检测与胰腺胰岛细胞抗原分子和/或胰岛素反应的自身抗体

1.一种用于筛选动物受试体体液样本中与一种或多种胰腺胰岛细胞抗原 分子发生反应的分析物自身抗体的试剂盒，所述胰腺胰岛细胞抗原分子选自 GAD65、GAD67和蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗体组成的群，或它们的一种 或多种变异体、类似物、衍生物或片段，所述试剂盒包括：
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第一抗原分 子，所述抗原分子选自GAD65，GAD67，蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗体， 所述GAD65、GAD67或蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗体的一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子组成的群；该融合分子包括两种 或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、GAD67、蛋白 酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗体或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物 或片段；
(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分 子，所述抗原分子选自GAD65，GAD67，蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗体， GAD65、GAD67或蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗体的一种或多种变异体、类 似物、衍生物或片段，以及融合分子组成的群；该融合分子包括两种或多种 直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、GAD67、蛋白酪氨 酸磷酸酶样胰岛细胞抗体或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片 段；
(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述用于筛选的体液 样本相接触的方法，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应 而形成一种或多种复合物，该复合物包括[第一抗原分子]-[分析物自身抗体] -[第二抗原分子]，其中位于所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子 包含一种共同的抗原分子、或由该共同抗原分子衍生而得，或者其中所述一 种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体结合的区域 位于一种共同抗原分子中、或由该共同抗原分子衍生而得；
(d)所述(c)定义的复合物中的第一抗原分子在第一抗原与待检体液 样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法；
(e)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后，为所述(c) 定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法；
(f)检测是否存在(d)中所固定的(c)中所定义的复合物的方法，以 提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
2.根据权利要求1的试剂盒，其包括提供能与所述体液样本中的分析物 自身抗体发生反应、主要由GAD组成的第一抗原分子，所述抗原分子选自 GAD65，GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融 合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原 分子选自GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段， 如(d)中所定义被固定在固体支持物上，和与所述体液样本中的分析物自身 抗体发生反应、主要由GAD组成的第二抗原分子，所述抗原分子选自GAD65、 GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子， 该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自 GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，如(e) 中所定义被标记物所标记。
3.根据权利要求1的试剂盒，其包括提供能与所述体液样本中的分析物 自身抗体发生反应、主要由IA-2组成的第一抗原分子，所述抗原分子选自 IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融 合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，所述抗原分子选自IA-2 和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，如(d)所定义被固定到固 体支持物上；以及与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应、主要由 IA-2组成的第二抗原分子，所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或 间接融合的抗原分子，所述抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似 物、衍生物或片段，如(e)所定义被标记物所标记。
4.根据权利要求1的试剂盒，其包括提供(i)与体液样本中的分析物自 身抗体反应的GAD第一和第二抗原分子，所述GAD抗原分子选自GAD65、 GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子， 该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自 GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段， 其中融合分子中的至少一种抗原分子包括GAD65、GAD67，或它们的一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段，其中所述GAD第一抗原分子如(d)所定 义被固定到固体支持物上，且所述GAD第二抗原分子如(e)中所定义被标记 物所标记；以及(ii)与体液样本中的分析物自身抗体反应的IA-2第一和第 二抗原分子，所述IA-2抗原分子选自IA-2、其一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合 的抗原分子，该抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段，其中融合分子中的至少一种抗原分子包括IA-2 或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中所述IA-2第一抗原分 子如(d)所定义被固定到固体支持物上，且所述IA-2第二抗原分子如(e) 中所定义被标记物所标记。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，用于检测样品中与GAD或其一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体，其中，
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的基本由GAD抗原分子组 成的第一抗原分子，如(d)中所定义的被固定在固体支持物上，所述抗原分 子选自GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片 段以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子， 其中抗原分子选自GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段；
(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的基本由GAD抗原分子组 成的第二抗原分子，如(e)中所定义被标记物所标记，所述抗原分子选自 GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及 融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗 原分子选自GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物 或片段；
(c)将(a)中抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触的方法， 由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多 种复合物，该复合物包括[所述GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述 GAD第二抗原分子]；
(d)所述(c)定义的复合物中的GAD第一抗原分子在GAD第一抗原与 待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法；
(e)在GAD第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后，为(c) 定义的复合物中的GAD第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方 法；
(f)检测是否存在(d)中所固定的、(c)中所定义的复合物的方法， 以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，用于检测样品中与IA-2或其一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体，所述试剂盒包括：
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的、主要由IA-2抗原分 子组成的第一和第二抗原分子，所述抗原分子选自IA-2、其一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直 接或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段，其中所述IA-2第一抗原分子如(c)中所定义的被 固定在固体支持物上，所述IA-2第二抗原分子如(d)中所定义被标记物所 标记；
(b)将步骤(a)的IA-2抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接 触的方法，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子IA-2发生反应 而形成一种或多种复合物，该复合物包括[所述IA-2第一抗原分子]-[分析物 自身抗体]-[所述IA-2第二抗原分子]；
(c)所述(b)定义的复合物中的IA-2第一抗原分子在IA-2第一抗原 与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法；
(d)在IA-2第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后，为(b) 定义的复合物中的IA-2第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方 法；
(e)检测是否存在(c)中所固定的、(b)中所定义的复合物的方法， 以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，用于筛选样品中分别与GAD和IA-2， 或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的第一和第二分析 物自身抗体，其中，所述试剂盒包括：
(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的GAD第一和第二抗原分 子，GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合 的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变 异体、类似物、衍生物或片段，其中，所述融合分子中至少一种抗原分子包 括GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中 所述GAD第一抗原分子如(d)中所定义的被固定在固体支持物上，所述GAD 第二抗原分子如(e)中所定义的被标记物所标记；
(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的IA-2第一和第二抗原 分子，所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片 段以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子， 其中，抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67，其中，所述融合分子中至少一种 抗原分子包括IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中所 述IA-2第一抗原分子如(d)中所定义的被固定在固体支持物上，所述IA-2 第二抗原分子如(e)中所定义的被标记物所标记；
(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相 接触，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一 种或多种复合物，该复合物包括[GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗 体]-[GAD第二抗原分子]或[IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[IA-2 第二抗原分子]；
(d)所述(c)定义的复合物中的GAD或IA-2第一抗原分子在GAD或 IA-2第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物 上的方法；
(e)在GAD或IA-2第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后， 为所述(c)定义的复合物中的GAD或IA-2第二抗原分子提供直接或间接的 可检测的标记方法；
(f)检测是否存在(d)中所固定的、(c)中所定义的复合物的方法， 以提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。
8.根据权利要求1至7任意一项的试剂盒，即从属于权利要求1至2、4 至5或7中任意一项的试剂盒，其中所述第一和第二抗原分子包括GAD65或 GAD67。
9.根据权利要求1至7任意一项的试剂盒，即从属于权利要求1、3至4、 6或7中任意一项的试剂盒，其中所述第一和第二抗原分子包括IA-2。
10.根据权利要求1至7任意一项的试剂盒，其中，一种或多种复合物中 的第一或第二抗原分子的一种选自GAD65、GAD67或蛋白酪氨酸磷酸酶样胰 岛细胞抗体，而另一种包括第一或第二抗原分子的一种或多种变异体、类似 物、衍生物、或片段，它们能与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应。
11.根据权利要求10，即从属于权利要求1至2、4至5或7中任意一项 的试剂盒，其中，第一或第二抗原中的一种包括GAD65或GAD67，而另一种 抗原分子包括GAD65或GAD67的一种或多种变异体、类似物、衍生物、或片 段，它们能与所述体液样本中的分析物自身抗体发生反应。
12.根据权利要求10，即从属于权利要求1、3至4、6或5中任意一项 的试剂盒，其中，第一或第二抗原分子中的一种包括IA-2，而另一种抗原分 子包括IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，它们能与所述体 液样本中的分析物自身抗体发生反应。
13.根据权利要求1至7任意一项的试剂盒，其中，第一和第二抗原分子 都包括能与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的同一抗原分子的相同或 不同的变异体、类似物、衍生物或片段。
