一种快速定量检测菊酯类农药的试纸

1.一种快速定量检测拟除虫菊酯类农药的试纸，其特征在于：通过用镧族元素铕Eu标记抗体后，均匀喷在样品组合垫上，在硝酸纤维膜的质控线位置划上二抗，在硝酸纤维膜的检测线位置划上包被抗原，组装成快速检测试纸；所述试纸由载体垫、硝酸纤维素膜、样品组合垫、 胶带层以及吸水垫拼接成层状结构； 载体垫位于底部，载体垫的上方设有硝酸纤维素膜， 样品组合垫和吸水垫分别设置于硝酸纤维素膜的两端，并与硝酸纤维素膜部分重叠 ；样品组合垫上方覆盖有胶带层，并与样品组合垫部分重叠；硝酸纤维膜上靠近样品组合垫一端设有检测线，靠近吸水垫一端设有质控线；所述包被抗原为拟除虫菊酯包被抗原；
3+
所述的Eu标记抗体为Eu -拟除虫菊酯 抗体，其制备方法为：按照标记1 mg 偶联物需 
0.4 mg EDTA-Eu3+标记试剂，即质量比为 2.5:1，将待标记抗体和标记试剂充分混勾，置于室温过夜。
2.根据权利要求1所述的快速定量检测拟除虫菊酯类农药的试纸，其特征在于：包被抗原和二抗的划膜浓度均为 0.5 mg/mL，且检测线和质控线的间距为 0.4 cm。

一种快速定量检测菊酯类农药的试纸\n技术领域\n[0001] 本发明具体涉及一种快速定量检测菊酯类农药的试纸。\n背景技术\n[0002] “民以食为天，食以安为先”。食品是人类赖以生存与发展的物质基础，食品安全问题关系到人民群众的健康与安全，是国计民生的重大问题。但是，随着我国经济和社会的持续高速发展，在基本解决食物量的安全（food security）问题的同时，食物质的安全（food safety）问题越来越引起全社会的关注，有关食品安全的负面消息也层出不穷。我国正面临着严峻的食品安全挑战，主要表现在食源性疾病持续上升，恶性食品污染事件频出不穷，食品生产或加工新技术、新工艺带来新的危害，世界范围内由于食品安全卫生质量问题而引起的食品贸易纠纷不断，影响着我国与各国间经济贸易发展及我国声誉。\n[0003] 我国农副业生产虽然有了较大发展，但单产低，品质差，农副产品农药残留超标，某些已禁止在生产上使用的农药仍被使用，造成“3R”问题（即农药残留Residue，害虫抗药性Reistance，害虫再增猖獗Resurgence）越来越突出。农药残留（简称农残）问题是农副业生产过程中最主要的安全问题。在农作物的种植过程中，人们越来越依赖琳琅满目的化学杀虫剂、化学除草剂、抗生素和高效化学肥料等。长期食用农残超标的产品，即使没有导致急性中毒，也会引起人和动物的慢性中毒，从而导致疾病的发生，甚至影响到子孙后代。\n[0004] 拟除虫菊酯类农药是合成农药杀虫剂发展史上继有机氯、有机磷、氨基甲酸酯农药后于20世纪70年代由国外公司开发的一类模拟天然除虫菊花有效成份的基础上进行人工合成的仿生农药，它的开发认为是农药发展史上的第三个里程碑。由于其具有杀虫活性高、用量少、残留量低、对哺乳类动物毒性小的特点，是国家提倡推广的农药产品。作为有机磷农药的替代产品，使用量逐年增加，被广泛应用于农业、林业、卫生业等领域。其主要用于防治棉花、蔬菜、果树、茶树、烟草、大豆等农作物上的害虫害螨，能有效地防治鞘翅目、半翅目、同翅目和鳞翅目害虫及害螨，如棉铃虫、棉铃象甲、苜蓿叶象甲、尺蠖、小绿叶蝉、苹果蠢蛾、小菜蛾、菜青虫、莱粉蝶、美洲粘虫、马铃薯甲虫、地老虎、玉米螟、粉虱、蚜虫、叶螨类、瘿螨类等140多种害虫害螨。同时，还可用于防治蚊蝇等家庭卫生害虫和鱼用杀虫药物在水产养殖中应用。但由于菊酯类农药的长期大量使用，也会使多种害虫害螨产生抗药性，并且会对鱼类、蜜蜂和天敌产生较高毒性。