用于HIV检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法

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用于HIV检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测\n方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种用于HIV(人类免疫缺陷病毒)检测的酸性处理剂、样本预处理方法、试剂盒及检测方法。\n背景技术\n[0002] HIV病毒(人类免疫缺陷病毒)侵入人体后，其表面糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4以高亲和力结合，吸附到宿主细胞上；gp120再与宿主细胞表面辅助受体相互作用，使病毒与宿主细胞膜更接近；gp41产生一系列构象变化，其N端的融合肽片段插入宿主细胞膜，导致病毒包膜与细胞膜的最终融合，病毒RNA进入细胞。在HIV感染后，最先能够监测到病毒RNA、然后是病毒的p24抗原，最后是抗体。根据HIV基因结构、免疫学和流行病学的特征，HIV被划分为HIV-1和HIV-2两大类。HIV-1的感染力较强，是当今世界HIV流行的主要病毒株。\n[0003] 目前检测HIV的方法有100多种，总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。\n病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、p24抗原检测和病毒核酸检测。早期对HIV的诊断主要是通过血清学试验检测抗HIV的抗体，间接地诊断HIV感染。抗体通常是在感染后3～8周能够被检测出来。超过70％的HIV感染者在感染6个月后才能检测出抗体，在同性恋群体中，这个数字超过80％；另外，新生儿产生抗HIV抗体一般在出生1年后，来自母体的抗HIV抗体易造成新生儿假阳性；单纯检测抗体方法增加了HIV“窗口期”传播的危险性。抗原能够在个体感染后先于血清转化2～18d被检测到。因此，在血清转化期通过检测p24抗原有着很大的优势，可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。\n[0004] 但是，常规使用的p24抗原检测存在灵敏度较低的问题。如单独p24抗原检测试剂的检出水平大约是10pg/mL，联合检测的p24抗原检出水平更是达不到单独检测水平。但既使在病毒活跃复制的时候，血清中的抗原量也很少达到这个水平。并且，常规使用化学发光免疫法检测HIV时，常出现假阴性和假阳性，致使HIV诊断结果的不准确性，出现漏诊或误诊，后果十分严重。\n发明内容\n[0005] 基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种用于HIV检测的酸性处理剂，采用该酸性处理剂对样本进行预处理，能够提高HIV的检测灵敏度。\n[0006] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：\n[0007] 一种用于HIV检测的酸性处理剂，主要由浓度为0.1-1.0mol/L的有机酸溶液和浓度为0.01-0.1mol/L的无机酸溶液混合而成，或为浓度为0.1-1.2mol/L的有机酸溶液，该酸性处理剂的pH值为2.5-4.5。\n[0008] 本发明人通过大量研究实验考察后发现，常规技术中p24抗原检测灵敏度低的原因，是HIV感染者血清中的p24抗原一般都与抗p24抗体结合成为复合物，而检测方法本身是不能检测抗原抗体复合物的，需要将复合物解离才能够被检测。但是，在复合物解离的时候，需要通过酸性溶液处理才可使p24抗原和抗p24抗体解离，为了将所有的p24抗原释放出来，需要加入过量的酸剂处理或高温加热样本，而如只加入盐酸等无机酸，由于受到加入盐酸的量所限制，只能将样本稀释，使加入的盐酸足以将所有p24抗原释放，才能满足检测要求。但是，样本被稀释后就极大的降低检测灵敏度。而高温加热样本来释放p24抗原，又可能对生物样本产生不良影响。\n[0009] 并且，也不能简单通过提高盐酸含量来达到避免稀释样本的目的，一方面是由于当盐酸浓度过高时，其挥发性也相应较大，对仪器有较高要求，且可能会影响抗原或抗体的活性，对检测准确性造成一定影响；另一方面来说，当盐酸浓度过高时，过强的酸性会对样本造成不良影响，从而降低了检测的准确性。\n[0010] 而本发明的酸性处理剂，是高摩尔浓度有机酸和低摩尔浓度无机酸的混合酸溶液，使有机酸和无机酸相配合，或单独使用高摩尔浓度有机酸溶液；利用有机酸的生物性，及更容易与一些有机物接触的性质，使有机酸缓和地将p24抗原释放，也可以加入少量的无机酸提供必需的氢离子，以补充酸度。二者相互配合或单独使用高摩尔浓度的有机酸溶液都可以很好的分离样本中的p24抗原与抗p24抗体，无需将样本稀释，就可完全释放其中的p24抗原，达到检测要求。从而能够提高检测灵敏度。\n[0011] 在其中一个实施例中，所述有机酸和一元无机酸的摩尔比为1-20:1；或所述有机酸和二元无机酸的摩尔比为0.5-10:1；或所述有机酸和三元无机酸的摩尔比为0.3-6.6:1。