14.根据权利要求13，即从属于权利要求1至2、4至5或7中任意一项 的试剂盒，其中，第一和第二抗原分子都包括能与所述体液样本中的分析物 自身抗体反应的GAD65或GAD67的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或 片段。
15.根据权利要求13，即从属于权利要求1、3至4、6或7中任意一项 的试剂盒，其中，第一和第二抗原分子都包括能与所述体液样本中的分析物 自身抗体反应的IA-2的相同或不同的变异体、类似物、衍生物或片段。
16.根据权利要求1至14任意一项的试剂盒，其包括将所述一种或多种 第一抗原在与待检体液样本接触之前被固定到固体支持物上的固定方法。
17.根据权利要求16的试剂盒，其包括在一种或多种第二抗原分子与体 液样本接触的同时或者随后，将所述被固定的一种或多种第一抗原分子与体 液样本接触的方法。
18.根据权利要求17的试剂盒，其中，接触方法包括被固定的一种或多 种第一抗原分子与待检体液样本相接触，从而形成中间复合物，其包括[抗原 分子]-[分析物自身抗体]，其中抗原分子被固定到固体支持物上，然后将该 中间复合物与液相中的一种或多种第二抗原分子接触，从而形成复合物，其 包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子]，该复合 物通过第一抗原分子被固定到固体支持物上。
19.根据权利要求1所述的试剂盒，用于检测样品中与选自GAD65、GAD67 或蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗体或它们的一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段的一种或多种抗原分子反应的分析物自身抗体，其中：
(a)所述一种或多种第一抗原分子被固定在固体支持物上；
(b)所述一种或多种第二抗原分子存在于液相中，并如(d)中所定义 被标记物所标记；
所述试剂盒还包括，
(c)(a)和(b)所提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相 接触的方法，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成 一种或多种被固定的复合物，该复合物包括[所述第一抗原分子]-[分析物自 身抗体]-[所述第二抗原分子]，其中所述一种或多种复合物中的第一和第二 抗原分子包括一种共同的抗原分子、或是从该共同抗原分子衍生而得，或者 其中与分析物自身抗体结合的所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分 子的结合区域位于一种共同抗原分子中、或由该共同抗原分子衍生而得，该 被固定的复合物是通过复合物中的第一抗原分子被固定在固体支持物上的；
(d)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后，为所述(c) 定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测的标记方法；
(e)检测是否存在(c)中所定义的复合物的方法，以提供所述样本中 是否存在分析物自身抗体的指示。
20.根据权利要求19的试剂盒，其中所述与体液样本中分析物自身抗体 反应的第一和第二抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种变 异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种 直接或间接融合的抗原分子，所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、和它 们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。
21.根据权利要求1至20的任意一项试剂盒，其与治疗有效量的至少一 种治疗剂组合，该治疗剂能有效治疗与自身抗体相关的一种或多种疾病，所 述的自身抗体能与一种或多种选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素的抗原分 子发生反应。

技术领域\n本发明涉及检测与胰腺胰岛细胞抗原分子和/或胰岛素反应的自身抗体 的方法和试剂盒，例如用来检测表征胰岛素依赖性糖尿病(IDDM，1型糖尿病) 开始出现或疾病存在的自身抗体的方法和试剂盒。\n背景技术\n1型糖尿病是流行的自身免疫性疾病中的一种，在欧洲和北美，有超过2 百万的患者(M A Atkinson，G S Eisenbarth.Type 1 diabetes：new perspectives on disease pathogenesis and treatment.The Lancet，2001 358：221-229)。而且，1型 糖尿病的发病率在全球范围内每年以2.5％的速率增长，预测2010年后发病 率将比1998年高出40％(M A Atkinson，G S Eisenbarth.Type 1diabetes：new perspectives on disease pathogenesis and treatment.The Lancet，2001 358： 221-229)。\n胰腺β细胞抗原的自身抗体是1型糖尿病的易识别血清标记物，其包括： 在免疫荧光测试(ICA)中与胰岛细胞反应的自身抗体，谷氨酸脱羧酶(GAD， 尤其是其65kDa异构体GAD65)的自身抗体，蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞 抗原(指IA-2或ICA512)自身抗体和胰岛素的自身抗体。GAD65自身抗体和 IA-2自身抗体是ICA反应性成分(M A Atkinson，G S Eisenbarth Type 1diabetes： new perspectives on disease pathogenesis and treatment.The Lancet，2001 358： 221-229)。至少在约90％的1型糖尿病患者血清诊断中存在GAD65，IA-2和胰 岛素这三种类型的自身抗体中的一种(M A Atkinson，G S Eisenbarth.Type 1 diabetes：new perspectives on disease pathogenesis and treatment.The Lancet，2001 358：221-229)。上述自身抗体作为胰腺β细胞自身免疫的血清标 记物的检测也可以被用于监测糖尿病预防试验的患者(M A Atkinson，G S Eisenbarth.Type 1 diabetes：Desc/Clms Page number 2 new perspectives on disease pathogenesis and treatment.The Lancet，2001 358：221-229)。\n目前，GAD65自身抗体是利用35S，3H或125I标记的GAD65放射活化，通 过免疫沉淀测试法(IPA)进行检测。用35S或3H标记的GAD65已在体外转录/ 翻译体系中制备出(C E Grubin，T Daniels，B Toivola，M Landdin-Olsson，W A Hagopian，L Li，A E Karlsen，E Boel，B Michelsen，A Lernmark.A novel radioligand binding assay to determine diagnostic accuracy ofisoform-specific glutamic acid decarboxylase antibodies in childhoodIDDM.Diabetologia，1994 37：344-350；J S Petersen，K R Hejnaes，A Moody，A EKarlsen，M O Marshall， MHoier-Madsen，E Boel，B K Michelsen，T Dyrberg.Detection ofGAD65 antibodies in diabetes and other autoimmune diseases using a simple radioligand assay.Diabetes，1994 43：459-467；and AFalorni，EOrtqvist，B Persson，A Lernmark.Radioimmunoassays for glutamic acid decarboxylase(GAD65)and GAD65autoantibodies using 35S or 3H recombinant human ligands.Journal of Immunological Methods，1995 186：88-89)。天然的GAD65，例如从脑组织中分 离的鼠或猪GAD65(M J Rowley，I R Mackay，Q-Y Chen，W J Knowles，P Z Zimmet.Antibodies to glutamic acid decarboxylase discriminate major types of diabetes mellitus.Diabetes，1992 41：548：551；and M Ohta，H Obayashi，K Takahashi，YKitagawa，K Nakano，S Matsuo，M Ohishi，N Itoh，K Hayashi，K Ohta.A simple solid-phase radioimmunoassay for glutamic acid decarboxylase (GAD)antibodies in patients with diabetes mellitus.J Clin Biochem Nutr，1996 20：139-148)或重组人GAD65，例如在昆虫细胞、酵母菌或哺乳细胞中表达的 重组人GAD65(F Luhder，K-P Woltanski，L Mauch，HHaubruck，K-D Kohnert，I Rjasanowski，D Michaelis，M Ziegler.Detection of autoantibodies to the 65-kDisoform of glutamate decarboxylase by radioimmunoassay.European Journal of Endocrinology，1994 130：575-80；M Powell，L Prentice，T Asawa，R Kato，J Sawicka，H Tanaka，V Petersen，A Munkley，S Morgan，B Rees Smith， JFurmaniak.Clinica Chimica Acta，1996 256：175-188；and T Matsuba，M Yano， NoAbiru，H Takino，S Akazawa，S Nagataki，K Yasukawa.Expression of recombinant human glutamic acid decarboxylase(GAD)in myeloma cells and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for autoantibodies to GAD.J Biochem，1997 121：20-24)已经用125I标记并用于IPAs中。GAD65和IA-2的 重组融合蛋白也已经用于IPAs中来检测组合的自身抗体(A Zavialov，M Ankelo，AWesterlund-Karlsson，M Knip，J Illonen，A Hinkkanen.Novel fusion proteins in the analysis of diabetes associated autoantibodies to GAD65 and IA-2. Journal of Immunological Methods，2000 246：91-96；and M Rickert，J Seissler， W Dangel，H Lorenz，W Richter.Fusion proteins for combined analysis of autoantibodies to the 65-kDaisoform of glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2 in insulin dependent diabetes mellitus.Clinical Chemistry，2001 47(5)： 926-934)。\n目前可获得的基于35S-GAD65的IPAs在技术上要求高，难于标准化，价 格昂贵且不适合用于试剂盒中。基于人重组125I-GAD65与基于35S-GAD65的 测试具有相同的灵敏性和特异性，但前者具有产率高、技术简单、成本低的 优点，且易于制成试剂盒。然而，基于从鼠或猪的脑组织中分离的125I-GAD65， 由于受到GAD67异构体的污染而使其检测特异性较低。\nGAD65自身抗体也可用不同类型的ELISAs检测(A M Gronowski，E C C Wong，T RWilhite，D L Martin，C H Smith，C A Parvin，M Landt.Detection of glutamic acid decarboxylase autoantibodies with the varelisa ELISA.Clinical Chemistry，1995 41(10)：1532-1534；and H D Mehta，B S Vold，S Minkin，E FUllman.DELISA：sensitive nonisotopic assay for GAD65 autoantibodies，a key risk-assessment marker for insulin-dependent diabetes mellitus.Clinical Chemistry，1996 42(2)：263-269)。\n然而，目前通过ELISA检测GAD65自身抗体的试验比上述IPAs的灵敏 性和特异性差，且研究的成熟程度也不如IPAs(R S Schmidli，P G Colman，E Bonifacio，Participating Laboratories.Disease sensitivity and specificity of 52 assays for glutamic acid decarboxylase antibodies.The second international GADAb workshop.Diabetes，1995 44：636-640)。\n本发明解决了上面提及的用于筛选表征1型糖尿病发病或疾病存在的自 身抗体相关的方法和试剂盒的问题，并可以普遍用于与胰腺胰岛细胞抗原分 子和/或胰岛素反应的自身抗体的测定中。本发明的方法和试剂盒尤其具有与 上述现有技术相比得到改善的特异性和灵敏性。\n本发明提供一种筛选动物受试体体液样本中与一种或多种抗原分子发生 反应的分析物自身抗体的方法，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和 胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，所述方法包括：\n(a)提供所述受试体的体液样本；\n(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体能发生反应的一种或多种第一 抗原分子，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和所述胰腺胰 岛细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以 及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中 抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段；\n(c)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗 原分子，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛 细胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及 融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗 原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类 似物、衍生物或其片段；\n(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述用于筛选的 体液样本接触，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形 成一种或多种复合物，该复合物包括[第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[第二 抗原分子]，其中存在于所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括 一种共同的抗原分子或由该共同抗原分子衍生而得，或者其中所述一种或多 种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体的结合区域存在于 一种共同抗原分子中或由该共同抗原分子衍生而得；\n(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供固定方法，由此步骤(d)形成 的复合物中的第一抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被固定到固体支持 物上；\n(f)在步骤(d)之前或之中或之后提供直接或间接的可检测的标记方 法，由此步骤(d)形成的复合物中的第二抗原分子在步骤(d)之前或之中 或之后被这种直接或间接的可检测标记方法所标记；\n(g)检测是否存在步骤(e)中所固定的、在步骤(d)中形成的复合物 物，以获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。