定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条、制备方法及其应用

1.定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条组件，其特征在于：它包括荧光试纸条、铕标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体试剂和样品反应瓶，其中：所述荧光试纸条包括纸板，纸板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述的检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述的检测线上包被辣椒素类物质包被抗原；所述抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.根据权利要求1所述的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条组件，其特征在于：所述铕标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将铕标记试剂活化后与抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体混合，震荡过夜，即得目标产物铕标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条组件，其特征在于：所述铕标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的制备方法：将铕标记试剂超声分散在硼酸缓冲液中，加入EDC振荡活化，离心，去除上清液，加入硼酸缓冲液振荡混匀，超声分散，然后加入抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体，混匀，摇床震荡过夜，离心去除未结合部分，然后加入OVA封闭铕标记试剂表面多余的结合位点，得目标产物铕标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条组件，其特征在于：所述的辣椒素类物质包被抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：
Pr载体蛋白，所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH。
5.根据权利要求1所述的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条组件，其特征在于：所述定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条组件还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为质量体积分数为0.01～0.30％的吐温-20，质量体积分数为0.5～1.5％蔗糖和质量体积分数为0.1～1％卵清蛋白的水溶液；
所述荧光试纸条中的吸水垫长35～45mm，宽3～5mm；检测垫长23～28mm，宽3～5mm；样品垫长10～15mm，宽3～5mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述荧光试纸条中检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为5～10mm，质控线和检测线的间距为5～10mm。
6.根据权利要求1所述的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条组件，其特征在于：所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的辣椒素类物质包被抗原包被量为0.125～0.6μg；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg；
所述样品反应瓶中铕标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的含量为
0.31～0.53μg。
7.根据权利要求1所述的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条组件，其特征在于：所述的荧光试纸条的制备步骤如下：
(1)将吸水纸剪裁得吸水垫；
(2)检测垫的制备：
将辣椒素类物质包被抗原配制成浓度为0.2～1.0mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.125～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.15～1.0mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；
(3)样品垫的制备：
将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6～12小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
(4)荧光试纸条的组装：
在纸板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得荧光试纸条。
8.根据权利要求1所述的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条组件，其特征在于：所述荧光试纸条的制备中配制辣椒素类物质包被抗原的包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白
0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；
所述荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有十二水磷酸氢二钠2.9g，二水合磷酸二氢钠0.3g，吐温(Tween)-20  1.0g，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30 1.0g，EDTA0.25g，牛血清白蛋白BSA 0.5g，叠氮钠0.02g。
