农业废弃物的快速堆肥菌剂及其生产有机肥的方法

1.一种高温纤维素分解真菌，该菌株NJZ5属于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，2009年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.3309，主要生物学特性为：菌丝有隔，分生孢子梗光滑，带绿色，顶端膨大成球状，上面着生单层瓶状小梗，瓶状小梗上产生孢子；分生孢子球形，有刺，绿色。
2.用权利要求1所述菌株NJZ5生产的农业废弃物堆肥菌剂。
3.权利要求2所述农业废弃物堆肥菌剂的生产方法，包括：
1)菌剂发酵
将权利要求1所述的菌株NJZ5接种到PDA液体培养基中摇瓶培养，进行液体发酵，其发酵生产的条件为：初始pH范围为5.0～6.0，培养温度35～40℃，装液量为培养容器体积的20～50％，摇床转数为170转/分钟，时间12h；
采用负压接种法将菌种接种到1吨的发酵罐中，发酵罐中的培养基为PDA液体培养基，发酵温度保持在37℃，pH稳定在5～6之间，搅拌转数保持在100～120转/分钟，通气量每分钟体积比为0.5，当菌株大量形成孢子，发酵液中可培养菌落数，即孢子和菌丝体数≥1×109个/ml时停止发酵，获得发酵液；
2)菌种吸附
将可培养菌落数≥1×109个/ml的发酵液与菌种吸附剂米糠按体积质量比1∶10-3∶10在搅拌机内进行混匀吸附搅拌，混合均匀后即获得农业废弃物的快速堆肥菌剂产品，该产品中NJZ5菌株以可培养菌落计含量≥1×108个/克。
4.根据权利要求3所述农业废弃物堆肥菌剂的生产方法，其特征在于，
步骤1)摇瓶培养所用PDA液体培养液配制方法为，以配制1L的量为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过纱布过滤后向滤液中加20g葡萄糖，定容至1000ml，pH值调至5.0-6.0，115℃灭菌20min；
发酵罐中所用PDA液体培养基配制方法为，以配制1L的量为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经纱布过滤后向滤液中加10g淀粉，10g蔗糖，定容至1000ml，pH值调至5.0～6.0，121℃灭菌20min。
5.权利要求2-4之一所述农业废弃物堆肥菌剂的应用。
6.权利要求2-4之一所述农业废弃物堆肥菌剂用于生产有机肥的方法，包括：
1)原材料的建堆与接种：
将米糠与稻草粉按体积比2∶1混合后作辅料，再将畜禽粪便与辅料以质量比75∶25的比例混合，然后按照质量比1-2‰的接种量接入含可培养菌落数量≥1×108个/克的堆肥菌剂，混匀后建成宽2m、高1.5m、长50m的条垛式堆肥堆；
2)堆肥管理：
用温度计测定堆体中层即0.6～0.7m深处的温度，中层温度大于50℃时进行翻堆，堆制15-20天；
3)堆肥后熟
将堆肥堆积在一起，在通风阴凉处堆放约1-2个月，待堆肥完全腐熟，即含水率为30～35％，发芽指数GI指数大于95％，然后通过LY50型筛选机将堆肥进行分筛得到≤1cm的有机肥颗粒包装。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所生产的有机肥经过高温堆肥后有机肥的含水率在30～35％，全氮含量质量比为1.43％，全氮中质量比90％以上为有机氮，最后的C/N在18～20。

