一种用于DNA检测的噻吩衍生物及其制备方法

1.一种用于DNA检测的噻吩衍生物，具有式（Ⅰ）所示结构：
其中，n=8的整数。
2.权利要求1所述的用于DNA检测的噻吩衍生物的制备方法，其特征在于合成路线如下：
其中，n=8。
3.根据权利要求2所述的用于DNA检测的噻吩衍生物的制备方法，其特征在于将n=8的式（Ⅱ）化合物溶于二氯甲烷中，将温度降至0℃，取二碳酸二叔丁酯溶于氯仿并缓慢的滴加到上述的溶液当中，搅拌反应2～4小时，之后反应溶液逐渐升至23～28℃，继续反应
8～12小时得到n=8的式（Ⅳ）化合物；其中所述的式（Ⅱ）化合物与所述的二碳酸二叔丁酯的摩尔量之比为2～5:1。
4.根据权利要求2所述的用于DNA检测的噻吩衍生物的制备方法，其特征在于将3-噻吩乙酸溶于二氯甲烷中，取N-羟基琥珀酰亚胺在23～28℃的条件下加入到上述的溶液中，搅拌，待反应进行15～30分钟后，进行冰盐浴，当上述溶液的温度降到-18～-20℃时，直接加入DDC，搅拌，逐渐恢复到23～28℃并反应20～24小时得到式（Ⅴ）化合物；其中所述的3-噻吩乙酸与所述的N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.5～1.5:1，所述的DDC的加入量为所述的3-噻吩乙酸摩尔量的1/5～1/6。
5.根据权利要求2、3或4所述的用于DNA检测的噻吩衍生物的制备方法，其特征在于取式（Ⅳ）化合物溶于甲醇中，加入三乙胺；取式（Ⅴ）化合物溶解在CH2Cl2中，当温度降至-28～-30℃时，将式（Ⅴ）化合物在25～40分钟内滴加到上述式（Ⅳ）化合物的甲醇溶液中，搅拌，升温至23～28℃，反应20～24小时得到式（Ⅵ）化合物,其中所述的式（Ⅳ）化合物与所述的式（Ⅴ）化合物的摩尔量之比为0.5～1.5:1。
6.根据权利要求5所述的用于DNA检测的噻吩衍生物的制备方法，其特征在于取式（Ⅵ）化合物溶于CH2Cl2，加入三氟乙酸23～28℃搅拌反应6小时，除去过量的三氟乙酸，得到黄色粘稠的液体，然后加入9-氯吖啶和苯酚，将混合溶液加热到103～110℃，在氮气保护下反应1.5～2.5小时，反应结束后冷却至23～28℃，加入乙醚，搅拌1小时，把乙醚从黑色油状物中倾倒出来，再加入乙醚，搅拌2天后得到的黄色固体，将该黄色固体溶于1M NaOH溶液中,用CH2Cl2进行萃取，得到暗黄色油状物即为式（Ⅰ）化合物；其中所述的式（Ⅵ）化合物与所述的三氟乙酸的摩尔比为1：8～15，所述的9-氯吖啶与所述的三氟乙酸的摩尔量之比为5～6:1，所述的苯酚的加入量为所述的9-氯吖啶质量的1.8～2倍。

一种用于DNA检测的噻吩衍生物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于化学合成领域，涉及一种用于DNA检测的噻吩衍生物及其制备方法。
背景技术
[0002] 近年来，科学工作者们设计了很多生物传感体系进行DNA、酶的检测。2002年，Leclerc研究组合成了水溶性聚噻吩衍生物，并应用它检测DNA；Bazan研究小组设计合成了一种新的苯并噻唑掺杂的阳离子聚芴，利用它来测定单链DNA与双链DNA的浓度；我们实验室近几年也合成了一系列的阳离子聚芴衍生物，聚噻吩衍生物，并利用它们检测DNA、酶、蛋白质、金属离子等。这些生物化学传感体系的共同特点是，几乎主要利用底物与聚合物之间的静电相互作用力而与聚合物之间形成了复合物。但是，应用静电相互作用力检测DNA有一个缺点，容易受到溶液当中其它带有电荷物质的干扰。到目前为止，利用DNA嵌入剂作为主要作用力使聚合物与DNA之间形成复合物报道还很少。本发明我们设计合成了一系列侧链上带有吖啶基团的噻吩衍生物。
发明内容
[0003] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于DNA检测的噻吩衍生物。
