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专利名称 | 基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原制备工艺 |
申请号 | CN98122056.8 | 申请日期 | 1998-11-30 |
法律状态 | 权利终止 | 申报国家 | 中国 |
公开/公告日 | 2000-06-07 | 公开/公告号 | CN1255545 |
优先权 | 暂无 | 优先权号 | 暂无 |
主分类号 | 暂无 | IPC分类号 | 暂无查看分类表>
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申请人 | 上海晶莹生物技术有限公司 | 申请人地址 | 上海市浦东金桥出口加工区良基路95号南二座
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专利地址、主体等相关变化,请及时变更,防止失效 |
权利人 | 上海晶莹生物技术有限公司 | 当前权利人 | 上海晶莹生物技术有限公司 |
发明人 | 郭春祥;李建林;郭锡琼 |
代理机构 | 上海专利商标事务所 | 代理人 | 常明 |
摘要
本发明首先选用在细菌中产生融合蛋白和完全天然蛋白的质粒载体;在确定质粒载体后,使用与之相适应的大肠杆菌受体菌,以获得高表达率的基因工程菌;然后制备目的DNA;目的DNA与质粒DNA重组(连结)后转化大肠杆菌;最后进行CagA蛋白抗原的表达和纯化。基因表达的CagA为近C末端蛋白抗原,其分子量大小随不同菌株而定,为27~38Kda。本发明应用于消化道疾病的诊断预报和预防治疗的制备中,能为临床消化道疾患的诊断及预报提供依据。
1.一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原的制备工艺,在 基因工程中质粒的制备和纯化、限制性内切酶水解、酶切后DNA纯化、DNA连 结、连结物转化大肠杆菌受体菌、转化子筛选,按一般常规操作或采用市售商品 试剂及试剂盒进行操作;
其特征在于,首先选用在细菌中产生融合蛋白和完全天然蛋白的质粒载体; 在确定质粒载体后,使用与之相适应的大肠杆菌受体菌,以获得高表达率的基因 工程菌;
然后制备目的DNA:
以CagA阳性菌染色体DNA为模板,用聚合酶链反应PCR扩增目的DNA 片段;
(1)DNA模板
采用国际CagA阳性标准菌株,以及用国际标准菌株证实的国内外CagA阳 性流行菌株的菌体染色体DNA作PCR扩增模板;
(2)引物
选用CagA基因核苷酸2229-3018bp序列及根据载体酶切点的序列设计引 物,使插入目的DNA表达符合读格;
(3)扩增反应
在0.5ml灭菌离心管内混合,其中
灭菌水 30μl
10X扩增缓冲液 10μl
4种dNTP混合物,每种浓度1.25m mol/L16μl
引物1溶于5μl水 100p mol
引物2溶于5μl水 100p mol
模板DNA 1ug
加水至终体积100μl
其中10X扩增缓冲液:
500m mol/LKCl
100m mol/L Tris.HCl PH8.3室温
15m mol/LMgCl2
0.1% 明胶
(4)扩增参数
上述混合液在94℃加热5分钟,加入2u Taq聚合酶,用100μl液体石蜡复 盖反应混合液上,然后按以下参数进行扩增:
循环变性退火聚合
首轮循环 94℃5分钟50℃2分钟 72℃3分钟
后续循环 94℃1分钟50℃2分钟 72℃3分钟
末轮循环 94℃1分钟50℃2分钟 72℃10分钟
循环25~30次;
目的DNA与质粒DNA重组连结后转化大肠杆菌;
最后进行CagA蛋白抗原的表达和纯化:
重组质粒转化后,经小量培养筛选表达率高的重组转化子作为基因工程菌, 基因工程菌经增菌及IPTG诱导后表达CagA蛋白抗原;
基因表达的CagA为近C末端蛋白抗原,其分子量大小随不同菌株而定,为 27~38Kda;
CagA蛋白抗原的纯化需根据载体的情况使用融合蛋白抗体、相应抗体。亲 和层析柱或HPLC进行。
2.根据权利要求1所述的基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗 原制备工艺,在消化道疾病的诊断预报中的应用,其特征在于,应用于产细胞毒 素幽门螺杆菌免疫诊断试剂及试剂盒的制备,它包括检测产细胞毒素幽门螺杆菌 抗原CagA及抗体CagA IgG、CagA IgA、CagA IgM的胶乳凝集检测试剂及试剂 盒、金标记检测试剂及试剂盒、血球凝集检测试剂及试剂盒、萤光免疫检测试剂 及试剂盒、酶免疫检测试剂及试剂盒、以及放射免疫检测试剂及试剂盒。