菊酯类农药在鱼体内的残留会通过食物链威胁到人体健康。专家发现，氰戊菊酯可能具有环境雌激素活性，30 μmol/L氰戊菊酯能使人子宫内膜癌Ishikawa Var-I和乳腺癌T47D细胞系异常增殖，能使人乳腺癌MCF-7细胞系异常增殖。菊酯类农药长时间被人体皮肤吸收或口服可引起中毒，可通过影响神经轴突的传导而导致肌肉痉挛等。\n[0005] 世界各国对农药残留问题非常重视，对各种农副产品中的农残都制定苛刻的限量标准，使得我国农副产品出口面临严峻的挑战。对于农药残留的快速检测方法，成为世界各国重点研究对象。目前对菊酯类农药的定量检测主要是通过气相色谱或气质联用色谱，由专业技术人员在实验室内完成的。这种检测方法需要时间长，成本昂贵，无法满足实际工作的需要。为简单、方便的检测出农产品的菊酯类农药的存在，专利CN102507931A提供了一种菊酯类农药胶体金检测试纸，其是由载体板、硝酸纤维膜、胶体金垫、加样垫和吸收垫组成，载体板位于底层，硝酸纤维膜、胶体金垫、加样垫、吸收垫依次粘贴在载体板上表面，硝酸纤维膜位于载体板中部，胶体金垫设在硝酸纤维膜的一侧并与硝酸纤维膜部分重叠，加样垫设在胶体金垫上并与胶体金垫部分重叠，吸收垫设在硝酸纤维膜的另一侧并与硝酸纤维膜部分重叠，胶体金垫上均匀的涂布一层有胶体金标记的鼠抗河豚毒素单克隆抗体，硝酸纤维膜上靠近加样垫一端设有包被有检测抗原的检测线，靠近吸收垫一端设有包被有质控抗体的质控线。这种试纸虽然使用方便，但是它同时存在下列问题：\n[0006] 1、产品的检测限较高，无法满足农产品中对菊酯农药的限量要求；\n[0007] 2、胶体金检测试纸的定量效果较差，无法对农产品中的菊酯进行定量检测。\n[0008] 目前菊酯类农药残留量主要是通过气相色谱与气质联用色谱进行检测，这些方法对样品前处理繁琐复杂，对操作技术要求高，且仪器设备昂贵，需要有专业的技术人员进行操作，存在检测时间长，检测成本昂贵等缺点。目前虽然有开发胶体金免疫层析法可以应用于菊酯类农药残留量的快速检测，但是胶体金免疫层析法对菊酯类农药最低检测限较高，并且无法进行准确的定量，无法满足农产品中限量值的要求。\n[0009] 本产品通过改进抗体的标记方法，利用镧族元素铕（Eu）的螯合物标记菊酯类抗体，稀土金属Eu的荧光寿命较长，在关闭激发光后检测的荧光强度的分析方法，根据反应产品的的相对荧光强度，快速的检测出反应底物中的菊酯浓度。\n发明内容\n[0010] 本发明的目的是提供一种可以快速定量，并且最低检测限较低的检测菊酯类农药的试纸。\n[0011] 本发明采取的技术方案如下：\n[0012] 通过用镧族元素Eu标记抗体后，均匀喷在样品组合垫上，在硝酸纤维膜的质控线位置划上二抗，在硝酸纤维膜的检测线位置划上包被抗原，组装成快速检测试纸。\n[0013] 所述试纸由载体垫、硝酸纤维素膜、样品组合垫、胶带层以及吸水垫拼接成层状结构；载体垫位于底部，载体垫的上方设有硝酸纤维素膜，样品组合垫和吸水垫分别设置于硝酸纤维素膜的两端，并与硝酸纤维素膜部分重叠；样品组合垫上方覆盖有胶带层，并与样品组合垫部分重叠；硝酸纤维膜上靠近样品组合垫一端设有检测线，靠近吸水垫一端设有质控线。\n[0014] 所述二抗为羊抗鼠二抗。\n[0015] 拟除虫菊酯标记抗体的制备：按照标记1 mg偶联物需0.4 mg EDTA-Eu3+标记试剂，将待标记抗体和标记试剂充分混勾，置于室温过夜。\n[0016] 包被抗原和羊抗鼠二抗的划膜浓度均为0.5 mg/mL，且检测线3和质控线5的间距为0.4 cm。