9.权利要求1所述的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条组件在辣椒素类物质定量检测中的应用：将铕标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体加入样品反应瓶中，然后加入待测样品溶液后，混匀，将荧光试纸条插入样品反应瓶中，使得一部分样品垫浸入液体中，37℃反应10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光试纸条上检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值；基于预先获得的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值与辣椒素类物质浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中辣椒素类物质的含量，最后经换算即得待测样品中辣椒素类物质的含量。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值与辣椒素类物质浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：
(1)配制得到一系列浓度的辣椒素类物质标准品溶液；
(2)将适量上述各浓度的辣椒素类物质标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，加入样品反应瓶中，混匀，将荧光试纸条插入样品反应瓶中，37℃反应10分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各荧光试纸条上检测线和质控线的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值；
(3)经拟合得到荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值与辣椒素类物质浓度的关系曲线。

定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条、制\n备方法及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条、制备方法及其应用。\n背景技术\n[0002] 辣椒素类化合物是使辣椒具有辛辣刺激的主要化学物质，其成分主要包括辣椒素、二氢辣椒素、高二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高辣椒素等化合物。其中辣椒素和二氢辣椒素约占辣椒素类物质总量的90％，并提供了约90％的辣热感刺激。合成辣椒素具有与天然辣椒素类似的结构部和功能，且在价格和辣度上比天然辣椒素更占优势，也被广泛应用于医药、杀虫剂、防污涂料、军事武器等领域。除了赋予食品辛辣味被用作调味品以外，辣椒素类物质还具有消炎镇痛、抗病菌、抗肿瘤作用，能促进脂肪燃烧、降低血脂，抑制胃酸分泌、对胃黏膜损伤有保护作用等药用价值。农药领域，辣椒素类物质被认为是一种理想的无公害农药，已有报道被应用于水果、蔬菜、谷物等作物上，免除了耐药性及残留检验。在轻工业领域可被用于高档特种防污涂料，防止海洋水生物对船体的附着；用于电缆材料中以驱赶老鼠啃咬等。在医药领域，辣椒素类物质的药物动力学研究离不开对动物组织及血清样品中辣椒素类物质的检测。此外还有报道指出，辣椒素类物质被可作为兴奋剂的主要成分，被非法应用于各种竞技赛事中，特别是赛马活动中。因此，样品中辣椒素类物质分析测定方法的研究对辣椒素类物质的规范使用及其安全评价意义重大。\n[0003] 现有的辣椒素类物质分析检测方法主要是精密仪器分析法，主要包括高效液相色谱法、色谱-质谱联用，这些方法灵敏度高，准确性好，但存在仪器昂贵，要求辣椒素类物质样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高等不足，难以实现快速检测，并且，要测得辣椒素类物质总量，需要计算各种辣椒素类物质的含量之和。近年来迅速发展起来的免疫分析方法由于克服了上述方法的缺点，并具有特异性强、灵敏度高、分析容量大、方便快捷、成本低廉、适于现场批量检测等优点，被广泛应用于医学、农学等各个领域。\n发明内容\n[0004] 本发明所要解决的问题是提供一种定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条、制备方法及其应用。\n[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：\n[0006] 定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条，其特征在于：它包括荧光试纸条、铕标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体试剂和反应瓶，其中：所述荧光试纸条包括纸板，纸板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述的检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述的质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述的检测线上包被辣椒素类物质包被抗原；所述抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株分泌产生。所述的杂交瘤细胞株YQQD8已于\n2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201534。\n[0007] 按上述方案，所述铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将铕标记试剂活化后与抗辣椒素类物质单克隆抗体震荡过夜，即得目标产物铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体。\n[0008] 按上述方案，所述铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体的制备方法：将铕标记试剂超声分散在硼酸缓冲液中，加入EDC振荡活化，离心，去除上清液，加入硼酸缓冲液振荡混匀，超声分散，然后加入抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体，其中铕标记试剂与抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的质量比为1:(0.04-0.3)，混匀后，摇床震荡过夜，离心去除未结合部分，然后加入OVA封闭铕标记试剂表面多余的结合位点，得目标产物铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体。\n[0009] 按上述方案，所述的辣椒素类物质包被抗原的分子结构式如式Ⅱ所示：\nPr载体蛋白。\n[0010] 按上述方案，所述载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白OVA或钥孔血蓝蛋白KLH，优选为卵清白蛋白OVA。\n[0011] 按上述方案，所述荧光试纸条中的吸水垫长35～45mm，宽3～5mm；检测垫长23～\n28mm，宽3～5mm；样品垫长10～15mm，宽3～5mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述荧光试纸条中检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为5～10mm，质控线和检测线的间距为5～10mm。