\n所述一元无机酸指盐酸等一个分子能电离出一个氢离子的无机酸，所述二元无机酸指硫酸等一个分子能电离出两个氢离子的无机酸，所述三元无机酸指磷酸等一个分子能电离出三个氢离子的无机酸。将有机酸和无机酸按照上述比例配合，具有更好的p24抗原释放效果。\n[0012] 在其中一个实施例中，所述有机酸和一元无机酸的摩尔比为7-13:1；或所述有机酸和二元无机酸的摩尔比为3.5-6.5:1；或所述有机酸和三元无机酸的摩尔比为2.3-4.3:\n1。\n[0013] 在其中一个实施例中，所述有机酸为乙酸、苯甲酸、乙二酸、丁二酸、苹果酸、柠檬酸、水杨酸中的至少一种。\n[0014] 在其中一个实施例中，所述无机酸为硫酸、盐酸、硝酸、氢氟酸、亚硫酸、亚硝酸中的至少一种。\n[0015] 在其中一个实施例中，该酸性处理剂还包括缓冲液，所述缓冲液为甲酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硫酸盐缓冲液、硝酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液中的至少一种。使用缓冲液，能够减少试剂组份和样本中的待测物受酸的冲击的能力。\n[0016] 本发明还公开了一种HIV待测样本的预处理方法，采用上述的酸性处理剂，将待测样本与所述酸性处理剂按照0.5-5:1的体积比混合，得到待测溶液。\n[0017] 在其中一个实施例中，将待测样本与所述酸性处理剂混合后，还将待测溶液在20-\n60℃下温育1-30分钟，优选20-40℃下温育1-10分钟，更优选在30-40℃下温育3-7分钟。通过温育的方式，可以更好更快的将p24抗原和抗p24抗体分离，得到游离p24抗原。\n[0018] 本发明还公开了一种HIV检测试剂盒，包括以下组分：\n[0019] 1)酸性处理剂：上述的酸性处理剂；\n[0020] 2)磁性微球体系：包括直接连接或间接连接HIV重组抗原1的磁性微球，和/或直接连接或间接连接抗HIV抗体A的磁性微球；\n[0021] 3)标记物体系：包括相应的直接连接或间接连接标记示踪物的HIV重组抗原2，和/或直接连接或间接连接标记示踪物的抗HIV抗体B；\n[0022] 所述HIV重组抗原1和HIV重组抗原2与待测抗体结合的位点互不相同，所述抗HIV抗体A和抗HIV抗体B与待测抗原结合的位点互不相同。\n[0023] 上述“直接连接”为直接结合的连接，上述“间接连接”为通过生物素和链霉亲和素，或异硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体等能够相互结合的搭桥物以间接结合的方式连接。其中抗体A和抗体B既可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，均不影响其检测效果。\n[0024] 上述检测试剂盒中，既可以使用HIV重组抗原系统来检测HIV抗体，或使用抗HIV抗体系统来检测HIV抗原，也可以同时使用HIV重组抗原系统和抗HIV抗体系统来同时检测HIV抗体和HIV抗原(如HIV p24抗原)，可以提高检测灵敏度。\n[0025] 并且，上述磁性微球体系中，所述连接标记示踪物的HIV重组抗原2中，HIV重组抗原1的工作浓度优选1-20μg/mL，磁性微球的工作浓度优选0.1-5.0％；所述连接抗HIV抗体A的磁性微球中，抗HIV抗体A的工作浓度优选1-20μg/mL，磁性微球的工作浓度优选0.1-\n5.0％。上述标记物体系中，所述连接标记示踪物的HIV重组抗原2中，HIV重组抗原2的工作浓度优选2-20μg/mL，标记示踪物的工作浓度优选0.1-1mg/L；所述连接标记示踪物的抗HIV抗体B中，抗HIV抗体B的工作浓度优选2-20μg/mL，标记示踪物的工作浓度优选0.1-1mg/L。\n[0026] 适用于本发明的磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。\n优选的是，本发明使用的磁球，是将纳米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特别限制，可根据需要进行选择。\n[0027] 本发明所使用的磁性微球应能满足直径为0.1-5μm，磁性微球还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2。\n[0028] 在其中一个实施例中，所述磁性微球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并具有0.1-5μm的粒径，并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。\n[0029] 在其中一个实施例中，该检测试剂盒还包括以下组份：\n[0030] 4)免疫干扰物结合剂：包括结合剂和辅助成分；所述结合剂为新生牛血清、羊血清、马血清、牛血清白蛋白、羊抗人IgG/IgM、兔抗人IgG/IgM、鼠抗人IgG/IgM中的至少一种；\n所述辅助成分为甘油、乙二醇、聚乙二醇、蔗糖、氯化钠、乙二胺四乙酸盐(EDTA)中的至少一种。