一、技术领域\n本发明涉及农业废弃物快速堆肥菌剂及其生产有机肥的方法，属于废弃物资源化利用技术领域，可专用于禽畜粪便的快速资源化处理。\n二、背景技术\n畜禽粪便的有机质丰富，含有氮、磷、钾、微量元素和腐殖质等多种植物营养成分，可以用作制造优质、高效的有机(类)肥料的原料(包括：有机肥、有机无机复混肥、微生物有机肥)。目前，我国排放的畜禽粪便中氮、磷、钾的总贮量约为0.63亿t，相当于0.49亿t尿素，1.19亿t过磷酸钙和0.34亿t氯化钾。因此畜禽粪便是一种可以开发利用的资源。\n现代畜牧业日益集约化，所产生的废弃物与传统畜牧业产生的废弃物截然不同。传统畜牧业产生的废弃物量小、分散，易于就地处理，不致于对环境有明显的影响；现代畜牧业产生的废弃物量大、集中，通常很难用一般的方法处理，对环境造成很大威胁。\n如何对畜禽粪便实现综合利用，在消除畜禽粪便对环境污染的同时，使其得以资源化利用，并在生态系统的水平上实现物质、能量流动的良性循环，已成为这是众多学者研究的热点。畜禽粪便处理技术经过多年的实践与发展，已日趋成熟。国内外对畜禽粪便进行处理的方法很多，而且随着科技的进步和发展，大量的新技术、新方法不断出现。目前处理方法通常可分为三类：干燥法、化学处理法、生物处理法。\n将畜禽粪便等废弃物制作的优质有机堆肥制成高附加值的肥料产品是促进畜禽粪便等固体有机废弃物资源化产业的市场驱动力。微生物有机肥料与生物肥料(菌种含量高但有机物很少，仅作为一种接种剂)不是一个概念，但由于生物肥料单独施用时，缺乏足量的有机物给功能微生物提供能量，很难与土著微生物形成竞争优势，从而影响了这些功能微生物在土壤中定植和功能的发挥，这就是生物肥料效果不明显和不稳定的根本原因。\n而微生物有机肥料克服了生物肥料的这一缺点，这些肥料应用于农业生产中，不仅能获得特定的肥料效应，而且通过足量的有机物质给功能微生物提供足够的能量，使它们在土壤中易于定植，充分发挥其促进作物对营养元素的吸收、刺激植物生长、拮抗某些土传病原微生物等作用。\n三、发明内容\n1.技术问题\n本发明的目的在于研制一种能使各种农业废弃物快速腐熟并生产有机肥的技术，废弃物快速处理可以解决我国当前土地紧张问题(各种废弃物的堆积需要大量的土地)，也解决了废弃物乱堆乱放带来的环境污染问题，同时生产高附加值产品，确保集约化农业的顺利发展。\n2.技术方案\n一种高温纤维素分解真菌，该菌株NJZ5属于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，2009年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.3309，主要生物学特性为：菌丝有隔，分生孢子梗光滑，带绿色，顶端膨大成球状，上面着生单层瓶状小梗，瓶状小梗上产生孢子；分生孢子球形，有刺，绿色。\n上述菌株NJZ5用于生产农业废弃物堆肥菌剂的方法，包括：\n1)菌剂发酵\n将所述的菌株NJZ5接种到PDA液体培养基中摇瓶培养，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为5.0～6.0，培养温度35～40℃，装液量为培养容器体积的20～50％，摇床转数为170转/分钟，时间12h；\n采用负压接种法将菌种接种到1吨的发酵罐中，发酵罐中的培养基为PDA液体培养基，发酵罐上罐体温度保持在37℃，pH稳定在5～6之间，搅拌转数保持在100～120转/分钟，通气量每分钟体积比为0.5，当菌株大量形成孢子，发酵液中可培养菌落数(孢子+菌丝体)≥1×109个/ml时停止发酵，获得发酵液；\n摇瓶培养所用PDA液体培养液配制方法为，以配制1L的量为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过纱布滤后向滤液中加20g葡萄糖，定容至1000m1，pH值调至5.0-6.0，115℃灭菌20min；\n发酵罐上所用PDA液体培养基配制方法为，以配制1L的量为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经纱布过滤后向滤液中加10g淀粉，10g蔗糖，定容至1000ml，pH值调至5.0～6.0，121℃灭菌20min。