\n[0012] 按上述方案，所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的辣椒素类物质包被抗原包被量为0.125～0.6μg；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg；所述反应瓶中铕标记的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的含量为\n0.31～0.53μg。\n[0013] 按上述方案，所述的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为质量体积分数为0.01～0.30％的吐温-20，0.5～1.5％蔗糖和0.1～1％卵清蛋白(OVA)水溶液。\n[0014] 按上述方案，所述的荧光试纸条的制备步骤如下：\n[0015] (1)将吸水纸剪裁得吸水垫；\n[0016] (2)检测垫的制备：\n[0017] 将辣椒素类物质包被抗原配制成浓度为0.2～1.0mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需辣椒素类物质包被抗原的包被量为0.125～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；\n[0018] 将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.15～1.0mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.1～0.6μg，然后于37℃条件下干燥30～60分钟；\n[0019] (3)样品垫的制备：\n[0020] 将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6～12小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；\n[0021] (4)荧光试纸条的组装：\n[0022] 在纸板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得荧光试纸条。\n[0023] 按上述方案，所述荧光试纸条的制备中配制辣椒素类物质包被抗原(4-[(4-羟基-\n3-甲氧基)苄胺基]-4-羰基羧酸-OVA)包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；\n[0024] 配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；\n[0025] 所述荧光试纸条的制备中使用的封闭液为：每100mL中含有十二水磷酸氢二钠\n2.9g，二水合磷酸二氢钠0.3g，吐温(Tween)-201.0g，聚乙烯吡咯烷酮(PVPK-30)1.0g，EDTA0.25g，牛血清白蛋白BSA0.5g，叠氮钠0.02g。\n[0026] 上述的时间分辨荧光免疫层析试纸条在辣椒素类物质定量检测中的应用：将铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体加入样品反应瓶中，然后加入待测样品溶液后，混匀，将荧光试纸条插入样品反应瓶中，使得一部分样品垫浸入液体中，37℃反应10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光试纸条上检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值；基于预先获得的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值与辣椒素类物质浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中辣椒素类物质的含量，最后经换算即得待测样品中辣椒素类物质的含量。\n[0027] 按上述方案，所述的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与辣椒素类物质浓度的关系曲线是采用以下方法得到的：\n[0028] (1)配制得到一系列浓度的辣椒素类物质标准品溶液；\n[0029] (2)将适量上述各浓度的辣椒素类物质标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，加入样品反应瓶中，混匀，将荧光试纸条插入样品反应瓶中，37℃反应10分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各荧光试纸条上检测线和质控线的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值；\n[0030] (3)经拟合得到荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值与辣椒素类物质浓度的关系曲线。\n[0031] 本发明提供的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条可用于定量检测辣椒素类物质的含量，且操作简单、快速、准确度高。\n附图说明\n[0032] 图1为本发明提供的定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条中荧光试纸条的结构示意图。图中：1样品垫、2检测垫、3检测线、4质控线、5吸水垫。\n[0033] 图2为本发明合成的辣椒素类物质通用人工完全抗原紫外光谱图。\n[0034] 图3本发明合成的辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原紫外光谱图。\n具体实施方式\n[0035] 实施例1抗辣椒素类物质单克隆抗体的获得\n[0036] 抗辣椒素类物质单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201534的杂交瘤细胞株YQQD8分泌产生的单克隆抗体，具体制备方法：\n[0037] 将杂交瘤细胞株YQQD8注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，\n12000r/min离心30min，吸取上清，将所得腹水上清与3倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h以上；4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，冰浴条件下缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的\n0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素总量单克隆抗体，将抗体冻干粉置-20℃冰箱中备用；\n[0038] 所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的\n0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。