\n[0031] 本发明人通过大量的实验研究发现，在常规HIV检测中，特异性和灵敏度低的另一个原因是在样本中有大量干扰物，如：血浆、血清蛋白(类风湿性因子、结合蛋白)，嗜异性抗体，人抗动物抗体(HAAA)和药物及其导致的代谢物等，尤其是后两种抗体干扰最多。\n[0032] 在上述研究基础上，本发明的检测试剂盒中，还加入了免疫干扰物结合剂，其中的作为蛋白类的结合剂能够与样本中的嗜异性抗体和类分湿因子等非特异性的结合，而辅助成分可消除组织代谢物的影响，从而避免干扰物对检测过程的干扰，提高了检测特异性和灵敏度。\n[0033] 在其中一个实施例中，所述结合剂的浓度为0.1-20g/L，所述辅助成分的浓度为\n0.2-10g/L。\n[0034] 在其中一个实施例中，所述干扰物结合剂中还包括：表面活性剂Ⅰ、表面活性剂Ⅱ、抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶，所述表面活性剂Ⅰ为两性离子表面活性剂，如卵磷脂、氨基酸型，甜菜碱型等；所述表面活性剂Ⅱ为非离子表面活性剂，如脂肪酸甘油酯，脂肪酸山梨坦，聚山梨酯等；所述表面活性剂Ⅰ的浓度优选0.01-0.1mol/L，所述表面活性剂Ⅱ的浓度优选0.01-0.1mol/L，所述抗坏血酸氧化酶的浓度优选1-20KU/L，所述胆红素氧化酶的浓度优选1-20KU/L。\n[0035] 其中：添加表面活性剂有利于样本中干扰物的分散效果，而抗坏血酸氧化酶和胆红素氧化酶可减少样本中的抗坏血酸和胆红素对结果的影响，免疫干扰物结合剂中各成分相互配合，能够达到较好的抗干扰作用。\n[0036] 在其中一个实施例中，所述HIV重组抗原为HIV 1+2型重组抗原，所述抗HIV抗体为抗HIV p24抗体。所述HIV 1+2型重组抗原为HIV 1型对应的gp41,gp120和HIV 2型对应gp36的重组蛋白。\n[0037] 上述标记示踪物包括以下几种：1、化学发光免疫分析使用的能够直接发光的标记物，如鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物、吖啶酯等；2、化学发光酶免疫分析使用的配合相应的发光底物可以发光的标记物，如碱性磷酸酶或过氧化物酶等。\n[0038] 在其中一个实施例中，所述标记示踪物为发光标记物，选自：金刚烷，鲁米诺及其衍生物，异鲁米诺及其衍生物，吖啶酯。优选N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)，与上述发光标记物配合的氧化系统包括H2O2-微过氧化物酶、H2O2-过氧化氢酶、H2O2-乳过氧化物酶、H2O2-次氯血红素、H2O2-氯化血红素、次氯酸盐-CoCl2、过硫酸盐、过氧化钾、高碘酸钠、H2O2-K3Fe(CN)6、黄嘌呤-次黄嘌呤氧化酶、叔丁醇钾中的至少一种。\n[0039] 上述发光标记物是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，该化合物能够经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM)。\n[0040] 或所述标记示踪物为化学发光催化剂，选自：碱性磷酸酶，过氧化物酶。使用时，配合相应的化学发光底物即可发光被定量检测，所述化学发光底物包括NaOH和H2O2，还包括金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物中的至少一种，优选N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。\n[0041] 在其中一个实施例中，所述2)磁性微球体系中，所述间接连接HIV重组抗原1的磁性微球由包被抗异硫氰酸荧光素抗体的磁性微球，和标记异硫氰酸荧光素的HIV重组抗原1组成；或所述间接连接HIV重组抗原1的磁性微球由包被链霉亲和素的磁性微球，和标记生物素的HIV重组抗原1组成；或所述间接连接HIV重组抗原1的磁性微球由包被抗标签蛋白抗体的磁性微球，和具有标签蛋白的HIV重组抗原1组成；\n[0042] 所述间接连接抗HIV抗体A(即抗HIV p24抗体)的磁性微球由包被抗异硫氰酸荧光素抗体的磁性微球，和标记异硫氰酸荧光素的抗HIV抗体A组成；或所述间接连接抗HIV抗体A的磁性微球由包被链霉亲和素的磁性微球，和标记生物素的抗HIV抗体A组成；或所述间接连接抗HIV抗体A的磁性微球由包被抗标签蛋白抗体的磁性微球，和具有标签蛋白的抗HIV抗体A组成。\n[0043] 上述抗异硫氰酸荧光素(FITC)抗体既可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。\n[0044] 并且，上述磁性微球体系中，所述包被抗异硫氰酸荧光素抗体的磁性微球中，抗异硫氰酸荧光素抗体的工作浓度优选1-20μg/mL，磁性微球的工作浓度优选0.1-2mg/mL，所述标记异硫氰酸荧光素的HIV重组抗原1(或抗HIV抗体A)中，异硫氰酸荧光素的工作浓度优选\n5-500ng/mL，HIV重组抗原1(或抗HIV抗体A)的工作浓度优选0.1-10μg/mL；所述包被链霉亲和素的磁性微球中，链霉亲和素的工作浓度优选1-20μg/mL，磁性微球的工作浓度优选0.1-\n2mg/mL，所述标记生物素的HIV重组抗原1(或抗HIV抗体A)的工作浓度优选10-500μg/mL。