\n[0017] 本发明的显示结果可以结合荧光检测仪器直接读取，并快速给出定量结果。\n[0018] 本发明试纸的作用原理：通过镧族元素（Eu）标记菊酯类抗体，在吸水纸的作用下，通过毛细管作用，标记的抗体沿着硝酸纤维膜层析，与硝酸纤维膜上的菊酯包被抗原（检测线）及二抗（质控线）结合，根据检测线与质控线的时间差荧光强度比值，快速定量分析样品中的菊酯浓度。\n[0019] 本产品通过改进抗体的标记方法，利用镧族元素铕（Eu）的螯合物标记菊酯类抗体，稀土金属Eu的荧光寿命较长，在关闭激发光后检测的荧光强度的分析方法，根据反应产品的荧光强度与相对荧光强度的比值，快速的检测出反应底物中的菊酯浓度。产品的检测限可以比CN102507931A中胶体金检测试纸检测限提高近20倍，达1 ng/ml，通过特定的时间分辨荧光分析仪器，可以对底物中1 ng/ml - 100 ng/ml的菊酯进行快速定量检测。\n[0020] 本发明的试纸产品携带方便，可常温下流通，保存时间长，成本低廉，可以结合相关便携仪器，实现对菊酯类农药的快速定量分析，产品可以应用于农产品检测机构及一些基层监测单位，实现对农产品的用菊酯类药物的安全有效监查。\n附图说明\n[0021] 图1为检测试纸结构示意图；其中样品组合垫-1、胶带层-2、检测线-3、硝酸纤维素膜-4、质控线-5、吸水垫-6、载体垫-7。\n具体实施方式\n[0022] 本发明通过用镧族元素Eu标记抗体后，均匀喷在样品组合垫上，在硝酸纤维膜的质控线位置划上二抗，在硝酸纤维膜的检测线位置划上包被抗原，组装成快速检测试纸。\n[0023] 具体制备如下：\n[0024] （1）拟除虫菊酯半抗原的制备：取1.20 g（3.2 mmol）苯醚氰菊酯于100 mL的具塞三角瓶中，再加入7.0 mL 的叔丁醇和17.0 mL的水，混匀。然后称取3.48 mg (0.22 mmol)的NaIO4，42.57 mg (3.6 mmol) KMnO4和66.68 mg （85 mmol） Na2CO3分别加入上述的三角瓶中。最后加入相转移催化剂甲基三辛基氯化铵，常温下反应过夜。反应结束后，用6 mol/L盐酸进行酸化，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，然后用硫代硫酸钠溶液洗涤有机相，接着用无水硫酸镁干燥，浓缩，柱层析法纯化，以石油醚和乙酸乙酯的梯度变化为洗脱剂（从\n10:1增大到6:4左右）。以石油醚：乙酸乙酯：醋酸 = 69.9:30:0.1为展开剂，收集Rf = 0.36的组分，浓缩，得到淡黄色的油状物为II类拟除虫菊酯的半抗原。\n[0025] （2）拟除虫菊酯的人工抗原制备：半抗原采用活性酯法和KLH偶连，具体过程：称取\n50.0 mg (0.027 mmol)的半抗原，7.8 mg (0.04 mmol) 1-乙基-碳二亚胺盐酸盐（EDC），\n0.66 mg (0.0054 mmol)二甲基吡啶(DMAP) 和4.1 mg (0.04 mmol) 三乙胺放入反应瓶A中，加入300 mL N, N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解后，得到A液；然后在反应瓶B中加入9.32 mg（0.081 mmol）N-羟基琥珀酸亚胺（NHS）和100 mL N, N-二甲基甲酰胺（DMF），溶解后得到B液。将 B 液逐滴滴加到 A液中，室温下反应12 h，得到 C 液。