\n[0039] 用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株YQQD8分泌的抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体的亚型为IgG1。\n[0040] 用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得YQQD8的鼠腹水抗体的效价可达\n2.56×106，即鼠腹水抗体稀释2.56×106倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对辣椒素类物质的50％抑制浓度IC50为5.8ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的50％抑制浓度IC50依次为8.5ng/mL、5.0ng/mL、13.5ng/mL，对辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的交叉反应率范围为62.9％-170％。\n[0041] 杂交瘤细胞株YQQD8的获得：\n[0042] a辣椒素类物质通用人工免疫抗原的制备\n[0043] 辣椒素类物质通用人工半抗原的制备：\n[0044] 称取香兰素胺盐酸盐0.28g溶于6ml四氢呋喃，搅拌滴加0.15g三乙胺，室温搅拌\n30min。准确称取丁二酸酐0.15g(0.0015mol)加入上述反应液中，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL乙酸乙酯室温搅拌2min，过滤后所得沉淀即为半抗原为4-[(4-羟基-3-甲氧基)苄胺基]-4-羰基羧酸(4-[(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino]-4-oxobutanoic acid)，分子式为C12H15NO5。\n[0045] 经核磁鉴定结果为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.17(s,1H),8.87(s,1H),8.31(d,J＝6.0Hz,1H),4.21(d,J＝5.8Hz,2H),3.80(s,3H),2.52(t,J＝6.9Hz,2H),2.42(t,J＝\n6.7Hz,2H)。与其结果的理论值一致，表明该半抗原化合物成功合成。\n[0046] 辣椒素类物质通用人工完全抗原-免疫抗原的制备\n[0047] 称取上述辣椒素类物质通用人工半抗原20.3mg(约0.08mmol)和11.6mg(约\n0.1mmol)NHS于反应瓶中，加入400ulDMF溶解于反应瓶中，室温搅拌30min，称取20.6mg(约\n0.1mmol)DCC溶于100ulDMF中，将DCC/DMF溶液逐滴滴加至上述反应瓶，室温搅拌4h，4℃静置过夜。8000rpm/5min，取上清活泼酯液。\n[0048] 将上清活泼酯液，逐滴滴加到6ml 7mg/ml的BSA溶液中反应，反应缓冲液为0.2M pH8.0的磷酸盐缓冲液。反应在磁力搅拌下室温进行4h。将反应液置透析袋内，用0.01M pH7.4的PBS中4℃搅拌透析，每4h更换一次透析液，共透析72h。即得到辣椒素人工抗原-免疫抗原。紫外-可见光谱连续扫描图谱见图1，鉴定结果表明人工抗原偶联成功。\n[0049] 辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原的制备\n[0050] 称上述辣椒素类物质通用人工半抗原4.55mg溶于200μL无水DMF中,然后按顺序加入4.27μL三正丁胺、2.34μL氯甲酸异丁酯,室温下搅拌反应1h，得活化的辣椒素类物质半抗原溶液。\n[0051] 将活化的辣椒素类物质半抗原溶液逐滴滴加到10ml 4.5mg/ml的OVA溶液中反应，反应缓冲液为0.2M pH8.0的磷酸盐缓冲液。反应在磁力搅拌下室温进行4h。将反应液置透析袋内，用0.01M pH7.4的PBS中4℃搅拌透析，每4h更换一次透析液，共透析72h。即得到辣椒素人工抗原-包被抗原。紫外-可见光谱连续扫描图谱见图3，鉴定结果表明人工抗原偶联成功。\n[0052] b杂交瘤细胞株YQQD8的制备\n[0053] 1.动物免疫\n[0054] 购买7周龄BALB/c小鼠5只，免疫上述辣椒素类物质人工抗原-免疫抗原。第一次免疫将免疫抗原与等体积快免佐剂QuickAntibody-Mouse5W(购自北京博奥龙生物技术有限公司)迅速混匀后，于小鼠后腿小腿肌肉注射免疫小鼠。第21天、42天分别按同样方式加强免疫。3次免疫所用免疫抗原的剂量相同，均为每鼠12.5μg。每次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第3次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，加强免疫时，采用小鼠腹腔注射峰方式，免疫抗原的用量为之前的2倍，不需要用佐剂混合。\n[0055] 2.细胞融合\n[0056] 于最后一次加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为\n1500)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以约5-10︰1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50％PEG融合，融合1分钟，然后加满RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，用\n72mLRPMI-1640完全培养液将小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞重悬，将重悬细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置37℃二氧化碳培养箱培养，所述的RPMI-\n1640完全培养液含有20％(体积百分数)胎牛血清，10％(体积百分数) 培养基和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT；半固体RPMI-1640完全培养基是指，在RPMI-1640完全培养液中加入1％(质量百分数)的甲基纤维素。上述SP2/0购于上海泛柯生物科技有限公司； 培养基购于北京博奥龙免疫技术有限公司；RPMI-\n1640基础培养液购于Hyclone公司；1％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT购于Sigma-Aldrich公司。