与蛋白相连的寡聚核苷酸4为设计合成的存在一段能与固 化在基底表面的发卡形寡聚核苷酸的探测区互相匹配的片段。蛋白质 与寡聚核苷酸4的连接可以采取共价结合，即利用蛋白质表面的活性 基团与寡聚核苷酸4末端的活性基团形成共价键来进行连接；也可以 采用非共价的连接方式，即对蛋白和寡聚核苷酸都进行小分子标记， 然后通过特异识别的大分子将二者连接起来，利用的是大分子与小分 子之间的特异相互作用。\n3、荧光标记的目标蛋白分子\n荧光标记的待测目标蛋白分子5为所有能与探针蛋白分子3特异 相互作用的小分子和大分子。目标蛋白分子5存在于用户提供的待测 溶液中，即所需要探测的物质。荧光标记为经典的标记方法，不属于 本发明的蛋白芯片的制备过程。所标记的荧光分子须满足与嵌入双链 的染料分子6发生荧光共振能量传递的条件。\n4、特异嵌入寡聚核苷酸双链而发光的染料分子\n当耦联了寡聚核苷酸链的探针蛋白分子3与芯片基底1表面固定 的发卡形寡聚核苷酸2杂交时，这种染料分子6就会嵌入到双链中，激 光激发后即可发出荧光，而这种染料分子6在非嵌入状态下，受激光 激发只有非常弱的荧光。\n5、电位控制装置和荧光检测系统\n本发明中所使用电位控制装置与发明专利CN1477210中所使用 的装置相同，即对芯片基底施加电位和进行电位扫描，记录扫描下的 探针与待测样品杂交的荧光信号变化的曲线；将该曲线与标准曲线进 行比较，给出识别结果。但不限于此装置，所有能控制芯片基底1表 面电位变化的装置均可使用。在我们的实验中，我们使用Renishaw Raman 1000系统进行的荧光检测，其它荧光显微镜和生物芯片扫描仪 都可用于本蛋白芯片的荧光检测。\n图2所示为蛋白芯片制备和反应步骤流程示意图，下面参照图2具 体说明，根据本发明的蛋白质芯片的制备和检测方法的具体步骤：\n1、固化寡聚核苷酸片段\n固化寡聚核苷酸片段的步骤为(图2中7)，芯片基底1表面覆盖上 一层末端为反应活性官能团的有机薄膜，通过共价键合，将至少一种 寡聚核苷酸片段固定在基底表面。基底可采用硅、玻璃、金属、高分 子材料等不同的材料，固化方法也可以选择与基底相对应的方法。我 们采用的是硅基底，基本固化过程如下。首先将覆盖有自然氧化硅层 的单晶硅片在皮卡试剂(70％浓硫酸：30％双氧水)中95度高温氧化， 然后通过NH4F的腐蚀，形成氢终止的硅表面，在紫外光引发下，具 有酯基官能团的不饱和烷烃链与Si-H表面反应，形成致密的酯基终止 的有机膜。酯基酸化成羧基后，与含有活化剂(NHS和EDC)的寡聚 核苷酸溶液反应，洗脱后，寡聚核苷酸便固定在硅基底1的表面。\n2、探针蛋白与寡聚核苷酸耦联\n探针蛋白分子3与寡聚核苷酸4耦联(图2中8)可以采取共价和非 共价两种方式。非共价方式是将蛋白与寡聚核苷酸都标记上生物素， 通过生物素与抗生素(亲核素)的特异识别作用，将蛋白与寡聚核苷 酸以非共价的方式连接起来。在专利申请中，我们采用的是共价连接 方式。在活化剂(NHS和EDC)的催化下，将纯化的探针蛋白分子3 与寡聚核苷酸4在溶液中进行反应。耦联后的溶液经过超滤和高速离 心，收集滤膜上的探针蛋白-寡聚核苷酸复合物。\n3、探针与目标蛋白分子识别\n如图2中9为探针与目标蛋白分子识别，将步骤2中所得的探针蛋 白-寡聚核苷酸复合物，与待测荧光标记目标蛋白分子5溶液混合。 其中，特异识别的探针蛋白和目标蛋白将形成寡聚核苷酸-探针蛋白 -目标蛋白复合物。\n4、复合物固化在表面\n将步骤3中所得到的混合溶液，与步骤1中所得到的寡聚核苷酸固 化的表面进行杂交反应。