\n2)菌种吸附\n将液体发酵液与米糠按体积质量比1∶10-3∶10在搅拌机上进行混匀吸附，混匀后获得农业废弃物的快速堆肥菌剂固体产品，其中可培养菌落数(孢子+菌丝体)≥1×108个/克。\n上述农业废弃物堆肥菌剂用于生产有机肥的方法，包括：\n1)原材料的建堆与接种：\n将米糠与稻草粉按体积比2∶1混合后作辅料，再将农业废弃物与辅料以质量比75∶25的比例混合，然后按照质量比1-2‰的接种量接入含可培养菌落数(孢子+菌丝体)≥1×108个/克的固体堆肥菌剂，混匀后建成宽2m、高1.5m、长50m的大堆，形成条垛式堆肥；\n2)堆肥管理：\n用温度计测定堆体中层即0.6～0.7m深处的温度，中层温度大于50℃时进行翻堆，堆制15-20天；\n3)堆肥后熟\n将堆肥堆积在一起使其进入后熟阶段，在通风阴凉处堆放约1-2个月，待堆肥完全腐熟即含水率在30～35％左右，发芽指数GI指数大于95％。然后通过LY50型筛选机将堆肥进行分筛后包装。\n上述方法专用于禽畜粪便的快速处理并资源化问题。用禽畜粪便所生产的有机肥经过高温堆肥后绝大部分的植物病原微生物被杀死，有机肥的含水率在30～35％，全氮含量为1.43％，全氮中质量比90％以上为有机氮，最后的C/N在18～20。\n3.有益效果\n本发明是一种能将禽畜粪便等农业废弃物快速处理并生产有机肥的方法，利用各种禽畜粪便和辅料，接种高效的菌剂再结合一体化的堆肥技术制成有机肥料，其方法和产品与传统的堆肥有以下的优势：\n1)以菌株NJZ5制备的禽畜粪便堆肥起爆剂(堆肥菌剂)，可实现堆肥的快速升温，缩短堆制时间，与常规堆肥比较可以缩短20～45天，大大加快了禽畜粪便的处理进程。\n2)利用该发明生产的有机肥含有丰富的有机质(含量30～35％)，同时由于堆肥周期短(可以控制在15-25天)，氮素的损失比常规的堆肥少了很多，总N量可以达到2～4％，是一种优质的有机物料载体，可进一步用于高附加值产品的生产。\n3)该发明生产的有机肥，是纯有机类肥料，它重金属含量低，养分含量高，堆肥发芽指数在95％以上，对作物无任何毒害作用，施用后不仅可以减少化肥的使用量，而且可以改善土壤的结构，同时不会污染环境，还可为农民节省开支，有利于农产品的出口，有机肥料配合化肥的使用还有增产功能，可为农民增加收入。\n四、附图说明\n图1：菌株NJZ5的形态\n图2：菌株NJZ5的菌落\n图3：菌株NJZ5液体产酶曲线\n图4：菌株NJZ5固体产酶曲线\n图5：堆肥建堆示意图\n图6：堆肥的过程中不同层次的温度变化曲线\n五、具体实施方式\n(一)菌株的分离和鉴定\n高温腐熟微生物菌株NJZ5分离自高温堆肥。NJZ5为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，主要生物学特性为：菌丝有隔，分生孢子梗光滑，带绿色，顶端膨大成球状，上面着生单层瓶状小梗，瓶状小梗上产生孢子；分生孢子球形，有刺，绿色。\n(二)菌剂与有机肥的生产\n1)将菌株接种到500ml三角瓶装的100ml PDA液体培养基中摇瓶培养，培养条件为：初始pH范围为5.0～6.0，培养温度35～40℃，装液量为培养容器体积的20～50％，摇床转数为170转/分钟。