\n本发明的筛选分析物自身抗体的方法的优点尤其在于提供了高特异性和 高灵敏性的自身抗体检测。\n本发明所需的与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子、或其一种 或多种变异体、类似物、衍生物或其片段或其融合分子可以选自任何胰腺胰 岛细胞抗原分子和胰岛素、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片 段，或这些物质的融合分子，尤其适于选自谷氨酸脱羧酶(GAD，尤其是其谷 氨酸脱羧酶65KDa和67KDa异构体，GAD65和GAD67)、蛋白质酪氨酸磷酸 酶样胰岛细胞抗原(IA-2)和胰岛素，或它们的一种或多种变异体(诸如， IA-2β)、类似物、衍生物或片段，或包含两种或多种上述分子的融合分子， 存在于体液样本中的分析物自身抗体能与这些分子反应。在本发明特别优选 的实施例中，采用了一种或多种上述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素，尤其 是上述胰腺胰岛细胞抗原分子，优选一种或多种GAD65，GAD67或IA-2。可 选择的方案是，优选采用一种或多种上述胰腺胰岛细胞抗原分子或胰岛素的 一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，尤其是一种或多种上述胰腺胰 岛细胞抗原分子的变异体、类似物、衍生物或片段，优选一种或多种GAD65， GAD67或IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。本发明另一个 可选择的优选实施例中，优选采用一种或多种包括两种或多种直接或间接融 合的抗原分子的融合分子，所述抗原分子选自上述胰腺胰岛细胞抗原分子、 胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。\n因此，可以理解本发明所述术语GAD包括所有GAD异构体，尤其包括 GAD65或GAD67。在一些实施例中优选使用GAD65，而在另外一些实施例中 优选使用GAD67。也可以理解，本发明包括其公开范围内的包含有GAD65 或GAD67或其一种或多种片段(如其结合区域)的融合分子。例如，本发明 范围内的融合分子包括GAD65与GAD67直接或间接融合，或GAD65的一个 或多个结合区域与GAD67的一个或多个结合区域直接或间接融合的融合分 子。并且，还可以理解本发明范围内的融合分子可以包括IA-2，或其一个或 多个结合区域与IA-2β或IA-2β的一个或多个结合区域直接或间接融合的融 合分子。本发明还包括GAD65或GAD67、或其一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段与IA-2或IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段 直接或间接融合的融合分子。\n本发明所需的与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子、或其一种 或多种变异体、类似物、衍生物或片段尤其适于选自谷氨酸脱羧酶(GAD，尤 其是GAD65或GAD67)、蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗原(IA-2)、或它们的 一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，这些分子能与存在于分析物体 液样本中的自身抗体发生反应。\n在本发明的一个优选方案中，上述筛选方法适用于检测下述物质的分析 物自身抗体：GAD和/或IA-2，一种或多种包括GAD65或GAD67的抗原分子， 或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，和/或IA-2，或其一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段的抗原分子，通过这些抗原分子与体液样 本中的分析物自身抗体发生反应而得到检测。当本发明采用融合抗原分子时， 适宜的融合分子可以包括GAD65或GAD67或其一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段，与IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段直接 或间接融合的融合分子；适宜的融合分子也可以包括GAD65与GAD67直接或 间接融合的融合分子、或GAD65的一个或多个结合区域与GAD67的一个或多 个结合区域直接或间接融合的融合分子；适宜的融合分子还包括IA-2或其一 个或多个结合区域与IA-2β或其一个或多个结合区域直接或间接融合的融合 分子。\n本发明优选的方法包括提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种 或多种第一抗原分子，其选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素，它们的一种 或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两 种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、 胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，该第一抗原分 子按照本发明方法中的步骤(e)被固定到固体支持物上，然后提供与体液样 本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子，其选自GAD65、 GAD67、IA-2、胰岛素，它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段， 以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，该 抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段，其根据步骤(f)提供的标记方法被标记。\n本发明更优选的方法包括提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的一 种或多种第一抗原分子，其选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多种 变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多 种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它 们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段(例如，与所述体液样本中 的分析物自身抗体反应的融合分子包括GAD65、GAD67、或它们的一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段与IA-2或其一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段直接或间接融合的融合分子)，该第一抗原分子按照本发明方法 中的步骤(e)被固定到固体支持物上，提供与体液样本中的分析物自身抗体 反应的一种或多种第二抗原分子，其选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子，该融合分子包括两 种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2 和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段(例如与所述体液样本 中的分析物自身抗体反应的融合分子，其包括GAD65、GAD67、或它们的一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段与IA-2或其一种或多种变异体、类 似物、衍生物或片段直接或间接融合的融合分子)，其被步骤(f)提供的标 记物所标记。本发明的优选方法包括检测GAD的自身抗体方法，该方法包 括提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的主要是由GAD抗原分子组成 的第一抗原分子，其中GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或 多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种 或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自GAD65、GAD67和它们 的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段(例如与所述体液样本中的分 析物自身抗体反应的融合分子包括：GAD65与GAD67直接或间接融合，或 GAD65的一个或多个结合区域与GAD67的一个或多个结合区域直接或间接融 合的融合分子)，该第一抗原分子按照本发明方法中的步骤(e)被固定到固 体支持物上，提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的主要由GAD组成 的抗原分子，其选自GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合 的抗原分子，该抗原分子选自GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段(例如与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的融 合分子包括：GAD65与GAD67直接或间接融合，或GAD65的一个或多个结合 区域与GAD67的一个或多个结合区域直接或间接融合的融合分子)，其被步 骤(f)提供的标记方法所标记。本发明的优选方法还有检测IA-2自身抗体 的方法，该方法包括提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的主要由IA-2 抗原分子组成的第一抗原分子，该抗原分子选自IA-2、或其一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直 接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类 似物、衍生物或片段(例如与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的融合 分子，包括IA-2或其一个或多个结合区域与IA-2β或其一个或多个结合区域 直接或间接融合的融合分子)，该第一抗原分子按照本发明方法中的步骤(e) 被固定到固体支持物上，以及提供与体液样本中的分析物自身抗体反应的基 本由IA-2抗原分子组成的第二抗原分子，该抗原分子选自IA-2或其一种或 多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种 或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自IA-2和其一种或多种变 异体、类似物、衍生物或片段(例如与所述体液样本中的分析物自身抗体反 应的融合分子，包括IA-2或其一个或多个结合区域与IA-2β或其一个或多个 结合区域直接或间接融合的融合分子)，其被步骤(f)提供的标记方法标记。 本发明的方法还可以是用于检测GAD和IA-2二者的自身抗体的方法，该方 法包括提供(i)与体液样本中的分析物自身抗体反应的GAD第一和第二抗 原分子，所述GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直 接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的 一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中至少一种融合分子中的抗 原分子包括GAD65、GAD67，所述GAD第一抗原分子按照本发明方法中的 步骤(e)被固定到固体支持物上，且所述GAD第二抗原分子被步骤(f)提 供的标记方法所标记；以及(ii)与体液样本中的分析物自身抗体反应的IA-2 第一和第二抗原分子，所述IA-2抗原分子选自IA-2、它的一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直 接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的 一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中至少一种融合分子中的抗 原分子包括IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中所述 IA-2第一抗原分子按照本发明方法中的步骤(e)被固定到固体支持物上， 且所述IA-2第二抗原分子被步骤(f)提供的标记方法所标记。\n因此，本发明的一个优选实施例包括一种筛选动物受试体体液样本中能 与一种或多种抗原分子反应的分析物自身抗体的方法，所述抗原分子选自胰 腺胰岛细胞抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，所述 方法包括：\n(a)提供所述受试体的所述体液样本；\n(b)提供与存在于体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种 第一抗原分子，所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子，该融合分子包括两种或多 种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、 它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段；\n(c)提供与存在于体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种 第二抗原分子，所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、它们的一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子，该融合分子包括两种或多 种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和 它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段；\n(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述用于筛选的 体液样本接触，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形 成一种或多种复合物，该复合物包括[第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[第二 抗原分子]，其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子包括一种共 同的抗原分子或由该共同抗原分子衍生而得，或者其中所述一种或多种复合 物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体的结合区域存在于一种共 同的抗原分子或由该共同抗原分子衍生而得；\n(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供固定方法，由此步骤(d)形成 的复合物中的第一抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被固定到固体支持 物上；\n(f)在步骤(d)之前或之中或之后，给予直接或间接的可检测标记方 法，由此步骤(d)形成的复合物中的第二抗原分子在步骤(d)之前或之中 或之后被这种直接或间接的可检测标记方法所标记；\n(g)检测是否存在步骤(e)中所固定的、在步骤(d)中形成的复合物， 以得到所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。