混合溶液中寡聚核苷酸-探针蛋白-目标蛋 白复合物的寡聚核苷酸与表面固化的寡聚核苷酸特异杂交，从而将寡 聚核苷酸-探针蛋白-目标蛋白复合物固化在芯片基底1表面上(如 图2中10)。\n5、荧光信号检测\n荧光信号检测11为，将捕捉了目标蛋白的芯片置于缓冲溶液中， 并加入特异嵌入寡聚核苷酸双链发光的荧光染料。由于嵌入染料与目 标蛋白上标记的荧光分子发生荧光共振能量传递，因而可以通过激光 激发检测荧光共振能量传递荧光来读数或成像。\n荧光共振能量传递(FRET)是指激发态能量从初始激发的给体 (donor)向受体(acceptor)的传递，一般来说，给体的发射光谱与 受体的吸收光谱有重叠。当给体和受体之间的距离在10纳米数量级 时，FRET便会发生，给体所吸收的能量将传递给受体，再由受体发 射出光子，产生荧光。\n6、表面电位扫描\n可以通过表面电位扫描12，分析荧光强度随电位变化的曲线，来 准确区分特异识别与非特异识别反应，进一步提高检测的特异性和识 别能力。\n图3所示为没有电位扫描下的荧光光谱对比结果，在五个对比实 验中，利用发明专利CN1373228中的方法在羧基终止的硅表面上共价 固定寡聚核苷酸序列oligo-1，在mouse IgG(mIgG，探针蛋白)上耦 联上寡聚核苷酸序列oligo-2，检测在MES缓冲溶液中进行，检测时缓 冲溶液中加入嵌入式染料分子PicoGreen。图中，曲线13为oligo-1与 oligo-2完全互补，溶液中加入荧光标记的goat anti-mouse IgG (AF-GAM，目标蛋白分子)与mIgG特异识别，即阳性对照的结果。 其余为各种阴性对照的结果。曲线15为oligo-1与oligo-2不匹配，而 AF-GAM与mIgG特异识别，即识别不杂交的阴性对照。曲线14为 oligo-1与oligo-2完全互补配对，而AF-GAM与rIgG不特异识别，即杂 交不识别的阴性对照。曲线17为溶液中不加入目标蛋白分子，oligo-1 与oligo-2完全互补配对，即无FRET只有嵌入式染料的阴性对照。曲 线16为基底未固定寡聚核苷酸，即目标蛋白分子非特异吸附的阴性对 照。从结果中可以明显看出，阳性结果明显高于其它阴性对照，但有 些阴性结果所带来的背景较大。\n图4所示为荧光强度随电位扫描的变化曲线。在这组实验中，我 们对比三个体系在电位扫描下的变化曲线。分别在羧基终止的硅表面 上共价固定寡聚核苷酸序列oligo-1，在mouse IgG(mIgG，探针蛋白) 或rabbit IgG(rIgG，探针蛋白)上耦联上寡聚核苷酸序列oligo-2，检 测在MES缓冲溶液中进行，检测时缓冲溶液中加入嵌入式染料分子 PicoGreen，进行电位扫描检测荧光强度。图中，曲线18为阳性对照， 曲线19为杂交不识别的阴性对照，曲线20为识别不杂交的阴性对照。 我们用半高电位ΔE1/2来对扫描曲线进行表征，依次为-0.71V，-0.01V， 0.15V，与实施例1相比，区分程度大大提高，并且半高电位作为体系 内在属性的表现，受环境因素影响非常小，可作为区分阳性阴性的重 要参数。\n本发明的蛋白质探针不需要先固定在表面上，而是可以高活性的 方法长期保存。表面固定的是寡聚核苷酸，寡聚核苷酸在基底表面比 蛋白质要稳定很多，所以芯片可以长期保存而不失效。\n尽管为说明目的公开了本发明的最佳实施例和附图，但是本领域 的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范 围内，各种替换、变化和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于 最佳实施例和附图所公开的内容。