培养12h后将培养液再接种到10L三角瓶装的1L PDA液体培养基中过夜培养，作为发酵罐发酵的种子液。摇瓶培养所用PDA液体培养基配制方法为，以配制1L的量为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过纱布滤后滤液中加20g葡萄糖，定容至1000ml，pH值调至5.0-6.0，115℃灭菌20min；\n然后采用负压接种法将菌种接种到1吨的发酵罐中，发酵罐中的培养基为PDA液体培养基，发酵罐温度保持在37℃，pH稳定在5～6之间，搅拌转数保持在100～120转/分钟，通气量为0.5(V/V·min)，当发酵液中可培养菌落数(孢子+菌丝体)≥1×109个/ml时停止发酵。发酵罐上所用PDA液体培养基配制方法为，以配制1L的量为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经纱布过滤后滤液中加10g淀粉，10g蔗糖，定容至1000ml，pH值调至5.0～6.0，121℃灭菌20min。\n2)菌种的吸附：当发酵结束以后，将含可培养菌落数(孢子+菌丝体)≥1×109个/ml的液体发酵液与菌种吸附剂米糠按1∶10(V/M)在搅拌机上进行混匀吸附，混匀后获得农业废弃物的快速堆肥菌剂产品，菌剂产品中含可培养菌落数(孢子+菌丝体)≥1×108个/克，以每袋25kg进行真空包装，贮存于阴凉干燥处备用。\n(三)产酶试验\n1)培养基\n液体产酶培养基：CMC-Na 15g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 1.0g，蛋白胨1.0g。\n固体产酶培养基：碱处理并切碎的稻草粉5g，然后与无机盐溶液混合，调节含水率在60-70％，(无机盐溶液为：(NH4)2SO4 3.5g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2 0.5g，水1000ml，pH自然)。\n2)产木质纤维素酶及其优化实验\n先将NJZ5接种到PDA斜面上，50℃条件下培养5天，使其产生大量的孢子，然后用无菌水冲洗菌落，用两层无菌纱布过滤，最后用血球计数板计孢子数量，加无菌水稀释到孢子数量为10-6～10-7为宜，制成孢子悬液，置于4℃冰箱备用。\n液体产酶：取上述制备好的孢子悬液2ml，接种到液体产酶培养基上，使其在50℃的水浴摇床150r/min培养10天，每天取样一次，测定纤维素酶活，液体产酶见图3。随着培养时间的增加，羧甲基纤维素酶和滤纸酶活都呈现先增大后减小的趋势，在第六天达到最大值，分别为55.8U·ml-1、12.2U·ml-1，随后开始急剧的下降，到第十天时纤维素酶活与开始时几乎相同。\n固体产酶：取制备好孢子悬液2ml接种到不同处理的固体发酵培养基中，于50℃的恒温培养箱中静置培养，每天取样直到酶活力降到与开始几乎相同时停止培养，固体产酶见图4。从图中可以看出在固体发酵条件下，NJZ5的产酶明显高于液体条件下的产酶，随着培养的进行，其酶活力也似呈现先增加后减小的趋势，并且在第4天达到最大，Cmcase达到526.3U·g-1、FPA可以达到144.6U·g-1，随后酶活力下降，但是下降的速度没有在液体培养条件下快。\n产酶优化：各种纤维素基质先用碱处理后烘干，磨碎并过40目筛后备用。先研究不同的碳源，氮源、含水量、培养温度、以及初始pH对菌株产酶的影响，在此基础上利用正交实验来优化NJZ5产酶条件，得到NJZ5的最佳产酶条件，正交实验表1。\n表1菌株的固体产酶正交试验\n\n通过固体发酵的正交试验得出，6号实验得到最佳的酶活力，即50℃、80％含水率、4.0的初始pH和7％的接种量(孢子数量为10-6～10-7的孢子悬液)为菌株的最佳的产酶条件。