\n[0045] 在其中一个实施例中，所述3)标记物体系中，所述间接连接标记示踪物的HIV重组抗原2由标记生物素的HIV重组抗原2，和标记链霉亲和素的标记示踪物组成；或所述间接连接标记示踪物的HIV重组抗原2由标记异硫氰酸荧光素的HIV重组抗原2，和标记抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物组成；或所述间接连接标记示踪物的HIV重组抗原2由具有标签蛋白的HIV重组抗原2，和标记抗标签蛋白抗体的标记示踪物组成；\n[0046] 所述间接连接标记示踪物的抗HIV抗体B由标记生物素的抗HIV抗体B，和标记链霉亲和素的标记示踪物组成；或所述间接连接标记示踪物的抗HIV抗体B由标记异硫氰酸荧光素的抗HIV抗体B，和标记抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物组成；或所述间接连接标记示踪物的抗HIV抗体B由具有标签蛋白的抗HIV抗体B，和标记抗标签蛋白抗体的标记示踪物组成。\n[0047] 上述标签蛋白优选Flag标签蛋白，Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有Flag的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高\n[0048] 上述方案丰富了检测所使用的磁性微球体系和标记物体系，可根据不同需求灵活选择。例如可以在磁性微球体系中直接将HIV重组抗原1(或抗HIV抗体A)连接磁性微球，也可以通过上述的间接搭桥方式连接HIV重组抗原1(或抗HIV抗体A)和磁性微球。同样，可以在标记物体系中将标记示踪物直接连接HIV重组抗原2(或抗HIV抗体B)，也可以通过上述的间接搭桥方式连接标记示踪物和HIV重组抗原2(或抗HIV抗体B)。并且，上述磁性微球体系和标记物体系中采用何种连接方式(直接连接或间接搭桥连接)并无相互影响或限定，既可在磁性微球体系和标记物体系中同时采用直接连接方式或同时采用间接连接方式，也可磁性微球体系选用直接连接，标记物体系采用间接连接，或者磁性微球体系选用间接连接，标记物体系采用直接连接。\n[0049] 可以理解的，在其中一个实施例中，该检测试剂盒还包括：\n[0050] 5)校准品溶液：阴性校准品(HIV阴性血清制品)和阳性校准品(已灭活的HIV阳性血清制品)溶液。\n[0051] 通过样本与校准品溶液相对光强度(RLU)的比例关系，计算出测定结果。\n[0052] 在其中一个实施例中，该检测试剂盒各组分中均含有牛血清白蛋白(BSA)和防腐剂，BSA的浓度为0.01-0.5g/ml，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的至少一种。\n[0053] 本发明还公开了一种HIV检测方法，采用上述的检测试剂盒，包括以下步骤：\n[0054] 1)预处理：按照上述的预处理方法进行样本预处理；\n[0055] 2)反应：在上述待测溶液中加入磁性微球体系和标记物体系，形成发光免疫复合物；\n[0056] 3)检测：外加磁场将上述发光免疫复合物沉淀，去除上清液，清洗后，加入发光底物，检测发出的相对光强度，计算得到待测抗体和/或待测抗原的含量。\n[0057] 在其中一个实施例中，所述步骤2)反应中，还加入上述的免疫干扰物结合剂。使免疫干扰物结合剂与样本中的干扰物结合，从而避免干扰物对检测过程的干扰，提高了检测灵敏度。\n[0058] 本发明还公开了一种上述的HIV检测试剂盒在化学发光分析仪上的应用。将该试剂盒应用于化学发光分析仪，具有操作规范，无人为引入误差及全自动化的优点。\n[0059] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：\n[0060] 本发明的一种酸性处理剂，将有机酸和无机酸相配合，利用有机酸更容易与一些有机物接触的性质，使有机酸缓和地将p24抗原和抗p24抗体分离，也可利用无机酸提供必需的氢离子，以补充酸度。二者相互配合或单独使用有机酸，都可以很好的分离样本中的p24抗原和抗p24抗体，在进行检测时，无需将样本稀释或高温加热，就可完全释放其中的p24抗原，达到检测要求，提高检测灵敏度。\n[0061] 本发明的一种待测样本的预处理方法，采用上述的酸性处理剂，在样本预处理时，无需将样本稀释或高温加热，就可以很好的分离样本中的p24抗原和抗p24抗体，完全释放其中的p24抗原，达到检测要求。并且，该方法在样本预处理中，还将待测溶液在20-60℃下温育1-30分钟。通过温育的方式，可以更好更快的将p24抗原从抗p24抗体上释放，得到游离p24抗原，既提高了检测效率，又不会由于高温对样本产生不良影响。\n[0062] 本发明的一种HIV检测试剂盒，除采用了上述酸性处理剂外，还加入了免疫干扰物结合剂，通过避免干扰物对检测过程的干扰，进一步的提高了检测灵敏度。使p24抗原的检出水平达到0.625U/mL(L6)，达到了HIV抗原抗体联合检测试剂盒的要求，甚至达到了中国药品生物制品检定所的关于HIV p24抗原单独检测试剂的最低检出量要求。达到了HIV p24抗原检测分析灵敏度小于1pg/mL、功能灵敏度小于5pg/mL的目的。