\n本发明的优选实施例还包括筛选动物受试体体液样本中只与GAD或其 一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的方法， 所述方法包括：\n(a)提供所述受试体的所述体液样本；\n(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的主要由GAD抗原 分子组成的第一和第二抗原分子，所述抗原分子选自GAD65、GAD67、它们 的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子 包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、 GAD67、它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中所述GAD 第一抗原分子根据步骤(d)被固定在固体支持物上，所述GAD第二抗原分 子被步骤(e)提供的标记方法所标记；\n(c)将步骤(b)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本接触， 由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多 种复合物，该复合物包括[GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[GAD第二 抗原分子]；\n(d)在步骤(c)之前或之中或之后进行固定，由此步骤(c)形成的复 合物中的GAD第一抗原分子在步骤(c)之前或之中或之后被固定到固体支 持物上；\n(e)在步骤(c)之前或之中或之后，提供直接或间接的可检测标记方 法，由此步骤(c)形成的复合物中的GAD第二抗原分子在步骤(c)之前 或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记方法所标记；\n(f)检测是否存在步骤(d)中所固定的、在步骤(c)中形成的复合物， 以得到所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。\n本发明的优选实施例还包括筛选动物受试体体液样本中与IA-2或其一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的方法，所 述方法包括：\n(a)提供所述受试体的所述体液样本；\n(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的主要由IA-2抗原 分子组成的第一和第二抗原分子，所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变 异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直 接或间接融合的抗原分子，其中，抗原分子选自IA-2和所述一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段，其中所述IA-2第一抗原分子根据步骤(d)被 固定在固体支持物上，所述IA-2第二抗原分子根据步骤(e)的标记方法被 标记；\n(c)将步骤(b)提供的IA-2抗原分子同时或相继与所述待检体液样本 相接触，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述IA-2抗原分子发生反应而 形成一种或多种复合物，该复合物包括[IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗 体]-[IA-2第二抗原分子]；\n(d)在步骤(c)之前或之中或之后进行固定，由此步骤(c)形成的复 合物中的IA-2第一抗原分子在步骤(c)之前或之中或之后被固定到固体支 持物上；\n(e)在步骤(c)之前或之中或之后，提供直接或间接的可检测标记方 法，由此步骤(c)形成的复合物中的IA-2第二抗原分子在步骤(c)之前或 之中或之后被这种直接或间接的可检测标记方法所标记；\n(f)检测是否存在步骤(d)所固定的、步骤(c)所形成的复合物，以 获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。\n本发明的优选实施例还包括筛选动物受试体体液样本中分别与GAD和 IA-2反应、或与它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的第 一和第二分析物自身抗体的方法，所述方法包括：\n(a)提供所述受试体的所述体液样本；\n(b)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的GAD第一和第二 抗原分子，GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或 间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中，所述融合分子中至少一种 抗原分子包括GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物 或片段，其中所述GAD第一抗原分子根据步骤(e)被固定在固体支持物上， 所述GAD第二抗原分子被步骤(f)的标记方法所标记；\n(c)提供与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的IA-2第一和第二 抗原分子，所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物 或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原 分子，其中抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段，其中，所述融合分子中至少一种抗原分子包括IA-2 或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中所述IA-2第一抗原分 子根据步骤(e)被固定在固体支持物上，所述IA-2第二抗原分子被步骤(f) 提供的标记物方法标记；\n(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样 本相接触，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形 成一种或多种复合物，该复合物包括[GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗 体]-[GAD第二抗原分子]或[IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[IA-2第二 抗原分子]；\n(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供固定方法，由此步骤(d)形成 的复合物中的GAD或IA-2第一抗原分子在步骤(d)之前或之中或之后被 固定到固体支持物上；\n(f)在步骤(d)之前或之中或之后，提供直接或间接的可检测标记方 法，由此步骤(d)形成的复合物中的GAD或IA-2第二抗原分子在步骤(d) 之前或之中或之后被这种直接或间接的可检测标记方法所标记；\n(g)检测是否存在步骤(e)中固定的、步骤(d)中形成的复合物，以 获得所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。\n本发明方法可以优选为上述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子 都包括一种或多种共同的抗原分子。例如，一种或多种复合物中的第一和第 二抗原分子可以包括GAD65或GAD67；或者可以包括IA-2。\n与所述体液样本中自身抗体反应的、存在于一种或多种复合物中的第一 或第二抗原分子包括选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素的抗原分子，而存 在于一种或多种复合物中的其它抗原分子，包括上述抗原分子的一种或多种 变异体、类似物、衍生物、或片段。例如，与所述体液样本中自身抗体反应 的一种或多种复合物中的第一或第二抗原包括GAD65或GAD67，而存在于一 种或多种复合物中的其它抗原分子包括GAD65或GAD67的一种或多种变异 体、类似物、衍生物、或片段。再例如，与所述体液样本中自身抗体反应的 一种或多种复合物中的第一或第二抗原分子包括IA-2，而存在于一种或多种 复合物中的另一种抗原分子，包括IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生 物或片段。\n本发明的再一实施例是，一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子均 包括能与所述体液样本中自身抗体反应的同一抗原分子的相同或不同的变异 体、类似物、衍生物或片段。例如，一种或多种复合物中的第一和第二抗原 分子均包括与所述体液样本中自身抗体反应的GAD65或GAD67的相同或不 同的变异体、类似物、衍生物或片段。再例如，一种或多种复合物中的第一 和第二抗原分子均包括与所述体液样本中自身抗体反应的IA-2的相同或不 同的变异体、类似物、衍生物或片段。从上述可以理解，复合物中的两种抗 原分子包括衍生于同一抗原分子的变异体、类似物、衍生物或片段，这些变 异体、类似物、衍生物或片段可以相同或不同(例如变异体1和变异体2， 其中，变异体1和2可以分别代表GAD65或GAD67的不同变异体，或片段1 和片段2，其中，片段1和2可以分别代表GAD65或GAD67的不同片段，诸 如，完全不同或部分重叠的GAD65或GAD67的表位)。\n在本发明所述采用融合分子的情况下，可以理解该融合分子包括独特的 抗原分子(例如GAD65和IA-2)，但本发明所形成的复合物中的融合分子， 其分别由第一和第二抗原提供的与分析物自身抗体相结合的区域存在于一种 同一抗原分子中，或由该同一抗原分子衍生而得。利用一种或多种融合分子 所形成的复合物的实例包括(i)[GAD-IA-2固定]-[分析物自身抗体]-[GAD-IA-2 标记]，其中自身抗体包括GAD自身抗体，该自身抗体与[GAD-IA-2固定]和 [GAD-IA-2标记]中的GAD的结合区域发生反应，或复合物的自身抗体包括 IA-2自身抗体，该自身抗体与[GAD-IA-2固定]和[GAD-IA-2标记]中的IA-2的结 合区域发生反应，或(ii)[GAD-(片段)固定]-[分析物自身抗体]-[GAD-IA-2标记]， 其中，GAD分析物自身抗体与[GAD-(片段)固定]和[GAD-IA-2标记]中的GAD 的结合区域发生反应，或(iii)[IA-2(片段)固定]-[分析物自身抗体]-[GAD-IA-2 标记]，其中，IA-2分析物自身抗体与[IA-2(片段)固定]和[GAD-IA-2标记]中的IA-2 结合区域发生反应，其中GAD可以为GAD65或GAD67。\n适宜的可检测标记物选自酶标记物、同位素标记物、化学发光标记物、 荧光标记物、颜料及类似物，典型的标记物选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物 酶、生物素或类似物，尤其包括生物素。这些可检测标记物(当与上述一种 或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段或其一种或 多种融合分子相结合)与一种或多种被标记的底物(诸如抗生物素蛋白或抗 生物素蛋白链菌素结合物，例如抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶结合物 或类似结合物)发生反应，由此得到的结合物可以通过测试光密度或类似方 法而得到检测。\n可检测标记物可以直接与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段，或它们的一种或多种融合分子结合。可检测标 记物也可以间接与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段，或它们的一种或多种融合分子结合，尤其是可检测标记物与 一种或多种抗体或其它结合试剂相结合，所述抗体或试剂能够与上述一种或 多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，或它们的一 种或多种融合分子相结合。\n本发明的筛选自身抗体的方法尤其包括通过本领域熟知的非竞争性夹心 测试法，直接监测本发明所提供的(i)待检受试体体液样本中的自身抗体与 (ii)上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或 片段，或它们的一种或多种融合分子的反应。\n根据本发明一个优选实施例，上述一种或多种第一抗原分子或其一种或 多种变异体、类似物、衍生物或片段，或它们的一种或多种融合分子被固定 在固体支持物上，上述一种或多种第二抗原分子或其一种或多种变异体、类 似物、衍生物或片段，或所述物质的一种或多种融合分子与可检测标记物结 合，其中优选的第二抗原分子存在于液相中，这是熟知的ELISA技术的惯例 做法。\n本发明的一种优选方法是将与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的 一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段， 或它们的一种或多种融合分子，在与待检体液样本接触之前，固定到固体支 持物上。与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的该固定的一种或多种第 一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，或它们的一种 或多种融合分子，在与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种 第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，或这些物质 的一种或多种融合分子与体液样本接触的同时或者随后，与体液样本接触。 尤其优选被固定的能与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种 第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段、或所述物质 的一种或多种融合分子与待检体液样本接触以形成中间复合物，其包括[抗原 分子]-[分析物自身抗体]，其中抗原分子被固定到固体支持物上，然后将形成 的中间复合物与液相中的、并能与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的 一种或多种第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段、 或它们的一种或多种融合分子接触，从而形成复合物，其包括[所述第一抗原 分子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子]，该复合物是通过第一抗原分子 被固定到固体支持物上。\n因此，本发明提供了一种筛选动物受试体体液样本中分析物自身抗体的 方法，该抗体与一种或多种抗原分子反应，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞 抗原分子和胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，所 述方法包括：\n(a)提供所述受试体体液样本；\n(b)提供一种或多种与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的第一抗 原分子，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或 多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种 或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分 子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段；\n(c)提供与体液样本中分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原 分子，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细 胞抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融 合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原 分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似 物、衍生物或其片段，该第二抗原分子存在于液相中；\n(d)将步骤(b)和(c)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样 本相接触，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成一 种或多种被固定的复合物，该复合物包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗 体]-[所述第二抗原分子]，其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分 子包括一种共同的抗原分子或是从该共同抗原分子衍生而得，或者其中与分 析物自身抗体结合的所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子的结合 区域存在于一种共同抗原分子中或由该共同抗原分子衍生而得；\n(e)在步骤(d)之前或之中或之后提供直接或间接检测的标记物，由 此，步骤(d)形成的复合物中的第二抗原分子在步骤(d)之前或之中或之 后被这种直接或间接的可检测标记物所标记；\n(f)检测是否存在步骤(d)形成的复合物，以获得所述样本中是否存 在分析物自身抗体的指示。