在这个条件下，CMCase的平均酶活力为526.3U·g-1，FPA的平均酶活力为144.6U·g-1。正交试验的R值显示，不同条件对CMCase的影响是A＞D＞B＞C，不同条件对FPA的影响是B＞A＞C＞D。\n(四)生产堆肥试验\n1)接种与建堆：在江阴联业生物科技有限公司进行实地原位堆肥，将禽畜粪便与辅料(米糠和稻草粉比例为2∶1)以质量比75∶25的比例混合，虽然初始pH4.0是最佳的产酶条件，但是在pH 6-7菌株也可以分解木质纤维，考虑到成本问题，所以将pH调节在6-7，同时将吸附好的含可培养菌落数≥1×108个/克的固体堆肥菌剂按照1‰的接种量进行接种，用LY100型混合搅拌机(江阴联业生物技术有限公司)将堆肥基质、辅料以及菌种进行混合均匀，以不接种菌剂的堆肥为对照，将混合好的原料建成宽2.5m、高1.2m、长5m的大堆，进行条垛式堆肥，如图5所示。\n2)堆肥管理：在堆肥的过程中注意密切跟踪堆肥的进程，其中温度和含水率是堆肥进程中最重要的指标，用温度计分层次(上层：0.1～0.3m，中层0.6～0.8m，底层1.1-1.3m)测定堆体的温度，利用高温烘干失重法测定堆肥的含水率。中层0.6～0.8m温度大于50℃时用LY280型翻抛机(江阴联业生物技术有限公司)进行翻堆，该翻抛机集翻堆、曝气、粉碎于一体，并在0、3、7、10、14、18、21、28天取混合样分析，对各种参数进行测定分析。\n图6中表示的是在堆肥的过程中不同层次的温度变化曲线，起伏处为翻堆的时间点。从图中可以看到接种菌剂的处理比不接菌剂的对照处理每个层次的温度都要高，而且翻堆后温度的恢复时间要比对照快，说明接种菌剂以后可以明显促进堆体温度的提高，增强堆体微生物群落的代谢速率，使得堆体提前进入高温期；而且在稳定期，表现出同样的趋势，稳定期是各种物质降解的关键时期，温度的高低直接反应了堆肥体系中能量代谢强度。\n表2表示的是加菌处理与不加菌对照的有机碳、全N以及C/N的变化情况。从表中可以得到，在添加堆肥菌剂以后，堆肥的有机碳的下降速度比同期的对照要快很多，碳是堆肥材料的最重要的组成部分，在添加堆肥菌剂后，碳的分解速度明显加快；氮素也是堆肥过程中比较重要的代谢营养元素，从表2中可以得出对照的总氮量要比同期的加菌剂的处理要高，可能的原因有，一方面加菌剂处理的温度要比对照要高，氨挥发要高于对照，对照里面的氮素代谢要慢，很多的有机态氮还没有分解；C:N是堆肥过程中比较重要的一个指标，有文献将其作为堆肥腐熟的标准之一，一般堆肥的起始的C:N为30～35％为最佳的配料比，而经过高温堆肥后当后表示基本腐熟，从表2中数据可看出，加菌剂处理堆肥第28天C:N为18.3％，明显比对照提前进入腐熟阶段。\n表2不同处理有机碳、全N以及C/N的变化\n\n3)堆肥后熟\n堆制15-25天后，将堆肥堆积在一起，在通风阴凉处堆放约1-2个月，使其进入后熟阶段，待堆肥完全腐熟即含水率在30～35％左右，发芽指数GI指数大于95％后通过LY50型(江阴联业生物技术有限公司)筛选机将堆肥进行分筛后包装。\n上述用禽畜粪便所生产的有机肥经过高温堆肥后绝大部分的植物病原微生物杀死，有机肥的含水率在30～35％，全氮含量为1.43％，全氮中质量比90％以上为有机氮，最后的C/N在18～20。\n用作物秸秆等农业废弃物代替上述禽畜粪便时，先将作物秸秆等农业废弃物粉碎，再用LY100型混合搅拌机将堆肥基质、辅料以及菌种进行混合，然后按图5进行堆制。即达到利用能够高温生长并高产木质纤维素酶进行原位堆肥，让其对农业废弃物中的木质纤维素进行原位分解的目的。