而理论上，检测P24抗原的窗口期一般在4-14d左右，较HIV抗体检测窗口期减少2/3，直逼HIV-RNA的窗口水平，而检测成本却较p24抗原和核酸检测降低很多。\n[0063] 本发明的一种HIV检测方法，其中样本采用上述的预处理方法，将有机酸和无机酸相配合或单独使用有机酸作为酸性处理剂，能够提高检测灵敏度。特别是，还配合免疫干扰物结合剂的使用，通过避免干扰物对检测过程的干扰，进一步的提高了检测灵敏度。\n具体实施方式\n[0064] 以下结合实施例对本发明做进一步的说明，但并不对本发明造成任何限制。\n[0065] 以下实施例中：\n[0066] HIV 1+2型重组抗原1，购自meridian life science。\n[0067] 抗HIV p24单克隆抗体A，购自meridian life science。\n[0068] 标记ABEI的抗标签蛋白的HIV 1+2型重组抗体，购自meridian life science。\n[0069] 带有标签蛋白的HIV 1+2型重组抗原，购自meridian life science。\n[0070] 抗HIV p24多克隆抗体B，购自meridian life science。\n[0071] 羊抗FITC多克隆抗体，购自北京百浩生物科技有限公司。\n[0072] 磁性微球，来源：为深圳新产业生物医学股份有限公司生产。\n[0073] FITC：购自Sigma。\n[0074] ABEI：为深圳新产业生物医学股份有限公司生产。\n[0075] 生物素、链霉亲和素：均购自Roche。\n[0076] 阴性校准品和阳性校准品：均购自meridian life science。\n[0077] 实施例1\n[0078] 一种HIV检测试剂盒，包括以下组分：\n[0079] 1)酸性处理剂：\n[0080] 浓度为0.5mol/L的乙酸溶液和浓度为0.05mol/L的盐酸溶液，按照其中乙酸和盐酸的摩尔比为10：1混合；并按体积比1:1加入0.05mol/L的醋酸盐缓冲液，得到酸性处理剂，该酸性处理剂的pH值为3.5。\n[0081] 2)磁性微球体系：包被HIV 1+2型重组抗原1的磁性微球溶液，其中：HIV 1+2型重组抗原1的工作浓度为10μg/mL，磁性微球的工作浓度为0.5mg/mL。\n[0082] 包被抗HIV p24单克隆抗体A的磁性微球溶液，其中：抗HIV p24单克隆抗体A的浓度为10μg/mL，磁性微球的工作浓度为0.5mg/mL。\n[0083] 3)标记物体系：标记ABEI的抗标签蛋白的抗体溶液，其工作浓度为0.2mg/L。\n[0084] 带有标签蛋白的HIV 1+2型重组抗原2，其工作浓度为1μg/mL；\n[0085] 标记ABEI的抗HIV p24多克隆抗体B，其工作浓度为0.5mg/L。\n[0086] 所述标签蛋白为Flag标签蛋白。\n[0087] 4)免疫干扰物结合剂，包括：\n[0088] 结合剂：体积百分浓度为0.1-20％的新生牛血清、0.1-20g/L牛血清白蛋白、0.01-\n5g/L羊抗人IgG/IgM、0.01-5g/L兔抗人IgG/IgM；\n[0089] 辅助成分：0.01-5g/L乙二醇、0.01-5g/L EDTA-2K、0.01-0.2mol/L聚乙二醇6000；\n[0090] 缓冲剂成分：0.01-5g/L Tris、0.01-0.2mol/L PBS缓冲剂；\n[0091] 表面活性剂：0.01-0.1mol/L的卵磷脂(来源：上海中基行化工)、0.01-0.1mol/L的脂肪酸甘油酯(来源：上海中基行化工)；\n[0092] 抗坏血酸氧化酶：1-20KU/L；\n[0093] 胆红素氧化酶：1-20KU/L。\n[0094] 5)校准品溶液：阴性校准品(HIV阴性血清制品)和阳性校准品(HIV阳性血清制品，已灭活)溶液。\n[0095] 上述各组分均含有牛血清白蛋白(BSA)和防腐剂，BSA浓度为0.05g/ml，防腐剂主要成分为NaN3，浓度为0.02g/ml。\n[0096] 本实施例的HIV检测试剂盒的制备方法中，除以下试剂外，其余均按照常规方法制备。\n[0097] 上述包被HIV 1+2型重组抗原1的磁性微球和包被抗HIV p24单克隆抗体A的磁性微球通过以下方法制备：使用1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)等作为搭桥物质连接抗原(或抗体)与经处理后已吸附羧基基团的磁性微球，30-40℃温育1-2小时，再经过3-5次磁球悬浮液的洗涤去除杂质即可使用。\n[0098] 上述标记ABEI的抗标签蛋白的抗体(或标记ABEI的抗HIV p24多克隆抗体)通过以下方法制备：使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等作为搭桥物质连接ABEI与抗体(或抗原)后，经过G-25凝胶层析过柱得到纯化物。\n[0099] 采用本实施例的检测试剂盒进行HIV抗原和抗体联合检测的方法，包括以下步骤：\n[0100] 1)预处理：将50μL样本、50μL阴性校准品和50μL阳性校准品分别加入到反应杯中，并加入50μL酸性处理剂，混匀，在37℃温育5分钟。\n[0101] 2)第一步反应：加入20μL包被HIV 1+2型重组抗原1的磁性微球溶液，20μL包被抗HIV p24单克隆抗体A的磁性微球溶液，50μL带有标签蛋白的HIV 1+2型重组抗原2溶液(其中包括质量百分含量为50％的免疫干扰物结合剂)，混匀。