\n[0057] 3.细胞株的筛选及克隆\n[0058] 待96孔板上的细胞集落长到占孔底1/2大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗辣椒素而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用辣椒素作为竞争原，与固定在ELISA板上的抗原竞争性的结合上清中的抗体，其中与辣椒素结合的抗体将会在之后的步骤被洗掉，与包被抗原结合的抗体则被固定在ELISA板上，加入HRP标记的羊抗鼠抗体及显色液后则会显色。竞争原辣椒素浓度越高，显色越浅，450nm处的吸光度值越低。选择未加竞争原时吸光值较高和灵敏度均较高的孔(此处吸光值较高指，竞争原为0的孔所测得吸光值，灵敏度较高指抑制率为\n50％时的竞争原浓度IC50值较小)。采用半固体培养基进行亚克隆细胞的培养，克隆后待细胞集落长至肉眼可见大小时，分别将每个细胞集落挑至液体培养基中，采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆1次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株YQQD8。该细胞株YQQD8已于2015年4月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C201534，分类命名为杂交瘤细胞株YQQD8。\n[0059] c抗辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株系YQQD8抗体可变区序列测定\n[0060] (1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株系YQQD8的总RNA；\n[0061] (2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)15为引物，按照SuperScriptTM-2Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)15由Invitrogen购得；\n[0062] (3)PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、55℃45s、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5，-GAV GTG AWG STG GTG GAG TC-3，(20mer)和5，-GAG GAG ACG GTG ACT GAG GT-3，(20mer)其中S、R和W为简并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，轻链可变区引物为\n5，-RTT KTG ATG ACC CAR AC-3，(17mer)和5，-ACG TTT KAT TTC CAG CTT GG-3，(20mer)。\n[0063] 得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长313bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由104个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长299bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由99个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。\n[0064] 实施例2：定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其制备[0065] 定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条，它包括荧光试纸条、含有铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体、反应瓶、样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，其中：吸水垫长38mm，宽3.8mm；检测垫长25mm，宽3.8mm；样品垫长15mm，宽3.8mm。所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，其包被量为0.25μg/cm质控线，所述检测线上包被辣椒素类物质包被抗原即上述的辣椒素类物质通用人工完全抗原-包被抗原，其包被量为0.4μg/cm检测线，检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为9mm，质控线和检测线的间距为8mm。\n[0066] 所述荧光试纸条的获得：\n[0067] (1)吸水垫的制备\n[0068] 将吸水纸剪裁成长38mm，宽3.8mm的规格，即得吸水垫；\n[0069] (2)检测垫的制备\n[0070] 检测线的包被：\n[0071] 将辣椒素类物质包被抗原用包被缓冲液配制成浓度为0.5mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿9mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需包被抗原的包被量为0.4μg，然后于37℃条件下干燥60分钟；\n[0072] 所述的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠\n0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；\n[0073] 质控线的包被：\n[0074] 将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.25mg/mL的包被液；于距检测线\n8mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.25μg，然后于37℃条件下干燥2小时；\n[0075] 所述的包被缓冲液为：\n[0076] 每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；\n[0077] 所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽3.8mm。\n[0078] (3)样品垫的制备：\n[0079] 将玻璃纤维膜剪裁成长15mm，宽3.8mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；\n[0080] 所述的封闭液为2.9g十二水磷酸氢二钠，0.3g二水合磷酸二氢钠，1.0g Tween-\n20，1.