[0004] 本发明的另一目的是提供该化合物的制备方法。
[0005] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0006] 一种用于DNA检测的噻吩衍生物，具有式(I)所示结构：
[0007]
[0008] 其中，n＝2～10的整数，优选n＝2，4，6，8，10。
[0009] 所述的用于DNA检测的噻吩衍生物的制备方法，其合成路线如下：
[0010]
[0011] 其中，n＝2，4，6，8；
[0012] 其中，将乙二胺和三乙胺溶于氯仿，将温度降至0℃，将二碳酸二叔丁酯溶于氯仿并滴加到上述的溶液当中，搅拌反应2～4小时，之后反应溶液升至23～28℃，继续反应
8～12小时得到n＝1的式(IV)化合物；其中所述的乙二胺与所述的二碳酸二叔丁酯的摩尔量之比为8～15∶1。
[0013] 将n＝4，6或8的式(II)化合物溶于二氯甲烷中，将温度降至0℃，取二碳酸二叔丁酯溶于氯仿并缓慢的滴加到上述的溶液当中，搅拌反应2～4小时，之后反应溶液逐渐升至23～28℃，继续反应8～12小时得到n＝4，6或8的式(IV)化合物；其中所述的式(II)化合物与所述的二碳酸二叔丁酯的摩尔量之比为2～5∶1。
[0014] 将3-噻吩乙酸溶于二氯甲烷中，取N-羟基琥珀酰亚胺在23～28℃的条件下加入到上述的溶液中，搅拌，待反应进行15～30分钟后，进行冰盐浴，当上述溶液的温度降到-18～-20℃时，直接加入DDC，搅拌，逐渐恢复到23～28℃并反应20～24小时得到式(V)化合物；其中所述的3-噻吩乙酸与所述的N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.5～
1.5∶1，所述的DDC的加入量为所述的3-噻吩乙酸摩尔量的1/5～1/6。
[0015] 取式(IV)化合物溶于甲醇中，加入三乙胺；取式(V)化合物溶解在CH2Cl2中，当温度降至-28～-30℃时，将式(V)化合物在25～40分钟内滴加到上述式(IV)化合物的甲醇溶液中，搅拌，升温至23～28℃，反应20～24小时得到式(VI)化合物，其中所述的式(IV)化合物与所述的式(V)化合物的摩尔量之比为0.5～1.5∶1。
[0016] 取式(VI)化合物溶于CH2Cl2，加入三氟乙酸23～28℃搅拌反应6小时，除去过量的三氟乙酸，得到黄色粘稠的液体，然后加入9-氯吖啶和苯酚，将混合溶液加热到103～
110℃，在氮气保护下反应1.5～2.5小时，反应结束后冷却至23～28℃，加入乙醚，搅拌
1小时，把乙醚从黑色油状物中倾倒出来，再加入乙醚，搅拌2天后得到的黄色固体，将该黄色固体溶于1MNaOH溶液中，用CH2Cl2进行萃取，得到暗黄色油状物即为式(I)化合物；其中所述的式(VI)化合物与所述的三氟乙酸的摩尔比为1∶8～15，所述的9-氯吖啶与所述的三氟乙酸的摩尔量之比为5～6∶1，所述的苯酚的加入量为所述的9-氯吖啶质量的
1.8～2倍。
[0017] 有益效果：
[0018] 吖啶是一种具有平面结构的有机分子，它可以有选择性的嵌入到双螺旋的DNA中，但是却不能嵌入到单链DNA中。与其它的DNA嵌入剂相比，吖啶及其衍生物嵌入前后并没有大的光学信号变化，这是我们选择吖啶作为嵌入剂的一个重要原因。它们的嵌入减小了嵌入点的负电电势，近而削弱了这些位点附近的静电相互吸引作用。本发明设计合成了一系列侧链上带有吖啶基团的噻吩衍生物，不仅保持了聚噻吩衍生物检测DNA、酶、蛋白质、金属离子等时利用底物与聚合物之间的静电相互作用力而与聚合物之间形成了复合物的性质，而且克服了聚噻吩衍生物应用静电相互作用力检测DNA容易受到溶液当中其它带有电荷物质的干扰的缺陷，显著提高聚噻吩衍生物区别单双链DNA的能力。
[0019] 本发明化合物用于DNA检测的原理：将捕获探针ssDNA与目标ssDNA混合，两者杂化形成dsDNA，此时加入含吖啶基团的共轭聚合物，由于吖啶基团可以嵌入到双链DNA中。