在37℃温育20min，置于磁环境下清洗3次。\n[0102] 3)第二步反应：加入100μL标记ABEI的抗标签蛋白的抗体溶液，100μL带有标签蛋白的HIV 1+2型重组抗原2溶液，和100μL标记ABEI的抗HIV p24多克隆抗体B溶液，形成包括磁性微球、HIV 1+2型重组抗原1、待测抗体、HIV 1+2型重组抗原2与ABEI复合的发光免疫复合物，和形成包括磁性微球、抗HIV p24单克隆抗体A、HIV p24抗原、抗HIV p24单克隆抗体B与ABEI复合的发光免疫复合物。\n[0103] 4)检测：外加磁场将上述发光免疫复合物沉淀，去除上清液，并以自动灌注系统缓冲液进行清洗，加入化学发光激发物，检测发出的相对光强度，通过校准品修正后的工作曲线可计算得出样本的HIV抗体浓度和HIV p24抗原的含量。\n[0104] 实施例2\n[0105] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0106] 1)酸性处理剂：主要由浓度为0.1mol/L的乙酸溶液和浓度为0.01mol/L的盐酸溶液，按照其中乙酸和盐酸的摩尔比为20：1混合而成，该酸性处理剂的pH值为3.5。\n[0107] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0108] 实施例3\n[0109] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0110] 1)酸性处理剂：主要由浓度为0.5mol/L的乙酸溶液和浓度为0.05mol/L的盐酸溶液，按照其中乙酸和盐酸的摩尔比为1：1混合而成，该酸性处理剂的pH值为3.5。\n[0111] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0112] 实施例4\n[0113] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0114] 1)酸性处理剂：主要由浓度为0.5mol/L的乙酸溶液和浓度为0.05mol/L的盐酸溶液，按照其中乙酸和盐酸的摩尔比为13：1混合而成，该酸性处理剂的pH值为3.5。\n[0115] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0116] 实施例5\n[0117] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0118] 1)酸性处理剂：主要由浓度为0.5mol/L的乙酸溶液和浓度为0.05mol/L的盐酸溶液，按照其中乙酸和盐酸的摩尔比为7：1混合而成，该酸性处理剂的pH值为2.5。\n[0119] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0120] 实施例6\n[0121] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0122] 1)酸性处理剂：主要由浓度为0.1mol/L的乙酸溶液配制而成，该酸性处理剂的pH值为3.5。\n[0123] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0124] 实施例7\n[0125] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0126] 1)酸性处理剂：主要由浓度为1.2mol/L的乙酸溶液配制而成，该酸性处理剂的pH值为4.5。\n[0127] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0128] 实施例8\n[0129] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0130] 1)酸性处理剂中，将乙酸替换为水杨酸。\n[0131] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0132] 实施例9\n[0133] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0134] 1)酸性处理剂中，将乙酸替换为水杨酸，将盐酸替换为亚硫酸。\n[0135] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0136] 实施例10\n[0137] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：该试剂盒的组分中没有免疫干扰物结合剂。\n[0138] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本对比例的检测试剂盒进行检测，并且在加样反应中没有加入免疫干扰物结合剂步骤。\n[0139] 实施例11\n[0140] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0141] 1)免疫干扰物结合剂中，没有添加辅助成分。