藤黄酸在制备抗肿瘤转移药中的应用

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技术领域\n本发明涉及藤黄酸在制备抗肿瘤药中的应用，特别是涉及藤黄酸在制备抗肿瘤转移 药中的应用.\n背景技术\n世界上恶性肿瘤的发生率继续里上升趋势，2000年世界卫生组织统计全球的癌症 新发病例达到1千万例，有600万例癌症死亡，其中死亡原因大多为恶性肿瘤晚期转移 所致.癌症已经成为威胁人类生命健康的主要疾病之一，怎样克服肿瘤细胞的复发和转 移成为人类攻克癌症道路上最大的障碍.\n肿瘤侵袭是指恶性肿瘤离开原发生长部位，突破基底膜和细胞外基质构成的屏 障，侵犯毗邻的正常组织，被侵袭的组织发生变性和坏死.肿瘤转移指恶性肿瘤细胞脱 离其原发部位，通过各种渠道的转运到不连续的组织继续增殖生长，形成同样性质肿瘤 的过程.侵袭和转移互为依存，即一个伴随另一个出现.肿瘤发生侵袭和转移是一个复 杂多步骤的过程，一般可分为以下几步：肿瘤细胞从原发肿瘤病灶脱离、肿瘤细胞穿过 细胞外基质(ECM)浸润、迁移于血管内皮细胞、肿瘤细胞进入循环系统，随着血流到 达并停留于远处位点的血管壁、肿瘤细胞穿出血管，通过ECM，最后在特定的组织或器 官形成转移灶.\n近年来肿瘤化疗取得了很大的进展，肿瘤患者生存时间明显延长，但由于化疗药物 的毒副作用，使临床应用受到一定限制.目前细胞毒性药物依然是抗肿瘤的基础和主要 途径，但真正能够达到高效低毒目标的药物少之又少，其中能够抑制肿瘤转移的药物更 少.使用细胞毒性药物虽然能够杀死肿瘤细胞，但同时也往往对正常的细胞产生伤害， 因此使用剂量不宜过大，在化疗过程中也不断应用新技术提高药物在肿瘤局部高浓度分 布(如定向注射、制成靶向前体药物等)，以减轻全身毒副反应，但由于这些药物不能 有效抑制肿瘤细胞的转移，常常是肿瘤原发灶有所减轻，但身体其他部分又出现多处转 移灶，最终导致病情恶化.\n藤黄酸(6ambogicAcid，GA，C38H44O8)是中药藤黄中有效成分之一.藤黄系藤黄 科植物藤黄所分泌的干燥树脂.实验研究结果表明，藤黄酸的抗癌作用与一般的化疗抗 癌药有所区别，能选择性的杀死癌细胞，而对正常的造血系统和白细胞没有影响.这为 寻找新型抗癌药提供新颖的前景，同时有可能启示新的抗癌机理.\n发明内容\n本发明的目的是提供藤黄酸在制药领域中的新用途，即藤黄酸在制备抗肿瘤转移药 中的应用.\n本发明的目的是通过下列措施来实现的：\n藤黄酸在制备抗肿瘤转移药中的应用.\n更进一步，藤黄酸在制备抗肝癌、胃癌、乳腺癌、肠癌或肺癌转移的药物中的应用.\n有益效果：\n1、藤黄酸对人肝癌SMMC-7721及QGY-7701细胞株、人肺腺癌SPC-A1细胞株、 人乳腺癌MDA-MB-231、人胃癌MGC-803及SGC-7901细胞株的体外生长具有显著的抑 制作用.\n2、藤黄酸对肿瘤转移具有良好的抑制作用.\n3、藤黄酸对肿瘤细胞的抑制作用具有较好的选择性.\n4、藤黄酸对肿瘤细胞的抑制作用表现在：\n(1)对接种的人乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、肠癌及其它瘤株的裸小鼠转移模型又 显著的抗转移作用；(2)对转移相关基因有明显影响；(3)对转移相关蛋白有明显影响.\n附图说明\n图1为藤黄酸作用于人乳腺癌细胞MDA-MB-231 48h量效曲线.\n图2为空白对照组裸小鼠肺转移结节实体照片.\n图3为ADM(2mg/kg)对照组裸小鼠肺转移结节实体照片.\n图4为藤黄酸高剂量(8mg/kg)组裸小鼠肺转移结节实体照片.\n图5为藤黄酸低剂量(4mg/kg)组裸小鼠肺转移结节实体照片.\n图6为藤黄酸作用于MDA-MB-231细胞后对MMP-2基因表达的影响的RT-PCR结果 图，其中Actin为内参；1为NS；2为Taxol(0.30μM)；3为GA(3.00μM)；4为GA (1.50μM)；5为GA(0.75μM)；6为GA(0.30μM)。