\n本发明所需的能与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子或其一种 或多种变异体、类似物、衍生物或片段，或这些物质的融合分子可以选自任 何胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍 生物或片段，或这些物质的融合分子，尤其适于选自谷氨酸脱羧酶(GAD，尤 其是其65KDa和67KDa异构体GAD65和GAD67)、蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛 细胞抗原(IA-2)和胰岛素，或它们的一种或多种变异体(诸如，IA-2β)、类似 物、衍生物或片段，或包含两种或多种上述物质的融合分子。本发明尤其所 需的与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段，适于选自谷氨酸脱羧酶(GAD，尤其是GAD65和 GAD67)、蛋白酪氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗原(IA-2)、或所述物质的一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段。\n本发明还包括其它接触技术，例如在上述接触步骤之前并不预先固定一 种或多种第一抗原分子或其变异体、类似物、衍生物、或片段，或这些物质 的一种或多种融合分子，而是先将固体支持物与用来结合一种或多种第一抗 原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段、或一种或多种这些 物质的融合分子的结合剂相接触，然后将一种或多种上述第一和第二抗原分 子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，或一种或多种这些物质 的融合分子以及待检体液样本与处理后的固体支持物接触。\n关于本发明所采用的固体支持物和条件，它与已知免疫测试技术中所惯 用的固体支持物和使用条件并没有根本的区别。本发明所采用的固体支持物 包括已知ELISA技术中常用的ELISA板，或其它适宜支持物，诸如管、颗 粒、磁珠、硝酸纤维或类似物。\n本发明还提供了一种用于筛选动物受试体体液样本中与一种或多种抗原 分子发生反应的分析物自身抗体的试剂盒，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞 抗原分子和胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，所 述试剂盒包括：\n(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第一抗原分 子，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和所述胰腺胰岛细胞 抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合 分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分 子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段；\n(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分 子，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞 抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合 分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分 子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段；\n(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述用于筛选的体液 样本相接触的方法，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应 而形成一种或多种复合物，该复合物包括[第一抗原分子]-[分析物自身抗 体]-[第二抗原分子]，其中存在于所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原 分子包括一种共同的抗原分子或由该共同抗原分子衍生而得，或者其中所述 一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体的结合区 域存在于一种共同的抗原分子中或由该共同的抗原分子衍生而得；\n(d)所述(c)定义的复合物中的第一抗原分子在第一抗原与待检体液 样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法；\n(e)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后，为所述(c) 定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法；\n(f)检测是否存在(d)中所固定的、(c)中所形成的复合物，以提供 所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。\n本发明用于筛选分析物自身抗体的试剂盒的优点尤其在于，它能够高特 异性和高灵敏性地检测这种自身抗体。\n本发明所需的与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子或其一种或 多种变异体、类似物、衍生物或其片段，或这些物质的融合分子可以选自任 何胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素、和它们的一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段，或这些物质的融合分子，尤其适于从谷氨酸脱羧酶(GAD，尤 其是其65KDa和67KDa的谷氨酸脱羧酶异构体GAD65和GAD67)、蛋白质酪 氨酸磷酸酶样胰岛细胞抗原(IA-2)和胰岛素，或它们的一种或多种变异体(诸 如，IA-2β)、类似物、衍生物或片段，或包含两种或多种上述物质的融合分 子。尤其是，本发明所需的能与分析物自身抗体反应的一种或多种抗原分子 或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段，适于选自谷氨酸脱羧酶 (GAD，尤其是其65KDa和67KDa异构体GAD65和GAD67)、蛋白质酪氨酸磷 酸酶样胰岛细胞抗原(IA-2)和胰岛素，或它们的一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段。\n在本发明的一个优选方案中，上述筛选试剂盒是用于检测分析物自身抗 体的，该抗体是下述抗原的抗体：GAD65或GAD67和/或IA-2、或它们的一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及包括GAD65或GAD67或其一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段的抗原分子，和/或IA-2或其一种 或多种变异体、类似物、衍生物或片段的抗原分子。对于本发明使用融合分 子的试剂盒情况下，合适的融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原 分子，所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段，如前述方法部分的大量描述。\n本发明优选的试剂盒包括与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或 多种第一抗原分子，其选自GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素，这些物质的一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，所述融合分子包 括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自GAD65、GAD67、 IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，该第一 抗原分子如(d)中所定义被固定到固体支持物上，以及与体液样本中的分析 物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子，其选自GAD65、GAD67、IA-2、 胰岛素，它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子， 所述融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自 GAD65、GAD67、IA-2、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生 物或片段，其如(e)中所定义被标记物所标记。\n本发明更优选的试剂盒包括与体液样本中的分析物自身抗体反应的一种 或多种第一抗原分子，其选自GAD65、GAD67、IA-2、上述物质的一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，所述融合分子包括两种 或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2 和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，该第一抗原分子如(d) 中所定义被固定到固体支持物上，以及与体液样本中的分析物自身抗体反应 的一种或多种第二抗原分子，其选自GAD65、GAD67、IA-2，上述物质的一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子，所述融合分子包括 两种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自GAD65、GAD67、 IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其如(e)中所 定义被标记物所标记。本发明的优选试剂盒还包括与体液样本中的分析物自 身抗体反应的主要是由GAD抗原分子组成的第一抗原分子，其中GAD选自 GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以 及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗 原分子选自GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或 片段，该第一抗原分子如(d)中所定义被固定到固体支持物上，以及与体液 样本中的分析物自身抗体反应的主要由GAD组成的第二抗原分子，其选自 GAD65、GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以 及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗 原分子选自GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或 片段，其如(e)中所定义被标记物所标记。本发明的优选试剂盒还包括与体 液样本中的分析物自身抗体反应的基本由IA-2抗原分子组成的第一抗原分 子，该抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以 及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗 原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，该第一抗 原分子如(d)中所定义被固定到固体支持物上，以及与体液样本中的分析物 自身抗体反应的基本由IA-2抗原分子组成的第二抗原分子，该抗原分子选自 IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子，该融合 分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自IA-2和其 一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其如(e)中所定义被标记物所 标记。本发明的另一种试剂盒包括(i)与体液样本中的分析物自身抗体反应 的GAD第一和第二抗原分子，所述GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、所 述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子，该融合 分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，该抗原分子选自GAD65、 GAD67、IA-2和它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中至 少一种融合分子中的抗原分子包括GAD65、GAD67或所述物质的一种多种变 异体、类似物、衍生物或片段，其中所述GAD第一抗原分子如(d)中所定 义被固定到固体支持物上，且所述GAD第二抗原分子如(e)中所定义被标 记物标记；以及(ii)与体液样本中的分析物自身抗体反应的IA-2第一和第 二抗原分子，所述IA-2抗原分子选自IA-2、其一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的 抗原分子，该抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段，其中至少一种融合分子中的抗原分子包括IA-2 或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中所述IA-2第一抗原分 子如(d)中所定义被固定到固体支持物上，且所述IA-2第二抗原分子如(e) 中所定义被标记物所标记。