通过吖啶基团与双链DNA之间的特异性相互作用将聚噻吩与双链DNA联系在一起，通过检测聚噻吩与DNA前后的荧光信号变化从而实现对DNA的检测。该方法无需DNA标记。
附图说明
[0020] 图1实施例8化合物13用于DNA检测的荧光光谱，
[0021] 其中，曲线1化合物13的荧光光谱(未加DNA)；曲线2化合物13加入待检测DNA的荧光光谱。
具体实施方式
[0022] 实施例1
[0023] 称取3.34ml(50mmol)乙二胺和三乙胺1ml溶于30ml氯仿，将温度降至0℃，称取二碳酸二叔丁酯(1.09g，5mmol)溶于20ml氯仿并缓慢的滴加到上述的溶液当中，搅拌反应3小时，之后反应溶液逐渐升至室温(约25℃)，继续反应10小时。反应结束后，过滤除去不溶物，用旋转蒸发仪除去未反应的乙二胺，浓缩，得到一淡黄色油状液体即为化合物
1
1(0.71g，89％)。H-NMR：(400MHZ，CDCL3，ppm)：δ1.45(s，9H)，1.74(s，2H)，2.78(t，2H)，
3.17(q，2H)，5.12(broad s，1H).
[0024] 实施例2
[0025] 称取10ml(99.5mmol)1，4-丁二胺溶于70ml二氯甲烷当中，将温度降至0℃，称取二碳酸二叔丁酯(7.24g 33.2mmol)溶于20ml氯仿并缓慢的滴加到上述的溶液当中，搅拌反应3小时，之后反应溶液逐渐升至室温(约25℃)，继续反应10小时。反应结束后，向混合溶液中加入70ml氯仿稀释，用5％的碳酸钠溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，用旋转蒸发仪将多余的溶剂除去。剩余物溶解在10ml1M的盐酸水溶液中，并用乙醚洗涤两次。得到的水层用2M氢钠化钠水溶液调至碱性(pH＝10)，然后用乙酸乙酯进行萃取。萃取液用无水硫酸
1
镁干燥，除去多余的溶剂，即可得到化合物2，不需要进一步纯化。H-NMR：(400MHZ，CDCL3，ppm)：δ1.40(br，s，13H)，2.73(t，2H)，3.15(t，2H)，5.12(broad s，1H).
[0026] 实施例3
[0027] 用1，6-己二胺替代实施例2中的1，4-丁二胺，合成方法同实施例2，即可制备得
1
到化合物3。H-NMR：(400MHZ，CDCL3，ppm)：δ1.55-1.27(m，17H)，2.67(t，2H)，3.11(q，2H)，
4.90(broad s，1H).
[0028] 实施例4
[0029] 用1，8-己二胺替代实施例2中的1，4-丁二胺，合成方法同实施例2，即可制备得
1
到化合物4。H-NMR：(400MHZ，CDCL3，ppm)：δ1.56-1.23(m，21H)，2.58(t，2H)，3.32(q，2H)，
5.15(broad s，1H).
[0030] 实施例5
[0031] 称取3-噻吩乙酸(0.6895g 4.85mmol)溶于200ml二氯甲烷当中，称取N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu，0.67g 5.82mmol)在室温(约25℃)的条件下加入到上述的溶液当中。搅拌，待反应进行20分钟后，进行冰盐浴，当上述溶液的温度降到-20℃时，直接加入DDC(1.25g0.88mmol)，搅拌，逐渐恢复到室温(约25℃)并反应24小时，有大量的白色固体生成。将固体物质过滤后，反应液浓缩，得到的粗产品用硅胶柱色谱纯化，200-300目硅胶，石油醚∶乙酸乙酯(25∶1)作为展开剂，得到的产物为白色粉末即为式(V)化合物(1.09g，94.5％)1H-NMR：(400MHZ，CDCL3，ppm)：δ2.84(s，4H)，3.97(s，2H)，7.09(d，1H)，
7.28(S，1H)，7.33(d，1H).