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVPK-30)，0.25g EDTA，0.5g牛血清白蛋白BSA，0.02g叠氮钠，加水定容至100mL所得；\n[0081] (4)荧光试纸条的组装：\n[0082] 在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得荧光试纸条。\n[0083] 所述铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体的获得：\n[0084] 取0.2mol/L pH 8.18的硼酸缓冲液800μL，加入200μL铕标记试剂(粒径100nm，固形物含量1％)，振荡混匀。用800W超声清洗仪，超声10min。加入40μL 15mg/mL EDC溶液，振荡混匀15min。14000r/min，10℃，离心10min，去上清液，加入1mL硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min。加入80μg辣椒素类物质单克隆抗体，混匀，250r/min、25℃下摇床过夜。再次离心去上清，加入1mL含0.5％OVA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min，25℃下摇床2h，得目标产物铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体。上述铕标记试剂可购于上海优你生物科技有限公司，但不限于此。\n[0085] 上述的时间分辨荧光免疫层析试纸条在辣椒素类物质定量检测中的应用：\n[0086] Ⅰ荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与辣椒素类物质浓度的关系曲线的建立：\n[0087] (1)对经高效液相色谱法(HPLC)检测为辣椒素类物质为阴性的balb/c小鼠血清样品检测液进行辣椒素类物质加标，配得62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.8125ng/mL、3.90625ng/mL、1.95313ng/mL、0.97656ng/mL和0ng/mL的辣椒素类物质标准品溶液，其中辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的比例为1:1:1；\n[0088] (2)将上述铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体用样品缓释液稀释100倍后，取18μL(约0.37μg标记探针)放于300μL反应瓶中，所述的样品稀释液为质量体积分数为0.01～\n0.30％的吐温-20，0.5～1.5％蔗糖和0.1～1％卵清蛋白(OVA)水溶液。\n[0089] 取上述各浓度的辣椒素类物质标准品溶液各180μL，分别加入到含有铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体的样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟，用吸水纸吸干样品垫残留液体，即刻用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长：365nm，测定波长：615nm)得到各荧光试纸条上检测线处(T)和质控线(C)处的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)；\n[0090] (3)以辣椒素类物质浓度为横坐标，各浓度的辣椒素类物质标准品溶液相应的检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值即T/C值为纵坐标，拟合得到荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与辣椒素类物质浓度的关系曲线。该方法的有效检测范围为2.3～62.5ng/mL。\n[0091] Ⅱ：鼠血清样品中辣椒素类物质含量的加标回收实验：\n[0092] 取经高效液相色谱法(HPLC)检测为辣椒素类物质为阴性的鼠血清样品，用10％甲醇/PBS(v/v)4倍稀释，即得鼠血清样品检测液。向其中分别准确添加20ng/mL、40ng/mL和\n80ng/mL辣椒素类物质标准品(其中辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的比例为1:1:1)，混匀，得到各待测血清样品检测液；\n[0093] 分别取上述待测血清样品检测液180μL加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟后，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长：365nm，测定波长：\n615nm)，获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)，然后将其代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与辣椒素类物质浓度的关系曲线，得到样品溶液中的辣椒素类物质浓度，然后根据稀释倍数即可求得样品中辣椒素类物质含量。测得鼠血清样品中的辣椒素类物质含量加标回收率依次为：94.1％，90.3.5％，108.5％。\n[0094] 将该方法检测结果与高效液相色谱标准方法的检测结果进行比较，得：该方法检测结果与高效液相色谱标准方法的检测结果高度一致，符合率达98％。\n[0095] 实施例3：定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条及其应用[0096] 定量检测辣椒素类物质的时间分辨荧光免疫层析试纸条，它包括荧光试纸条、含有铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体的样品反应瓶、样品稀释液及样品稀释液吸管，所述的荧光试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，其中：吸水垫长41mm，宽4mm；检测垫长25mm，宽4mm；\n样品垫长13mm，宽4mm。所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，其包被量为0.15μg/cm质控线，所述检测线上包被辣椒素类物质包被抗原，其包被量为0.3μg/cm检测线，检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为10mm，质控线和检测线的间距为5mm。