\n因此，本发明的一个优选实施例包括一种筛选动物受试体体液样本中能 与一种或多种抗原分子反应的分析物自身抗体的试剂盒，所述抗原分子选自 胰腺胰岛细胞抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，所 述试剂盒包括：\n(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第一抗原分 子，所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、所述物质的一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接 或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和所述物 质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段；\n(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分 子，所述抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2、所述物质的一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接 或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和所述物 质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段；\n(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相 接触的方法，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成 一种或多种复合物，该复合物包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所 述第二抗原分子]，其中存在于所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分 子包括一种共同的抗原分子或是由该共同抗原分子衍生而得，或者其中所述 一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子与所述分析物自身抗体相结合的 区域存在于一种共同抗原分子中或由该共同抗原分子衍生而得；\n(d)所述(c)定义的复合物中的第一抗原分子在第一抗原与待检体液 样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法；\n(e)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后，为所述(c) 定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法；\n(f)检测是否存在(d)中所固定的(c)中所定义的复合物，以提供所 述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。\n本发明的优选实施例还包括筛选动物受试体体液样本中与GAD或其一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的试剂盒， 所述试剂盒包括：\n(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的基本由GAD抗原分子 组成的第一和第二抗原分子，所述抗原分子选自GAD65、GAD67、所述物质 的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段以及融合分子，该融合分子包 括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、 GAD67、所述物质的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中所述 GAD第一抗原分子如(c)中所定义的被固定在固体支持物上，所述GAD 第二抗原分子如(d)中所定义被标记物所标记；\n(b)将(a)中抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接触的方法， 由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一种或多 种复合物，该复合物包括[所述GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[所述 GAD第二抗原分子]；\n(c)所述(b)定义的复合物中的GAD第一抗原分子在GAD第一抗原 与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法；\n(d)在GAD第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后，为(b) 所定义的复合物中的GAD第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的 方法；\n(e)检测是否存在(c)中所固定的(b)中所定义的复合物，以提供所 述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。\n本发明的优选实施例还包括筛选动物受试体体液样本中与IA-2或其一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段反应的分析物自身抗体的试剂盒， 所述试剂盒包括：\n(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的主要由IA-2抗原分子 组成的第一和第二抗原分子，所述抗原分子选自IA-2、其一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间 接融合的抗原分子，其中抗原分子选自IA-2和其一种或多种变异体、类似物、 衍生物或片段，其中所述IA-2第一抗原分子如(c)中所定义的被固定在固 体支持物上，所述IA-2第二抗原分子如(d)中所定义被标记物所标记；\n(b)将步骤(a)的IA-2抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相接 触的方法，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子IA-2发生反应 而形成一种或多种复合物，该复合物包括[所述IA-2第一抗原分子]-[分析物 自身抗体]-[所述IA-2第二抗原分子]；\n(c)所述(b)定义的复合物中的IA-2第一抗原分子在IA-2第一抗原 与待检体液样本接触之前或之中或之后被固定到固体支持物上的方法；\n(d)在IA-2第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后，为(b) 定义的复合物中的IA-2第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方 法；\n(e)检测是否存在(c)中所固定的(b)中所定义的复合物，以提供所 述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。\n本发明的优选实施例还包括用于筛选动物受试体体液样本中第一和第二 分析物自身抗体的试剂盒，该抗体能分别与GAD和IA-2，或它们的一种或 多种变异体、类似物、衍生物或片段反应，所述试剂盒包括：\n(a)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的GAD第一和第二抗原 分子，GAD抗原分子选自GAD65、GAD67、它们的一种或多种变异体、类似 物、衍生物或片段以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融 合的抗原分子，其中抗原分子选自GAD65、GAD67、IA-2和它们的一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段，其中，所述融合分子中至少一种抗原分 子包括GAD65、GAD67或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段， 其中所述GAD第一抗原分子如(d)中所定义的被固定在固体支持物上，所 述GAD第二抗原分子如(e)中所定义的被标记物所标记；\n(b)与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的IA-2第一和第二抗原 分子，所述抗原分子选自IA-2或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片 段以及融合分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子， 其中，抗原分子选自IA-2、GAD65、GAD67和它们的一种或多种变异体、类 似物、衍生物或片段，其中，所述融合分子中至少一种抗原分子包括IA-2 或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，其中所述IA-2第一抗原分 子如(d)中所定义的被固定在固体支持物上，所述IA-2第二抗原分子如(f) 中所定义的被标记物所标记；\n(c)将(a)和(b)提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相 接触，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子发生反应而形成一 种或多种复合物，该复合物包括[GAD第一抗原分子]-[分析物自身抗 体]-[GAD第二抗原分子]或[IA-2第一抗原分子]-[分析物自身抗体]-[IA-2第二 抗原分子]；\n(d)所述(c)定义的复合物中的GAD或IA-2第一抗原分子在GAD 或IA-2第一抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后，被固定到固体支持 物上的方法；\n(e)在GAD或IA-2第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后， 为所述(c)定义的复合物中的GAD或IA-2第二抗原分子提供直接或间接的 可检测标记物的方法；\n(f)检测是否存在(d)中所固定的(c)中所定义的复合物的方法，以 提供所述样本中是否存在分析物自身抗体的指示。\n本发明的试剂盒可以优选为第一和第二抗原分子包括一种或多种共同的 抗原分子。例如，第一和第二抗原分子可以包括GAD65或GAD67；或者都包 括IA-2。\n也可以优选，与所述体液样本中自身抗体反应的第一或第二抗原分子中 的一种包括选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素的抗原分子，而另一种抗原 分子则包括上述第一或第二抗原分子的一种或多种变异体、类似物、衍生物、 或片段。例如，与所述体液样本中自身抗体反应的第一或第二抗原分子中的 一种包括GAD65或GAD67，而另一种抗原分子则包括GAD65或GAD67的一 种或多种变异体、类似物、衍生物、或片段。再例如，与所述体液样本中自 身抗体反应的第一或第二抗原分子中的一种包括IA-2，而另一种抗原分子包 括IA-2的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段。\n本发明的再一实施例是第一和第二抗原分子都包括与所述体液样本中自 身抗体反应的同一抗原分子的可相同也可不同的变异体、类似物、衍生物或 片段。例如，第一和第二抗原分子都包括与所述体液样本中自身抗体反应的 GAD65或GAD67的可相同也可不同的变异体、类似物、衍生物或片段。再例 如，第一和第二抗原分子都包括与所述体液样本中自身抗体反应的IA-2的可 相同也可不同的变异体、类似物、衍生物或片段。可以理解为，第一和第二 抗原分子包括衍生于一同一抗原分子的变异体、类似物、衍生物或片段，这 些变异体、类似物、衍生物或片段可以相同或不同(例如，第一抗原分子的 变异体1和第二抗原分子的变异体2，其中，变异体1和2可以分别代表GAD65 或GAD67的不同变异体，或第一抗原分子的片段1和第二抗原分子的片段2， 其中，片段1和2可以分别代表GAD65或GAD67的不同片段，诸如，完全不 同或部分重叠的GAD65或GAD67的表位)。\n适宜的可检测标记物选自酶标记物、同位素标记物、化学发光标记物、 荧光标记物、颜料及类似物，典型的标记物选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物 酶、生物素或类似物，尤其包括生物素。这些可检测标记物(当与上述一种 或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，或这些物 质的一种或多种融合分子相结合)与一种或多种其标记的底物(诸如抗生物 素蛋白或抗生物素蛋白链菌素结合物，例如抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化 物酶结合物或类似结合物)发生反应，由此得到的结合物可以通过测试光密 度或类似方法而得到检测。\n可检测标记物可以直接与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异 体、类似物、衍生物或片段，或这些物质的一种或多种融合分子结合。可检 测标记物也可以间接与上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类 似物、衍生物或片段，或这些物质的一种或多种融合分子结合，尤其是可检 测标记物与一种或多种抗体或其它结合试剂相结合，所述抗体或试剂能够与 上述一种或多种抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段， 或所述物质的一种或多种融合分子相结合。\n本发明筛选自身抗体的试剂盒进一步包括直接监测本发明所提供的(i) 待检受试体体液样本中的自身抗体与(ii)上述一种或多种抗原分子或其一 种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，或所述物质的一种或多种融合分 子相互反应的方法，尤其是利用本领域熟知的非竞争性夹心测试法。\n根据本发明一个优选实施例，上述一种或多种第一抗原分子或其一种或 多种变异体、类似物、衍生物或片段，或这些物质的一种或多种融合分子被 固定在固体支持物上，上述一种或多种第二抗原分子或其一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段，或这些物质的一种或多种融合分子与可检测标记物 结合，其中优选的第二抗原分子存在于液相中，这是熟知的ELISA技术的常 规做法。\n本发明的一种优选试剂盒包括与所述体液样本中的分析物自身抗体反应 的一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段， 或所述物质的一种或多种融合分子，在与待检体液样本接触之前，被固定到 固体支持物上的方法。本发明适宜的试剂盒包括与所述体液样本中的分析物 自身抗体反应的被固定的一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、 类似物、衍生物或片段，或所述物质的一种或多种融合分子，在与所述体液 样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第二抗原分子或其一种或多种变 异体、类似物、衍生物或片段，或这些物质的一种或多种融合分子与体液样 本接触的同时或者随后，与体液样本接触的方法。尤其优选的接触方法是被 固定的与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种第一抗原分子 或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，或这些物质的一种或多种 融合分子在与待检体液样本接触而形成了中间复合物，其包括[抗原分子]-[分 析物自身抗体]，其中抗原分子被固定到固体支持物上，且该被固定的中间复 合物随后与液相中的与所述体液样本中的分析物自身抗体反应的一种或多种 第二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，或所述物质 的一种或多种融合分子接触，从而形成复合物，其包括[所述第一抗原分 子]-[分析物自身抗体]-[所述第二抗原分子]，该复合物通过第一抗原分子被固 定到固体支持物上。\n因此，本发明提供了一种筛选动物受试体体液样本中分析物自身抗体的 试剂盒，该抗体与一种或多种抗原分子反应，所述抗原分子选自胰腺胰岛细 胞抗原分子和胰岛素或它们的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段， 所述试剂盒包括：\n(a)一种或多种与体液样本中的分析物自身抗体发生反应的第一抗原 分子，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多 种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合分子，该融合分子包括两种或 多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、 胰岛素和所述一种或多种变异体、类似物、衍生物或其片段，其中，所述第 一抗原分子被固定在固体支持物上；\n(b)与体液样本中分析物自身抗体发生反应的一种或多种第二抗原分 子，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素、所述胰腺胰岛细胞 抗原分子或胰岛素的一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，以及融合 分子，该融合分子包括两种或多种直接或间接融合的抗原分子，其中抗原分 子选自胰腺胰岛细胞抗原分子、胰岛素和它们的一种或多种变异体、类似物、 衍生物或其片段，该第二抗原分子存在于液相中，并如(d)中所定义被标记 物所标记；\n(c)(a)和(b)所提供的抗原分子同时或相继与所述待检体液样本相 接触的方法，由此体液样本中的分析物自身抗体与所述抗原分子反应而形成 一种或多种被固定的复合物，该复合物包括[所述第一抗原分子]-[分析物自身 抗体]-[所述第二抗原分子]，其中所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原 分子包括一种共同的抗原分子或是从该共同抗原分子衍生而得，或者其中与 分析物自身抗体结合的所述一种或多种复合物中的第一和第二抗原分子的结 合区域存在于一种共同抗原分子中或由该共同抗原分子衍生而得，该被固定 的复合物是通过复合物中的第一抗原分子被固定在固体支撑上的；\n(d)在第二抗原与待检体液样本接触之前或之中或之后，为所述(c) 定义的复合物中的第二抗原分子提供直接或间接的可检测标记物的方法；\n(f)检测是否存在(c)中所定义的复合物，以提供所述样本中是否存 在分析物自身抗体的指示。