\n图7为藤黄酸作用于MDA-MB-231细胞后对MMP-2基因表达的影响的柱形图，是将 图6经灰度扫描后各组表达转化为数值，除去actin的内参值后得到相对值.\n图8为藤黄酸作用于MDA-MB-231细胞后对TIMP-1基因表达的影响的RT-PCR结果 图，其中Actin为内参；1为NS；2为Taxol(0.30μM)；3为GA(3.00μM)；4为GA (1.50μM)；5为GA(0.75μM)；6为GA(0.30μM).\n图9为藤黄酸作用于MDA-MB-231细胞后对TIMP-1基因表达的影响的柱形图，是 将图8经灰度扫描后各组表达转化为数值，除去actin的内参值后得到相对值.\n图10为藤黄酸作用于MDA-MB-231细胞后对TIMP-2基因表达的影响的RT-PCR结 果图，其中Actin为内参；1为NS；2为Taxol(0.30μM)；3为GA(3.00μM)；4为 GA(1.50μM)；5为GA(0.75μM).\n图11为藤黄酸作用于MDA-MB-231细胞后对TIMP-2基因表达的影响的柱形图，是 将图10经灰度扫描后各组表达转化为数值，除去actin的内参值后得到相对值.\n图12为藤黄酸对MDA-MB-435裸小鼠肺转移模型瘤组织TIMP-1影响的RT-PCR图， 其中GAPDH为内参；NS为未给药空白对照组；ADM为阿霉素(2mg/kg)阳性对照组；GA8 为藤黄酸(8mg/kg)组；GA4为藤黄酸(4mg/kg)组.\n图13为藤黄酸对MDA-MB-435裸小鼠肺转移模型瘤组织TIMP-1影响的柱形图，是 将图12经灰度扫描后各组表达转化为数值，除去GAPDH的内参值后得到相对值。\n图14为藤黄酸对MDA-MB-435裸小鼠肺转移模型瘤组织TIMP-2影响的RT-PCR图， 其中GAPDH为内参；NS：为未给药空白对照组；ADM为阿霉素(2mg/kg)阳性对照组；GA8 为藤黄酸(8mg/kg)组；GA4为藤黄酸(4mg/kg)组.\n图15为藤黄酸对MDA-MB-435裸小鼠肺转移模型瘤组织TIMP-2影响的柱形图，是 将图14经灰度扫描后各组表达转化为数值，除去GAPDH的内参值后得到相对值.\n图16为藤黄酸作用于MDA-MB-231细胞后对MMP-2和MMP-9蛋白及其活性影响的电 泳图，图中NS为未给药对照组；1为藤黄酸给药(8μM)组；2为藤黄酸给药(0.4μM) 组；3为藤黄酸给药(0.08μM)组.\n图17为藤黄酸作用于MDA-MB-231细胞后对MMP-2和MMP-9蛋白及其活性影响的柱 形图，是将图16经灰度扫描后各组表达转化为数值得到的相对值.\n具体实施方式\n以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不对本发明作任何限制.\n本发明实施例所用的藤黄酸的制备可参见专利CN1557816A公开的内容，也可以采 用市售的藤黄酸标准品.\n实施例1  藤黄酸对乳腺癌细胞株体外生长抑制作用\n体外培养乳腺癌细胞株MDA-MB-231，加入藤黄酸，测定藤黄酸作用48h后乳腺癌细 胞的情况，结果表明，IC50为3.16μ M，并呈现良好量效曲线(见图1).\n实施例2  藤黄酸对裸小鼠肺转移模型药效作用\n取对数生长的体外培养的乳腺癌细胞MDA-MB-435，细胞浓度调整为1×107/ml.无 菌条件下，接种子裸小鼠左侧第二乳头的脂肪垫，接种量为0.1ml/只(细胞数为1.0× 106/只).2周后将动物随机分组.藤黄酸高剂量(8mg/kg)组、藤黄酸低剂量(4mg/kg) 组、ADM(阿霉素)对照组每周静脉注射给药一次，共10次；空白对照组给等量生理盐 水.停药后11天处死动物，称体重、肺重和瘤重，裸小鼠实际体重为所称体重减去瘤 重.