\n[0097] 所述荧光试纸条的获得：\n[0098] (1)吸水垫的制备\n[0099] 将吸水纸剪裁成长41mm，宽4mm的规格，即得吸水垫；\n[0100] (2)检测垫的制备\n[0101] 检测线的包被：\n[0102] 将辣椒素类物质包被抗原用包被缓冲液配制成浓度为0.5mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需包被抗原的包被量为0.3μg，然后于37℃条件下干燥30分钟；\n[0103] 所述的包被缓冲液为：每10mL中含有卵清蛋白OVA 0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠\n0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；\n[0104] 质控线的包被：\n[0105] 将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.25mg/mL的包被液；于距检测线\n5mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为0.15μg，然后于37℃条件下干燥2小时；\n[0106] 所述的包被缓冲液为：\n[0107] 每10mL中含有牛血清白蛋白0.1g，叠氮化钠0.002g，氯化钠0.08g，十二水磷酸氢二钠0.029g，氯化钾0.002g，磷酸二氢钾0.002g；\n[0108] 所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽4mm。\n[0109] (3)样品垫的制备：\n[0110] 将玻璃纤维膜剪裁成长13mm，宽4mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥8小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；\n[0111] 所述的封闭液为2.9g十二水磷酸氢二钠，0.3g二水合磷酸二氢钠，1.0g Tween-\n20，1.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVPK-30)，0.25g EDTA，0.5g牛血清白蛋白BSA，0.02g叠氮钠，加水定容至100mL所得；\n[0112] (4)荧光试纸条的组装：\n[0113] 在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1mm，即得荧光试纸条。\n[0114] 所述铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体的获得：\n[0115] 取0.2mol/L pH8.18的硼酸缓冲液800μL，加入200μL铕标记试剂(粒径100nm，固形物含量1％)，振荡混匀。用800W超声清洗仪，超声10min。加入40μL 15mg/mL EDC溶液，振荡混匀15min。14000r/min，10℃，离心10min，去上清液，加入1mL硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min。加入160μg辣椒素类物质单克隆抗体，混匀，250r/min、25℃下摇床过夜。再次离心去上清，加入1mL含0.5％OVA的硼酸缓冲液复溶，振荡混匀，超声10min，25℃下摇床2h，得目标产物铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体。上述铕标记试剂可购于上海优你生物科技有限公司，但不限于此。\n[0116] 所述的样品稀释液为质量体积分数为0.01～0.30％的吐温-20，0.5～1.5％蔗糖和0.1～1％卵清蛋白(OVA)水溶液。\n[0117] 上述的时间分辨荧光免疫层析试纸条在辣椒素类物质定量检测中的应用：\n[0118] Ⅰ荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与辣椒素类物质浓度的关系曲线的建立：\n[0119] (1)对经高效液相色谱法(HPLC)检测为辣椒素类物质为阴性的兔血清样品检测液进行辣椒素类物质加标，配得62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.8125ng/mL、\n3.90625ng/mL、1.95313ng/mL、0.97656ng/mL和0ng/mL的辣椒素类物质标准品溶液，其中；\n[0120] (2)将上述铕标记的抗辣椒素类物质单克隆抗体用样品缓释液稀释100倍后，取20μL(约0.43μg标记探针)放于300μL反应瓶中，取上述各浓度的辣椒素类物质标准品溶液各\n180μL，分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟，用吸水纸吸干样品垫残留液体，即刻用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长：365nm，测定波长：\n615nm)得到各荧光试纸条上检测线处(T)和质控线(C)处的时间分辨荧光强度值，由此获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)；\n[0121] (3)以辣椒素类物质浓度为横坐标，各浓度的辣椒素类物质标准品溶液相应的检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值即T/C值为纵坐标，拟合得到荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与辣椒素类物质浓度的关系曲线。该方法的有效检测范围为1.9～62.5ng/mL。\n[0122] Ⅱ兔血清样品中辣椒素类物质含量的加标回收实验：\n[0123] 取经高效液相色谱法(HPLC)检测为辣椒素类物质为阴性的兔血清样品，用10％甲醇/PBS(v/v)4倍稀释，即得兔血清样品检测液。向其中分别准确添加20ng/mL、40ng/mL和\n80ng/mL辣椒素类物质标准品(其中辣椒素、二氢辣椒素、合成辣椒素的比例为1:1:1)，混匀，得到各待测血清样品检测液；\n[0124] 分别取上述待测血清样品检测液180μL加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟后，立即用时间分辨荧光免疫分析仪检测(激发波长：365nm，测定波长：\n615nm)，获得各荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)，然后将其代入上述得到的荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)与辣椒素类物质浓度的关系曲线，得到样品溶液中的辣椒素类物质浓度，然后根据稀释倍数即可求得样品中辣椒素类物质含量。测得血清样品中的辣椒素类物质含量加标回收率依次为：91.0％，89.5％，111.5％。\n[0125] 将该方法检测结果与高效液相色谱标准方法的检测结果进行比较，得：该方法检测结果与高效液相色谱标准方法的检测结果高度一致，符合率达96％；另，该方法样品检测不需要复杂的前处理，所需时间也较高效液相色谱标准方法少，显著提高了检测速度。