[0032] 实施例6
[0033] 称取化合物1(0.2487g 1.55mmol)溶于10ml甲醇中，加入三乙胺(0.3ml)，称取式(V)化合物(0.3588g 1.5mmol)溶解在20mlCH2Cl2中，当温度降至-30℃时，将式(V)化合物在30分钟内滴加到上述制备的化合物1的甲醇溶液里，搅拌，逐渐升温至室温(约25℃)，反应24小时。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，固体物质溶于30mlCH2Cl2中，分别用2M的NaHCO315ml，饱和食盐水15ml和水洗涤。得到的有机层用无水MgSO4干燥，粗产品用硅胶柱色谱纯化，200-300目硅胶，二氯甲烷∶甲醇(25∶1)作为展开剂，得到的产物为无色
1
粉末状物质即为化合物6。(0.4169g 97.7％)。H-NMR：(400MHz，CDCl3，ppm)：δ1.43(S，
9H)，3.22(q，2H)，3.51(q，2H)，3.62(s，2H)，4.89(s broad，1H NH)，6.25(s broad，1HNH)，
13
7.01(d，1H)，7.15(s，1H)，7.32(d，1H). C NMR(100MHz，CDCl3)：δ170.90，156.30，134.29，+
128.01，126.02，122.84，40.16，39.82，37.59，27.94.MS(EI)m/z 284(M).Anal.Calcd for C13H20O2SN2：C，55.61；H，7.295；N，10.055.Found：C，54.91；H，7.089；N，9.85.[0034] 分别用化合物2，3，4替换化合物1，按照上述方法即可合成得到化合物7，8，9：
[0035] 化 合 物 7：，1H-NMR：(400MHz，CDCl3，ppm)：δ1.43(S，9H)，1.70(m，2H)，
1.99(t，2H)，3.36(m，2H)，3.66(s，2H)，3.87(t，2H)，5.03(s broad，1H NH)，6.99(d，1H)，
13
7.12(s，1H)，7.23(d，1H). C NMR(100MHz，CDCl3)：δ170.64，156.14，135.08，128.57，+
126.83，123.51，39.38，38.28，28.51，27.61，26.75.MS(EI)m/z 312(M).Anal.Calcd for C15H24O2SN2：C，57.67；H，7.74；N，8.97.Found：C，56.62；H，7.79；N，8.91.[0036] 化合物8：1H-NMR：(400MHz，CDCl3，ppm)：δ1.23(t，2H)，1.41(m，4H)，1.43(S，9H)，
1.72(m，2H)，3.17(m，2H)，3.52(s，2H)，3.63(t，2H)，5.43(s broad，1H NH)，6.97(d，1H)，
13
7.12(s，1H)，7.31(d，1H). C NMR(100MHz，CDCl3)：δ170.42，155.997，135.05，128.42，
126.56，123.23，40.19，39.31，38.12，29.89，29.27，28.38，26.16，26.08，24.94.MS(EI)m/z +
340(M).Anal.Calcd for C17H28O2SN2：C，59.97；H，8.29；N，8.23.Found：C，59.94；H，8.21；
N，8.27.
[0037] 化 合 物 9：1H-NMR：(400MHz，CDCl3，ppm)：δ1.20(m，4H)，1.32(m，4H)，1.43(S，
9H)，1.72(m，2H)，3.19(m，2H)，3.51(s，4H)，3.58(t，2H)，5.21(s broad，1H NH)，6.98(d，
13
1H)，7.17(s，1H)，7.28(d，1H). C NMR(100MHz，CDCl3)：δ170.35，155.94，137.07，128.44，+
126.67，123.33，39.55，38.15，29.95，29.04，29.01，28.38，26.61.MS(EI)m/z368(M).Anal.Calcd for C19H32O2SN2：C，61.92；H，8.75；N，7.6.Found：C，61.88；H，8.69；N，7.67.[0038] 实施例7
[0039] 称取化合物6(0.416g 1.47mmol)溶于15mlCH2Cl2，加入三氟乙酸(1.67g
14.68mmol)室温(约25℃)搅拌反应6小时，反应结束后用旋转蒸发仪除去过量的三氟乙酸，得到黄色粘稠的液体。然后加入9-氯吖啶(0.55g 2.57mmol 1eq)和苯酚(1g)，将混合溶液加热到105℃，在氮气保护下反应2小时。反应结束后，冷却至室温(约25℃)，加入乙醚(25ml)，搅拌1小时，把乙醚从黑色油状物中倾倒出来，再加入乙醚(25ml)，搅拌2天后得到化合物4的盐酸盐为黄色固体(0.931g，2.34mmol，91％)。把固体物质溶于少量的
1
1M NaOH溶液中，用CH2Cl2进行萃取，得到的暗黄色油状物即为化合物10。H-NMR：(400MHz，D2O，ppm)：δ3.66(d，4H)，3.97(t，2H)，6.19(s broad，1H)，6.84(d，1H)，7.04(s，1H)，
13
7.24(d，1H)，7.32(d，2H)，7.51(t，2H)，7.97(d，2H)，8.1(d，2H). C NMR(100MHz，CDCl3)：
δ173.44，153.16，146.64，134.53，131.12，128.54，126.71，125.91，124.10，123.64，+
122.90，115.57，52.18，40.67，37.93.MS(ESI)m/z 362(M+1).Anal.Calcd for C21H19S1O1N3：
C，69.78；H，5.30；N，11.63.Found：C，69.12；H，4.97；N，11.19.