将肺组织于Bouin氏液(饱和苦味酸∶甲醛∶冰醋酸＝75∶25∶5)中固定24小时， 再用无水酒精浸泡至肺组织颜色恢复，转移灶为白色结节.在解剖显微镜下记数肺转移 结节数量.将部分肺组织和瘤组织于福尔马林中固定，常规脱水包埋，H.E染色进行病 理检查.结果采用方差不齐性Aspin-Welch检验.\n结果显示，相对于空白对照组，藤黄酸给药组的肺重系数有极显著差异，说明给药 后肺部状态得到显著改善，转移结节数减少(见表1).肉眼观察，空白对照组结节数多 而凸起，且已逐步向肺中央转移，肺呈实质状(见图2)；ADM对照组肺转移结节数多， 大多集中于边缘，凸起较对照组少，转移灶大多隐含于肺中(见图3)；藤黄酸高剂量 (8mg/kg)组肺转移灶仅数个，集中于边缘，肺组织完好(见图4)；藤黄酸低剂量(4 mg/kg)组肺转移灶较高剂量组多数个，集中于边缘，肺组织完好(见图5).\n表1.裸小鼠给药后各项指标(体重、瘤重、肺重、转移率和转移结节数)统计.\n\n与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01\n实施例3  藤黄酸对金属蛋白水解酶MMP2及金属蛋白水解酶抑制剂TIMP1、TIMP2 基因水平影响。\n1.RT-PCR\n采用RT-PCR方法检测藤黄酸作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞后MMP-2、TIMP-1和 TIMP-2基因表达的改变.引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.\n(1)藤黄酸对乳腺癌细胞MDA-MB-231 MMP-2、TIMP-1和TIMP-2的影响：\n结果表明，藤黄酸作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞后3.00μM和1.5μM剂量组结 果明显，显著降低了MMP-2表达，对MMP-2的抑制作用具有量效关系(实验重复三次， 均值±SD)，结果见图6、7；亦可促进TIMP-1和TIMP-2基因表达，但不具量效关系， 对TIMP-1影响的结果见图8、9，对TIMP-2影响的结果见图10、11.图8、9表明，藤 黄酸作用于MDA-MB-231细胞后促进TIMP-1基因表达.实验重复三次，均值±SD；图 10、11表明，藤黄酸作用于MDA-MB-231细胞后除1.50μ M剂量组外，兼促进TIMP-2 基因表达.实验重复三次，均值±SD.\n(2)藤黄酸对接种有乳腺癌细胞MDA-MB-435裸小鼠瘤组织TIMP-1和TIMP-2的影 响：\n藤黄酸作用于MDA-MB-435裸小鼠肺转移模型后，提取瘤组织总RNA，RT-PCR实 验.结果表明，给予藤黄酸后促进TIMP-1(见图12，13)和TIMP-2表达(见图14，15).\n2.明胶酶谱分析.\n藤黄酸(8μM、0.4μM、0.08μM)作用于MDA-MB-231细胞48h后，换为无血清培养 基培养4小时，收集上清，各组活细胞用MTT方法定量以确定各组上清上样量一致.制备 含0.1％明胶的10％聚丙烯酰胺凝较，上样，100V电泳.胶在2.5％Trixon-100溶液中于 室温摇床轻摇以去除SDS，置反应液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150 mM NaCl，10mM CaCl2，and 0.5mMZnCl2)中，37℃孵育过夜，后用0.1％考马斯亮蓝(用30％甲醇和 10％乙酸配制)染色1h，于脱色液(30％甲醇，10％乙酸)中脱色至条带清晰为止(见 图16、17).\n结果显示，相对未给药对照组(NS)，给药后pro-MMP-2和pro-MMP-9被抑制.\n实施例4\n取藤黄酸10g按注射剂常规工艺添加适当辅料制成注射剂。\n实施例5\n取藤黄酸10g按片剂常规工艺添加适当辅料制成片剂.