\n[0142] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0143] 实施例12\n[0144] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0145] 2)磁性微球体系：包被链霉亲和素(SA)的磁性微球溶液，其中：链霉亲和素的工作浓度为10μg/mL，磁性微球的工作浓度为1mg/mL。\n[0146] 生物素标记的HIV 1+2型重组抗原1溶液，其工作浓度为10μg/mL；\n[0147] 生物素标记的抗HIV p24单克隆抗体A溶液，其工作浓度为10μg/mL。\n[0148] 3)标记物体系：标记ABEI的HIV 1+2型重组抗原2溶液，其工作浓度为0.5mg/L。\n[0149] 标记ABEI的抗HIV p24多克隆抗体，其工作浓度为0.5mg/L。\n[0150] 本实施例的HIV检测试剂盒的参照实施例1的制备方法得到。\n[0151] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0152] 实施例13\n[0153] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0154] 2)磁性微球体系：包被羊抗FITC多克隆抗体的磁性微球溶液，其中：羊抗FITC多克隆抗体的工作浓度为10μg/mL，磁性微球的工作浓度为1mg/mL。\n[0155] FITC标记的HIV 1+2型重组抗原1溶液，其工作浓度为10μg/mL；\n[0156] FITC标记的抗HIV p24单克隆抗体A溶液，其工作浓度为10μg/mL。\n[0157] 3)标记物体系：标记ABEI的抗标签蛋白的抗体溶液，其工作浓度为0.2mg/L。\n[0158] 带有标签蛋白的HIV 1+2型重组抗原2溶液，其工作浓度为1μg/mL。\n[0159] 带有标签蛋白的HIV p24多克隆抗体，其工作浓度为0.5mg/L。\n[0160] 本实施例的HIV检测试剂盒的参照实施例1的制备方法得到。\n[0161] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0162] 实施例14\n[0163] 一种HIV检测试剂盒，与实施例12的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：该试剂盒的组分中没有免疫干扰物结合剂。\n[0164] 一种HIV检测的方法，与实施例12中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本对比例的检测试剂盒进行检测，并且在加样反应中没有加入免疫干扰物结合剂步骤。\n[0165] 实施例15\n[0166] 一种采用实施例1的检测试剂盒进行HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：\n[0167] 1)预处理：将50μL样本与100μL酸性处理剂加入到反应杯中并混匀，在37℃温育5分钟。\n[0168] 实施例16\n[0169] 一种采用实施例1的检测试剂盒进行HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：\n[0170] 1)预处理：将50μL样本与10μL酸性处理剂加入到反应杯中并混匀，在37℃温育5分钟。\n[0171] 对比例1\n[0172] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：该试剂盒的组分中没有酸性处理剂和免疫干扰物结合剂。\n[0173] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本对比例的检测试剂盒进行检测，并且没有1)预处理步骤，以及在加样反应中没有加入免疫干扰物结合剂步骤。\n[0174] 对比例2\n[0175] 一种HIV检测试剂盒，与实施例12的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：该试剂盒的组分中没有酸性处理剂和免疫干扰物结合剂。\n[0176] 一种HIV检测的方法，与实施例12中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本对比例的检测试剂盒进行检测，并且没有1)预处理步骤，以及在加样反应中没有加入免疫干扰物结合剂步骤。\n[0177] 对比例3\n[0178] 一种HIV检测试剂盒，与实施例1的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：该试剂盒的组分中没有酸性处理剂。\n[0179] 一种HIV检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本对比例的检测试剂盒进行检测，并且没有1)预处理步骤。\n[0180] 对比例4\n[0181] 一种HIV检测试剂盒，与实施例12的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：该试剂盒的组分中没有酸性处理剂。