[0040] 分别用化合物7，8，9替换化合物6，按照上述方法即可合成化合物11，12，13：
[0041] 化 合 物11：1H-NMR：(400MHz，CDCl3，ppm)：δ1.68(t，2H)，1.95(t，2H)，3.33(q，
2H)，3.62(s，2H)，3.89(t，2H)，6.72(s，1H)，6.99(d，H)，7.16(s，H)，7.11(t，2H)，7.24(t，
13
H)7.37(t，2H)，7.72(d，2H)，8.09(d，2H). C NMR(100MHz，CDCl3)：δ171.15，155.34，
141.51，135.20，132.76，128.58，126.22，124.58，123.13，122.73，122.40，112.96，48.44，+
38.92，38.05，27.50，26.80.MS(ESI)m/z 390(M+1).Anal.Calcd for C23H23S1O1N3：C，
70.92；H，5.95；N，10.79.Found：C，70.39；H，5.46；N，11.22.)
[0042] 化 合 物12：1H-NMR：(400MHz，CDCl3，ppm)：δ1.28(m，2H)，1.44(m，4H)，1.76(m，
2H)，3.20(q，2H)，3.59(s，2H)，3.81(t，2H)，5.43(s，H)，6.97(d，H)，7.12(s，H)，7.31(s，
13
H)7.37(t，2H)，7.67(t，2H)，8.09(t，4H). C NMR(100MHz，CDCl3)：δ170.55，153.26，
149.45，134.99，132.22，130.151，128.47，126.77，123.44，123.08，122.85，116.35，50.5，+
39.30，39.19，31.52，29.38，26.32，26.01.(MS(ESI)m/z 418(M+1).Anal.Calcd for C25H27S1O1N3：C，71.91；H，6.52；N，10.06.Found：C，71.55；H，5.89；N，10.33.)[0043] 化 合 物13：1H-NMR：(400MHz，CDCl3，ppm)：δ1.23(m，6H)，1.35(m，4H)，1.76(m，
2H)，3.15(q，2H)，3.58(s，2H)，3.80(t，2H)，5.65(s，H)，6.98(d，H)，7.11(s，H)，7.29(s，H)7.33(t，2H)，7.64(t，2H)，8.04(d，2H)，8.09(d，2H).13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ170.52，
151.79，148.68，135.07，130.16，128.49，126.65，123.35，123.01，122.94，116.27，50.69，
39.55，38.19，31.59，29.37，29.01，28.93，26.66，26.54.MS(ESI)m/z 446(M+1)+.Anal.Calcd forC27H31S1O1N3：C，72.77；H，7.01；N，9.43.Found：C，72.36；H，7.37；N，8.98.)[0044] 实施例8
[0045] 将等摩尔的探针单链DNA(SEQ ID NO.1)与待测目标单链DNA(SEQ ID NO.2)加入到磷酸缓冲溶液中(50mM，pH＝7.0)，于60℃下温育30分钟，然后慢慢冷却到室温获得双-7
链DNA。将聚合物探针即化合物13(1.0×10 M)加入到待检测DNA溶液中，聚合物和双链DNA由于静电吸引而结合，搅拌1分钟后于400nm激发下测定其荧光强度。通过对比聚合物探针在探针单链DNA存在下的荧光强度(图1)，实现对目标DNA的检测。
[0046] 本发明实施例中所涉及化合物结构如下：
[0047]
[0048]