量取KLH 45 mg (5.0 mg/mL，\n9.0 mL)并用pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释，与C液进行偶联制备免疫抗原。以BSA代替KLH制备包被抗原。\n[0026] （3）拟除虫菊酯单克隆抗体的制备：用拟除虫菊酯免疫抗原免疫小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合培养，筛选阳性杂交瘤细胞体外培养，克隆扩大培养后冻存，选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷进行小鼠腹腔注射，6 d后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，接着在5 d后收集腹水。\n[0027] （4）拟除虫菊酯单克隆抗体的纯化：参考饱和硫酸铵法，具体步骤如下：抽取小鼠腹水经4℃或室温离心13000 r/min，30 min，收集上清；取上清约20 ml与等体积生理盐水混合后，于搅拌下缓慢滴加40 ml饱和硫酸铵法（SAS），于沉淀30 min以上或过夜，使蛋白充分沉淀；13 000 r/min，10 min 4℃离心，弃上清；用12 ml生理盐水溶解沉淀，滴加8 ml SAS，4℃静置1 h，4℃离心，弃上清液，用13.3 ml生理盐水溶解沉淀。滴加6.6 ml SAS，4℃静置1 h，4℃离心，弃上清液，离心后所得沉淀物用少许盐水溶解沉淀，并装入透析袋；用大于20倍体积的PBS于4℃透析，更换透析液数次，可置-20℃保存或进一步纯化。\n[0028] （5）Eu3+-拟除虫菊酯抗体的制备：按照标记1 mg偶联物需0.4 mg EDTA-Eu3+标记试剂（福州泰普生物科学有限公司），即质量比为2.5:1(摩尔比约为1:50)，将待标记抗体和标记试剂充分混勾，置于室温过夜。\n[0029] （6）硝酸纤维素膜的加工：用划膜仪将拟除虫菊酯包被抗原与羊抗鼠二抗均匀地划在硝酸纤维素膜4中间，在室温25℃，相对湿度小于40%的气氛下进行干燥。拟除虫菊酯包被抗原形成检测线（T线）3，羊抗鼠二抗形成质控线（C线）5，其中包被抗原和羊抗鼠二抗的划膜浓度均为0.5 mg/mL，且检测线3和质控线5的间距为0.4 cm。\n[0030] （7）试纸条的组装：将载体垫7、硝酸纤维素膜4、样品组合垫1、胶带层2以及吸水垫\n6拼接成层状结构，如图1所示。载体垫7位于底部，载体垫7的上方设有硝酸纤维素膜4，样品组合垫1和吸水垫6分别设置于硝酸纤维素膜4的两端，且样品组合垫1和吸水垫6分别与硝酸纤维素膜4部分重叠，部分样品组合垫1的上方覆盖有胶带层2，硝酸纤维素膜4上，检测线\n3靠近样品组合垫1的一端，质控线5靠近吸水垫6的一端。胶带层有防止滴加样品过多，样品漫过硝酸纤维膜的作用。\n[0031] （8）用PBS配制1 ng/ml - 100 ng/ml不同浓度的拟除虫菊酯类农药标准品溶液（溴氰菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯），分别取3滴滴加到检测试纸的加样口，10 min后用荧光检测器（PE2030多功能标记检测仪）检测后，得到检测线与控制线的荧光强度的比值与标准品浓度做标准曲线，R值平均为0.9701，说明该检测试纸在1 ng/ml到100 ng/ml的浓度范围内，相对荧光强度与样品的浓度线相关，可以满足检测需求。