\n本发明的试剂盒中的其它接触方法还可以是，例如在上述接触步骤之前 并不先提供固定一种或多种第一抗原分子或其变异体、类似物、衍生物、或 片段，或这些物质的一种或多种融合分子的方法，而是先提供固体支持物与 用于结合一种或多种第一抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物 或片段，或一种或多种这些物质的融合分子的结合剂相接触的方法，对于这 种试剂盒，其还包括随后将处理后的固体支持物与所述一种或多种第一和第 二抗原分子或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，或一种或多种 这些物质的融合分子以及待检体液样本接触的方法。\n关于本发明的试剂盒采用的固体支持物和条件，与已知免疫测试技术中 所惯用的固体支持物和条件并没有根本的区别。本发明所采用的固体支持物 包括已知ELISA技术中常用的ELISA板，或其它适宜支持物，诸如管、颗 粒、磁珠、硝酸纤维或类似物。\n本发明所提供的与选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素的一种或多种抗 原分子发生反应的分析物自身抗体的检测方法，或利用本发明的试剂盒，可 以用来诊断与该分析物自身抗体有关的一些疾病。尤其是，本发明能够用来 筛选动物受试体的体液样本，所述动物疑似患有或已经患有下述疾病：1型 糖尿病和/或僵人综合征、2型糖尿病、一种或多种自身免疫性甲状腺疾病、 乳糜泄、一种或多种结缔组织疾病、肾上腺自身免疫性疾病、或两种或多种 不同自身免疫性疾病并存，本发明进一步提供了诊断动物受试体中上述任一 疾病的方法。\n从上述内容可以获知本发明提供了用于检测动物受试体的体液样本中的 分析物自身抗体的测试方法和检测用试剂盒，该自身抗体与一种或多种抗原 分子发生反应，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素，并能够 提供患有上述疾病或该疾病征兆的指示。通过检测体液样本中的这种自身抗 体(或至少样本中该自身抗体的水平)而得到受试体很有可能患有所述疾病 的指示，从而使这些疾病或其初始征兆能够得到诊断。\n本发明进一步提供一种诊断动物受试体(尤其是人类)中与所述自身抗 体有关的疾病或该疾病初始征兆的方法，所述自身抗体与一种或多种抗原分 子反应，该抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素，该方法包括检测 与一种或多种抗原分子反应的自身抗体，所述抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗 原分子和胰岛素，并能够提供上述受试体体液样本中具有所述疾病或疾病初 始征兆的指示，据此，检测出的自身抗体能够提供是否患有所述疾病或该疾 病初始征兆的指示。\n本发明还进一步提供了一种延迟或预防动物受试体(尤其是人类)中与 所述自身抗体有关的疾病或该疾病初始征兆的方法，或治疗或治愈患有这种 疾病的动物(尤其是人类)患者的方法，所述自身抗体与一种或多种抗原分 子反应，该抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素，该方法包括先检 测所述受试体体液样本中的所述自身抗体，并给予所述疾病或疾病初始征兆 的指示，因此得以诊断受试体是否患有所述疾病或具有该疾病的初始征兆， 并给予至少受试体一种治疗有效量的治疗剂，该治疗剂的作用是延迟疾病初 始征兆的出现、排除、预防和/或治疗这些疾病。\n本发明进一步提供了一种评定延迟或预防动物受试体(尤其是人类)中 与所述自身抗体有关的疾病出现的有效性的方法，所述自身抗体与一种或多 种抗原分子反应，该抗原分子选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素，或评定 治疗或治愈动物受试体(尤其是人类)中与所述自身抗体有关的疾病的有效 性的方法，所述自身抗体与一种或多种抗原分子反应，该抗原分子选自胰腺 胰岛细胞抗原分子和胰岛素，该方法包括至少给予受试体一种治疗有效量的 治疗剂，该治疗剂的作用是延迟疾病出现、排除、预防和/或治疗这种疾病， 并检测受试体体液样本中的所述自身抗体，并给予患有疾病或疾病出现的指 示，因此提供了治疗、延迟或预防这种疾病出现的有效性的指示。\n本发明进一步提供了一种如上所述的试剂盒以及至少一种治疗有效量的 治疗剂，该治疗剂的作用是治疗与一种或多种抗原分子反应的自身抗体有关 的疾病，所述抗原选自胰腺胰岛细胞抗原分子和胰岛素。\n本发明中用于筛选的体液样本一般地包括血样或其它液体血组成，如血 清样或血浆样，而样本也可以是其它的生物液体，诸如唾液或尿液或被溶解 的组织提取液。\n本发明所使用的术语“抗原”或“抗原分子”表示与本发明所述抗体发生反 应的化合物，且该抗原能够与抗体结合而形成特定的抗体-抗原复合物。抗原 或抗原分子可以是天然的或合成的，其修饰物优选为不损害它与特异性抗体 相结合的性质。\n如上所述，本发明还使用了抗原分子的“变异体”、“类似物”、“衍生物” 和“片段”，术语“变异体”、“类似物”、“衍生物”和“片段”表示主要保留了天然 抗原分子相同生物功能或活性，尤其是其与特异性抗体结合性质的多肽。本 发明所述变异体、类似物、衍生物和片段以及片段的变异体、类似物、衍生 物具有一个一级结构的氨基酸，其中天然抗原分子中的几个(如5至10、1 至5或1至3)氨基酸残基被取代、删除或添加或以这些方式的任意组合而 进行修饰。尤其优选的是沉默取代、添加和删除，这样的修饰不改变或者不 显著改变天然抗原分子的生物活性或功能。保守型取代是下面大篇幅所述的 优选取代方式。\n更具体而言，本发明适宜的抗原分子的变异体、类似物或衍生物可以是 其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨 基酸残基)所取代的抗原分子，或其中一个或多个氨基酸残基包括取代基或 类似物的抗原分子。\n最典型的变异体、类似物或衍生物是通过保守性氨基酸取代而与参照物 (如本发明所述的天然抗原分子)不同的分子。这种取代是用具有类似性质 的其它氨基酸取代多肽中的特定氨基酸。典型的保守型取代是脂肪氨基酸A、 V、L和I、羟基残基S和T、酸性残基D和E、氨基残基N和Q、碱性残基 K和R、芳香残基F和Y之间的相互替代。\n更具体而言，本发明所用术语“片段”表示氨基酸序列与天然氨基酸中的 部分而不是全部氨基酸相同的多肽，其变异体或衍生物和该片段可以是“独 立”的，即不是部分存在或被融合至其它氨基酸或多肽中，或可以存在于更大 的多肽中，由其自身构成一部分或一区域。本发明优选的片段可以是一个或 多个所述抗原分子的表位，且该表位片段可以“独立”形式使用或存在于更大 多肽如骨架多肽中，其中这些片段自身构成一部分或一区域。与使用全长抗 原相比，这些表位片段以分离或独立形式使用更能增强稳定性和/或提高特异 性。\n本发明将通过下述实施例进一步给予举例说明，但并不意于限制本发明 的保护范围。\n实施例\nGAD包被的ELISA板的制备\n由SDS-PAGE测定的纯度＞95％的人重组GAD65(M Powell，L Prentice，T Asawa，R Kato，J Sawicka，H Tanaka，V Petersen，A Munkley，S Morgan，B Rees Smith，JFurmaniak.Clinica Chimica Acta，1996256：175-188)在包被缓冲液中被 稀释至150μg/L，该缓冲液包括1.59g/L Na2CO3、2.94g/L NaHCO3、0.1g/L NaN3、0.01g/L酚红和5mg/L BSA(pH 9.2)，将150μL的稀释溶液加入96孔 ELISA板(商品名为Nunc F8 MaxiSorp)中。然后在4℃下，包被该板过夜，吸 出孔中物质，用高盐缓冲液(HSB)清洗三次，该缓冲液包括10g/L BSA，1g/L NaN3，11.69g/L NaCl，18.17g/L Tris，和10mL/L聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸 酯(商品名为Tween 20(pH 8.3))。将后包被缓冲液加入到孔中(每孔250μL)， 该缓冲液包括3g/L BSA、9g/LNaCl、20g/L蔗糖和0.2g/L NaN3，室温下培养 30分钟。然后吸出后包被缓冲液，真空干燥，4℃下，在用硅胶的密封袋中 储存备用。\n用生物素标记GAD65\nPBS(1.15g/L Na2HPO4，0.2g/L KH2PO4，0.2g/L KCl，8g/L NaCI)中的人重 组GAD65与商用生物素化试剂(sulfo-NHS-LC-LC-生物素，商品名为EZ-Link， Perbio Science制造)反应，摩尔比为1份的GAD65比24份的生物化试剂，室 温下反应30分钟。4℃下对PBS透析使反应停止，在-70℃下，将得到的物 质分为小等份进行储藏。\n将利用上述技术获得的生物素标记GAD65(GAD65-Bi)在20g/L BSA中被 稀释至3mg/L，通过0.22μm过滤器过滤，以每小瓶1mL等分，冷冻干燥， 然后在-20℃下储藏。使用时，每小瓶加入7.5mL的HSB，使GAD65-Bi的浓 度为400μg/L。\n制备GAD65自身抗体测试的校准品\n将GAD65的三种人单克隆抗体的IgG制备液(M J Powell，N Hayakawa，M Masuda，J Sanders，M Evans，LDKE Premawardhana，J Furmaniak，B Rees Smith. Isolation and characterization of three human monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase(GAD65)from a patient without clinical diabetes. Diabetes/Metabolism Research and Reviews，2001 17(S1)：021)在HSB中稀释， 使450nm时的光密度为4.0至0.1。这些单克隆抗体是已知的1型糖尿病患 者血清中GAD65的代表性自身抗体(M J Powell，N Hayakawa，M Masuda，J Sanders，M Evans，LDKE Premawardhana，JFurmaniak，B Rees Smith.Isolation and characterization of three human monoclonal antibodies to glutamic acid decarboxylase(GAD65)from a patient without clinical diabetes. Diabetes/Metabolism Research and Reviews，2001 17(S1)：021)。\nGAD65自身抗体检测\n根据上述技术制备的包被有GAD65的板置于室温中，将25μL待测供体 的未稀释血清样本或校准品加到板上的孔中，一式两份，在室温下培养1个 小时并以200rpm进行振荡。然后吸出样品，用缓冲液(8.7g/LNaCl，2.4g/L Tris， 0.5mL/L Tween 20，pH 7.6)清洗孔三次，随后加入100μL的GAD65-Bi，该 GAD65-Bi根据上述方法在HSB(400μg/L)中稀释制得，将板在室温下培养1 个小时，同时200rpm振荡。吸出孔中的培养物，用缓冲液(8.7g/L NaCl，2.4g/L Tris，0.5mL/L Tween20，pH 7.6)清洗孔三次。然后，加入100μL稀释浓度为 1μg/mL的抗生物素蛋白链菌素辣根过氧化物酶结合物，在室温下培养20分 钟，200rpm振荡。吸出培养物后，用缓冲液(8.7g/L NaCl，2.4g/L Tris，0.5mL/L Tween20，pH 7.6)清洗孔三次，用水洗一次。然后加入100μL四甲基联苯胺 (TMB)，在暗处培养20分钟，随后加入50μL的0.5mol/L H2SO4。然后在 ELISA板读数器中测定450nm时孔的吸收度或者在样本450nm的OD＞4.0 时，测量405nm时的吸收度。\n将上述步骤应用到IA-2自身抗体以及GAD65与IA-2自身抗体的联合检 测中(尤其是涉及制备生物素标记的IA-2，IA-2-Bi)。用于绘制校准曲线的 IA-2自身抗体的参照制备液是由多克隆IA-2自身抗体制备得到。\n结果\n450nm时GAD65的OD值校准曲线如图1a所示。该曲线的测定对象包 括7个任意分配的GAD65自身抗体校准品，ELISA单位从0ELISA单位/mL 至512ELISA单位/mL。对于校准品0，1.0，2.0，8.0，32，128和512，450nm时 的OD值分别为0.033，0.168，0.310，1.020，3.187，＞4.0和＞4.0。图1b显示了 校准品1.0，2.0，8.0，32，128和512，405nm时的OD值分别为0.008，0.048， 0.090，0.290，0.929，1.385和1.620。随后，450nm时的OD值＞4.0的样本可 以在如图1b所示的OD405nm的校准曲线内测量。对于n＝25的健康献血者 血清而言，450nm时的平均±SD吸收度为0.04±0.015。\n本发明的GAD65自身抗体的结果如表1和2所示。表1列出了n＝18的 1型糖尿病患者和n＝14的甲状腺机能亢进患者(Graves′disease)血清中的 GAD65自身抗体结果。当采用ELISA技术，所有18例糖尿病患者血清的 GAD65自身抗体检测都为阳性(水平＞1.0ELISA单位/mL)，然而采用放射免 疫测试法(RIA)时，只有13名患者为阳性。RIA检测中显阴性的5例样本在 ELISA检测中显示了低水平的GAD65自身抗体，其450nm时的OD值在0.117 至0.980之间(1.3至10.7ELISA单位/mL)。RIA检测中的低水平样本(1.0至 7.5RIA单位/mL)，ELISA检测时450nm的OD值在0.290和1.060之间(12.0 至105.8ELISA单位/mL)。RIA检测的较高水平的GAD65自身抗体(26.8至 118.8RIA单位/mL)，利用ELISA技术检测的450nm时的OD值都非常高，＞ 4.0(＞128ELISA单位/mL)，因此，样本中的GAD65自身抗体水平和校准曲 线的关系在测量405nm的吸收度后再计算。在进行ELISA测试之前，将待 测血清与未标记的GAD65(最终浓度为0.0005至0.01ug/mL)进行预培养会导 致450nm时的OD值产生剂量依赖性的降低。这些实验确证了本发明的 ELISA技术检测中GAD65自身抗体的特异性。\n对于n＝14的甲状腺机能亢进患者，所有样本的450nm时的OD值都低 于0.05(＜1ELISA单位/mL，采用本发明的ELISA技术检测)；用RIA检测 GAD65自身抗体时，所有样本都显阴性(＜1RIA单位/mL)。\nELISA和RIA检测GAD65自身抗体的最低检测限值如表2所示。RIA 检测时，胰岛细胞自身抗体的WHO参照制备液[NIBSC 97/550]的稀释度为 250至31.25WHO单位/mL，可检测到GAD65水平。而利用本发明的ELISA 技术时，可检测到GAD65自身抗体的WHO标准稀释浓度为250至3.91WHO 单位/mL。血清样本Z(来自具高水平GAD65自身抗体的患者)的稀释特征 的实施例如表2所示。RIA可检测到GAD65自身抗体的样本Z的稀释度范围 为1/8至1/8192。ELISA技术检测到GAD65自身抗体的样本Z的稀释度范围 为1/8至1/32768。通过对WHO标准品和患者血清的终点稀释度分析，显示 采用ELISA技术可检测到自身抗体的稀释度高于RIA检测的4至8倍。\n采用ELISA技术检测的IA-2自身抗体的结果实例如表3所示。450nm 时IA-2自身抗体OD校准值(0，1.0，2.0，4.0，8.0，16，32，64，128ELISA单位 /mL)为0.054至＞4.0，OD405nm值为0.008至1.874。在RIA测试中，IA-2 自身抗体水平为2.0至38.9RIA单位/mL的n＝10的1型糖尿病患者的血清 在ELISA测试中都显阳性。这些样本450nm的OD值在0.209至＞4.0(2.6至 ＞32ELISA单位/mL)之间。在250WHO单位/mL和125WHO单位/mL的 IA-2自身抗体RIA中，可检测到WHO标准品，而利用ELISA技术可检测 到该WHO标准品的进一步稀释液(62.5WHO单位/mL和31.25WHO单位 /mL)中的抗体。n＝10的健康献血者血清(RIA检测IA-2自身抗体时，都显 阴性)450nm的OD值为0.030和0.071(＜1ELISA单位/mL)之间。\n表4和5显示了联合检测GAD65自身抗体和IA-2自身抗体的结果。表4 显示了利用ELISA技术联合检测GAD65自身抗体和IA-2自身抗体的结果， 检测中采用了IA-2-Bi或GAD65-Bi或IA-2-Bi+GAD65-Bi。