\n[0182] 一种HIV检测的方法，与实施例12中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本对比例的检测试剂盒进行检测，并且没有1)预处理步骤。\n[0183] 对比例5\n[0184] 一种HIV检测试剂盒，与实施例10的检测试剂盒基本相同，不同之处在于：\n[0185] 1)酸性处理剂：浓度为0.01mol/L的乙酸溶液，该酸性处理剂的pH值为2.5。\n[0186] 一种HIV检测的方法，与实施例10中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。\n[0187] 实验例\n[0188] 采用上述实施例、对比例中的检测试剂盒和检测方法在化学发光分析仪(制造商：\n深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，仪器型号：Maglumi 2000)上进行测定实验，测试样本包括：采购自中国药品生物制品检定所的HIV抗体和HIV p24抗原的国家参考品。结果如下：\n[0189] 表1灵敏度检测结果\n[0190]\n[0191]\n[0192]\n[0193] 上表中，分析灵敏度为测试结果的均值加上两倍的标准差，即为M+2SD。\n[0194] 从上述结果中可以看出以下几点：\n[0195] 1、由实施例1-16和对比例1-4的结果对比可发现：本发明实施例1-16中，因加入了酸性处理剂，其分析灵敏度得到了提高，高于对比例1-4。\n[0196] 2、由实施例1和实施例10的结果对比，以及实施例12和实施例13的结果对比可发现：当加入免疫干扰结合剂后，实施例1和实施例12的分析灵敏度得到了极大的提高，分别达到了1.302pg/ml和3.945pg/ml，这对于HIV p24的早期临床诊断非常有利，也有利于缩短窗口期。\n[0197] 3、由实施例1-7和对比例5的结果对比可发现：将无机酸和有机酸按照适当的比例配合，或者对有机酸的浓度选取非常重要，如只用无机酸，导致酸性过强可能会使抗原抗体失活。而无机酸的浓度过低(对比例5)，由于酸性不足，也影响了p24在样本中的分离。\n[0198] 总之，合适的酸度对于反应来说非常重要，如将有机酸和无机酸以特定的比例配合，具有较好的检测灵敏度。\n[0199] 4、由实施例8-9的结果对比可发现：乙酸和盐酸并不是有机酸和无机酸的唯一选择，其他酸也可以替代。\n[0200] 5、由实施例1-13的结果对比可发现：我们可以看出采用间接连接方式对最终检测结果基本无影响，可以根据自身需要选择最有利的连接方案进行试验。\n[0201] 功能灵敏度是以日间重复CV为20％时对应检测样品具有的浓度，以下为功能灵敏度实验结果：\n[0202] 表2实施例1，实施例10的功能灵敏度检测结果\n[0203]\n[0204]\n[0205] 表3实施例12，实施例14的功能灵敏度检测结果\n[0206]\n[0207]\n[0208] 表4对比例1，对比例2的功能灵敏度检测结果\n[0209]\n[0210]\n[0211] 表5对比例3，对比例4的功能灵敏度检测结果\n[0212]\n[0213]\n[0214] 从上述结果中可以看出，实施例1和12中，因加入免疫干扰结合剂和p24抗原-抗体复合物的酸性处理剂，其功能灵敏度明显高于相应的对比例。同时实施例1和12的功能灵敏度分别达到了2.19pg/mL和2.33pg/mL，这对于HIV p24的早期临床诊断非常有利，也有利于缩短窗口期。\n[0215] 表10实施例及对比例对于HIV p24抗原试剂国家标准品测定结果\n[0216]\n[0217]\n[0218] HIV p24抗原试剂国家标准品的检测要求是：阴性国家参考品(N1-N20)结果符合率达到20/20；阳性国家参考品(P1-P10)结果符合率达到10/10；对灵敏度参考品，HIV抗体/P24抗原试剂的最低检出量不得高于10U/mL，HIV P24抗原试剂的最低检出量不得高于\n2.5U/mL。在实施例1和12的结果中，阴性国家参考品符合率达到20/20；阳性国家参考品结果符合率达到10/10；特别是实施例1，对灵敏度参考品检测达到0.625U/mL(L6)水平，即实施例1试剂盒测定结果完全符合HIV p24抗原试剂国家标准品的要求，达到了HIV抗原抗体联合检测试剂盒的要求，甚至达到了中国药品生物制品检定所的关于HIV p24抗原单独检测试剂的最低检出量要求。\n[0219] 表13实施例及对比例HIV抗体试剂国家标准品测定结果\n[0220]\n[0221]\n[0222]\n[0223] HIV抗体试剂国家标准品的检测要求是：阴性国家参考品(N1-N20)结果符合率达到20/20；阳性国家参考品(P1-P20)结果符合率达到20/20；三份最低检测限样本至少一份为阳性。在实施例1和12的结果中，阴性国家参考品符合率达到20/20；阳性国家参考品结果符合率达到20/20；6份最低检测限样本有至少3份为阳性。即实施例1和实施例12试剂盒测定结果完全符合HIV抗体试剂国家标准品的要求。\n[0224] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。