在IA-2自身抗体 校准品中，使用GAD65-Bi时，ELISA检测中没有任何吸收信号，而当使用 IA-2-Bi或IA-2-Bi+GAD65-Bi时，观察到450nm的OD值的剂量依赖性增加。 单独的IA-2-Bi与IA-2-Bi+GAD65-Bi的450nm OD值基本相同。在检测中使 用IA-2-Bi时，GAD65自身抗体校准品中没有检测到任何吸收信号，而使用 GAD65-Bi和IA-2-Bi+GAD65-Bi时，观察到450nm的OD值剂量依赖性反应。 比较单独的GAD65-Bi与IA-2-Bi+GAD65-Bi+GAD65-Bi 450nm时的OD值。 检测血清样本Z的不同稀释浓度中的两种抗体，显示了与单独检测IA-2自身 抗体或GAD65自身抗体的结果相吻合。来自健康献血者血清或健康献血者血 清池的血清的450nmOD值非常低，为从0.006至0.046，与使用的生物素标 记抗原种类无关。该实验显示了联合检测IA-2自身抗体和GAD65自身抗体 时，结果是确定的，说明测试样本中存在两种自身抗体。\n表5显示了联合检测IA-2自身抗体和GAD65自身抗体的更为详细的结 果。测定了1型糖尿病患者的血清。利用RIA测定了这些血清的IA-2自身 抗体和GAD65自身抗体；血清1-3中IA-2自身抗体和GAD65自身抗体的检测 都为阳性，血清4-6中GAD65自身抗体检测为阴性，而IA-2自身抗体为阳性， 血清7-9中GAD65自身抗体检测为阳性，IA-2自身抗体为阴性，血清10-12 中IA-2自身抗体和GAD65自身抗体的检测都为阴性。如表5所示，在联合 检测中，血清样本中检测到一种或另一种或两种自身抗体。RIA检测的血清 6中的IA-2自身抗体处于边界水平(0.9RIA单位/mL)，联合ELISA技术检测 中的吸收信号明显为阳性。\n表6、7和8分别显示ELISA检测不同患者亚组中GAD65自身抗体、IA-2 自身抗体以及GAD65和IA-2自身抗体混合结果的其它实例。\n结论\n上述结果显示了本发明的非放射技术可以用来检测待测样本中的GAD65 自身抗体。非放射技术也可以用来分别或同时地检测IA-2自身抗体，其测试 结果确定，且与已建立的放射参照方法结果吻合(M Powell，L Prentice，T Asawa，R Kato，J Sawicka，H Tanaka，V Petersen，A Munkley，S Morgan，B Rees Smith，JFurmaniak.Clinica Chimica Acta，1996256：175-188；and M Masuda，M Powell，S Chen，C Beer，P Fichna，B Rees Smith，JFurmaniak.Autoantibodies toIA-2 in insulin-dependent diabetes mellitus.Measurements with a new immunoprecipitation assay.Clinica Chimica Acta，2000291：53-66)。而且，利用 本发明的非放射技术检测GAD65自身抗体和IA-2自身抗体的灵敏度至少与 RIA检测相同(表1，2和3)。\n本发明技术提供了非放射测试法来检测GAD65自身抗体或IA-2自身抗 体，该方法灵敏度高，可方便地用于诊断和筛选中。本发明对于GAD65自身 抗体和IA-2自身抗体的联合检测法在多人群筛选中尤其有利。\n表1\n本发明ELISA检测患者血清中的GAD65自身抗体和放射免疫检测法 (RIA)基于125I-标记的GAD65检测GAD65自身抗体\n\n\n注：高于1RIA单位/mL的GAD Ab水平为RIA测试阳性。1型DM＝1 型糖尿病。\n表2\nELISA和RIA测试GAD65Ab的灵敏度比较\n  样本   ELISA   ELISA单位/ml   OD405nm   OD405nm   RIA RIA单位/ml   WHO标准   品(97/550)   250   ＞128   ＞4.0   1.234   6.4   125   45.5   2.670   0.742   3.6   62.5   17.4   1.557   0.422   2.5   31.25   10.0   0.894   0.225   1.1   15.63   4.4   0.431   0.095   ＜1.0   7.81   2.2   0.202   0.023   ＜1.0   3.91   1.2   0.100   0.00   ＜1.0   1.95   ＜1.0   0.058   0.00   ＜1.0   0.98   ＜1.0   0.031   0.00   ＜1.0   样本Z   1/8   ＞128   ＞4.0   2.048   91   1/32   ＞128   ＞4.0   1.868   76   1/128   ＞128   ＞4.0   1.769   38   1/512   ＞128   ＞4.0   1.591   13   1/1024   90   3.714   1.120   5.6   1/2048   29.4   2.542   3.1   1/4096   12.0   1.375   1.4   1/8192   6.9   0.784   1.0   1/16384   2.8   0.385   ＜1.0   1/32768   1.6   0.210   ＜1.0   1/65536   ＜1.0   0.132   ＜1.0   1/131072   ＜1.0   0.092   ＜1.0   1/262144   ＜1.0   0.055   ＜1.0\n注：高于1RIA单位/mL的GADAb水平为RIA测试阳性。*WHO单位/mL。\n表3\n用ELISA和基于125I-标记的IA-2/ICA512的RIA方法检测IA-2/ICA512自身 抗体\n  样本   ELISA   ELISA单位/ml   OD405nm   OD405nm   RIA   RIA单位/ml   IA-2Ab校准   品   0   0.054   0.008   1   0.114   0.021   2   0.183   0.040   4   0.313   0.073   8   0.614   0.166   16   1.219   0.340   32   2.506   0.719   64   ＞4   1.371   128   ＞4   1.874   1型DM血清   样本   1   ＞32   ＞4   1.420   14.8   2   ＞32   ＞4   1.594   38.9   3   11.2   0.859   0.228   2.8   4   ＞32   ＞4   2.096   22.7   5   ＞32   ＞4   2.348   33.9   6   6.5   0.516   0.140   6.3   7   ＞32   ＞4   2.354   15.8   8   4.1   0.265   0.067   2.9   9   2.6   0.209   0.055   2.3   10   8.4   0.664   0.179   2.0   WHO标准品   (97/550)*\n  250   18.8   1.503  2.0   125   9.2   0.721  1.2   62.5   4.0   0.337  ＜1.0   31.25   2.0   0.191  ＜1.0   15.63   ＜1.0   0.116  ＜1.0   7.81   ＜1.0   0.093  ＜1.0   健康献血者血   液   1   ＜1.0   0.030  ＜1.0   2   ＜1.0   0.036  ＜1.0   3   ＜1.0   0.043  ＜1.0   4   ＜1.0   0.045  ＜1.0   5   ＜1.0   0.070  ＜1.0   6   ＜1.0   0.045  ＜1.0   7   ＜1.0   0.063  ＜1.0   8   ＜1.0   0.037  ＜1.0   9   ＜1.0   0.071  ＜1.0   10   ＜1.0   0.069  ＜1.0\n注：高于1RIA单位/mL的IA-2/ICA512Ab水平为RIA测试阳性。1 型DM＝1型糖尿病。*WHO单位/mL。\n表4\nELISA检测GAD65Ab和IA-2/ICA512Ab混合物\n  样本   ELISA单位/mL   IA-2-Bi   OD450nm   GAD65-Bi   OD450nm   GAD65-Bi+IA-2-Bi   OD450nm   IA-2Ab校准品   8   1.314   0.022   1.252   16   2.730   0.033   2.574   32   3.888   0.031   3.824   GAD65Ab校准   品   4   0.053   0.460   0.458   16   0.045   1.518   1.400   32   0.043   2.033   2.160   血清样本Z   稀释1/2   3.069   ＞4   ＞4   1/4   2.328   ＞4   ＞4   1/8   0.905   ＞4   ＞4   1/16   0.401   3.936   3.875   1/32   0.197   3.379   3.626   1/64   0.143   2.209   2.512   1/128   0.069   1.718   1.571   健康献血者血   清   0.019   0.006   0.023   健康献血者血   清池   0.022   0.015   0.046\n表5\nELISA检测GAD65Ab和IA-2/ICA512Ab混合物\n  样本   ELISA单位/mL   OD450nm   OD450nm   GAD65Ab RIA   RIA单位/mL   IA-2/ICA512   Ab RIA   RIA单位/mL   GAD65Ab校准   品   0   0.080   0.028   2   0.231   0.070   8   0.737   0.219   16   1.476   0.436   32   2.117   0.613   64   2.648   0.755   128   3.607   1.083   IA-2Ab校准品   0   0.065   0.025   2   0.205   0.054   4   0.308   0.081   8   0.552   0.154   16   1.116   0.327   32   2.031   0.590   64   3.596   1.079   128   ＞4   1.777   1型DM血清样   本   1   ＞4   1.646   10.8   14.8   2   ＞4   1.964   50.2   39.0   3   1.640   0.481   3.1   2.8   4   ＞4   1.927   阴性   22.7   5   ＞4   2.428   阴性   39.9\n  6   0.298   0.100   阴性   0.9   7   3.594   1.063   26.8   阴性   8   ＞4   2.092   253.0   阴性   9   1.874   0.554   2.2   阴性   10   0.068   0.040   阴性   阴性   11   0.074   0.029   阴性   阴性   12   0.066   0.021   阴性   阴性   健康献血者血   清池   0.073   0.020   阴性   阴性\n注：高于1RIA单位/mL的GAD65Ab水平为RIA测试阳性。高于1RIA 单位/mL的IA-2/ICA512Ab水平为RIA测试阳性。1型DM＝1型糖尿病。\n表6\nELISA或放射免疫测试法(RIA)根据125I-标记的GAD65检测不同患者组的 GAD65Ab\n  ELISA   显阳性数(％)   (5单位/mL或更高＝阳性)   RIA   显阳性数(％)  (25单位/mL或更高＝阳性)   健康献血者血液   n＝300   2/300(0.7％)1   3/300(1％)2   1型DM   n＝39   39/39(100％)3   32/39(82％)4   2型DM   n＝62   1/62(1.6％)5   0/62(0％)   甲状腺机能亢进   n＝88   2/88(2.3％)6   3/88(3.4％)7   桥本甲状腺炎   n＝11   1/11(9％)8   0/11   类风湿关节炎   n＝10   0/10   0/10   系统性红斑狼疮   n＝10   1/10(10％)9   1/10(10％)9\n1ELISA检测GAD65Ab显阳性的样品，数值为11单位/mL和＞500单位 /mL(所有单位/mL都是WHO 97/550)。吸收实验表明存在特异性GAD65Ab。 用RIA分别检测相同样本，显示阴性以及2500单位/mL。\n2RIA检测GAD65Ab显阳性的样本，数值为33、100、2500单位/mL。 用ELISA分别检测相同样本，显示阴性、阴性以及＞500单位/mL。\n3数值范围：5.2至＞500单位/mL。\n4数值范围：阴性至3800单位/mL。\n5ELISA检测GAD65Ab显阳性的样品，数值为40单位/mL。用RIA检 测相同样本，显阴性。\n6ELISA检测GAD65Ab显阳性的样品，数值为306和500单位/mL。用 RIA分别检测相同样本，数值为354和1700单位/mL。\n7RIA检测GAD65Ab显阳性的样品，数值为78、354和1700单位/mL。 用ELISA分别检测相同样本，分别为阴性、306和500单位/mL。\n8ELISA检测GAD65Ab显阳性的样品数值为24单位/mL。用RIA检测 该样本显阴性。\n9ELISA和RIA检测GAD65Ab显阳性的相同样品，数值分别为15单位 /mL和30单位/mL。\n表7\nELISA或基于125I-标记IA-2的放射免疫测试法(RIA)测定不同患者组 的IA-2Ab\n  ELISA   显阳性数(％)  (30单位/mL或更高＝阳性)   RIA   显阳性数(％)   (125单位/mL或更高＝阳性)   健康献血者血液   n＝210   2/210(1％)1   2/210(1％)2   1型DM   n＝30   12/30(40％)3   12/30(40％)4   2型DM   n＝62   1/62(1.6％)5   0/62   甲状腺机能亢进   n＝102   0/102   0/102   类风湿关节炎   n＝10   0/10   0/10   系统性红斑狼疮   n＝10   1/10   1/10\n1ELISA检测IA-2显阳性的样品，数值为44单位/mL和179单位/mL (所有单位/mL都是WHO 97/550)。吸收实验表明样本中存在特异性IA-2 Ab。用RIA检测相同样本，显阴性。\n2RIA检测IA-2Ab显阳性的样本，数值为150和288单位/mL。ELISA 检测相同样本，显阴性。\n3数值范围：132至＞4000单位/mL。\n4数值范围：178至4508单位/mL。\n5IA-2Ab显阳性的样品为101单位/mL。用RIA检测相同样本，显阴性。\n表8\n不同患者组中的GAD65Ab ELISA、IA-2Ab ELISA和GAD65Ab+IA-2 Ab ELISA的检测结果\n\n1ELISA检测GAD65Ab显阳性的样品，数值范围为7.3至＞500单位/mL (单位/mL为WHO 97/550)。\n2ELISA检测IA-2显阳性的样品，数值范围为34至3613单位/mL和179 单位/mL(单位/mL为WHO 97/550)。\n3所有组合的ELISA检测结果按照如下计算表示：\n\n数值为2.0或更高为阳性\n18例血清对于GAD65Ab的检测为阳性，对于IA-2Ab的检测为阴性； 所有18例血清在ELISA联合检测中为阳性。\n4例血清对于GAD65Ab的检测为阳性，对于IA-2Ab的检测为阴性；所 有4例血清在ELISA联合检测中为阳性。\n10例血清对于GAD65Ab和IA-2Ab的检测都为阳性；所有10例血清在 ELISA联合检测中为阳性。\n1例血清对于GAD65Ab和IA-2Ab的检测都为阴性，但在ELISA联合检 测中为阳性。\n2例血清在所有3种检测中都显阴性。\n4在一个阳性样本中，GAD65Ab的检测水平为10单位/mL，而对于IA-2 Ab的检测显阴性。\n5在一个阳性样本中，对于GAD65Ab的检测显阴性，而IA-2Ab的检测 水平为76单位/mL。\n6阳性样本与4和5中的样本相同(给定值分别为7.8和4.8)。\nELISA检测不同患者组中GAD65Ab、IA-2Ab和GAD65Ab+IA-2Ab的 结果。\n7在两个阳性样本中，GAD65Ab水平为9和＞500单位/mL，而对于IA-2 Ab的检测显阴性。\n8阳性样本与7中的样本相同。这些样本的给定值分别为3.6和55.0。\n9GAD65Ab水平为15单位/mL，而IA-2Ab的检测显阴性。\n10阳性样本与9中的样本相同。给定值为6.0。