3.根据权利要求1所述的基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗 原制备工艺,在消化道疾病的预防中的应用,其特征在于,应用于疫苗的制备, 包括口服疫苗和注射疫苗的制备。
4.根据权利要求1所述的基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗 原制备工艺,在消化道疾病的预防及治疗中的应用,其特征在于,制备包括单克 隆抗体及多克隆抗体的CagA蛋白抗体及CagA蛋白拮抗物,用作特异性药物使 之与胃、十二指肠产细胞毒素幽门螺杆菌结合,或作为保健品预防产细胞毒素幽 门螺杆菌侵入胃、十二指肠组织。
本发明涉及生物基因工程和疾病诊断防治技术,属于生物医学工程技术领 域,特别涉及一种基因工程表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A(Helicobacter Pylori-Cytotoxin associated gene A,简称CagA)蛋白抗原的制备工艺,以及在消化 道疾病的诊断预报和预防治疗中的制备应用。\n幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,简称HP)是一种造成人类胃及十二指肠疾患 的重要致病性病原体。幽门螺杆菌的感染已是个世界问题,据报道,在发达国家 30岁以下人群感染率低于20%,60岁以上人群感染率超过50%,而在包括我国 在内的发展中国家,20岁以上人群感染率已达80%以上。\n近年来:国内外已经建立了一些具有高灵敏度和特异性的幽门螺杆菌(HP)诊 断方法,这些方法总的可分为两大类:一类是需要使用内窥镜的侵入法;另一类 是不需要内窥镜的非侵入法。现分述于下:\n一.侵入性的诊断试验\n这类试验的特点是使用内窥镜,在取得胃活检组织后进行检测,试验的方法 主要有快速尿酶试验、组织学染色鉴别及细菌培养法。\n1.快速尿酶试验\n快速尿酶试验是利用胃活检组织中存在一定量的幽门螺杆菌,其菌膜上存在 的尿酶使尿素产生氨气,引起pH值的改变,通过颜色的变化来显示结果。该试 验具有简便快速的特点,它是检测胃活检组织幽门螺杆菌常用的方法,但对于近 期使用过降低胃部细菌量或直接抑制酶活性的药物的样品应避免使用,同时在成 功地根治幽门螺杆菌感染后,由于尚未建立快速尿酶法的准确性指标,故也不应 使用该试验。\n2.组织学染色\n一般胃镜活检组织经过快速尿酶试验检测为阴性时,为了对未治疗病人进行 确诊,可进行病理组织学检查,取2份以上胃窦活检组织用苏木精和伊红染色,其 它特殊染色还有Genta,Giemsa,Warthin-Starry等。在未治疗病人胃活检中存在慢 性活动性胃炎,是幽门螺杆菌感染的有力证据。从组织学上若不存在慢性粘膜 (mucosal)炎症,则可以排除幽门螺杆菌感染。但不同病理学家间的观察会存在差 异,它对于肠道化生及胃萎缩的样品诊断具有一定困难。在成功地根治性治疗后 6周内,慢性活动性胃炎会缓慢恢复其组织形态,因此也不能作为继续感染的标 志。\n3.细菌培养\n一般胃活检组织进行幽门螺杆菌的细菌培养较少,因为该细菌需要复杂的营 养,且费用昂贵。但对于病人在治疗中产生抗药性时,应该进行幽门螺杆菌培养 和药敏试验。\n4.其它方法\n其它方法包括聚合酶链反应(PCR)及相差显微镜检查等,前者可用作分型(I 型幽门螺杆菌和II型幽门螺杆菌)及研究用,后者需暗视野,且操作者需一定训 练,因此临床上使用是有限的。\n以上这些方法由于均需采用胃活检组织,因此对医院和临床医师、病理学家 等均有一定的要求,同时采用内窥镜也会造成病人的痛苦及医疗费的负担,因此 常在较严重的胃十二指肠疾患的病中采用。\n二.非侵入性的诊断试验\n这类试验的主要特点是不需要使用内窥镜,从而可避免病人反复做胃镜的痛 苦及发生其它类型的感染,试验方法主要包括下述尿素呼吸试验和抗体检测。\n1.尿素呼吸试验(UBT):\n碳标记尿素呼吸试验(UBT)不隶属于免疫应答,它是根据幽门螺杆菌尿酶水 解口服的碳标记尿素的原理设计的一种试验方法。当一个感染幽门螺杆菌的病人 咽下同位素标记的尿素时,由于幽门螺杆菌表面的尿酶水解尿素释放标记CO2, 并吸收到血液中,然后在呼气中捕获并测定之。13C是一种稳定的无放射性同 位素,14C是放射性同位素,二者都可用来标记尿素。碳标记尿素呼吸试验具有 操作简单的特点,但作为商品的碳标记尿素呼吸试验试剂盒的预期费用虽比内窥 镜价格低些但远比抗体检测试验贵,而且会造成大量的同位素污染,因此尚难以 此法作为常规检测未治疗的病人。至于对病人的确诊根治也须在治疗后至少一个 月后采用,对新近用抗生素、铋剂或质子泵抑制剂治疗的病人可能会引起碳标记 尿素呼吸试验假阴性结果,先前有胃切除的病人碳标记尿素呼吸试验灵敏度也会 下降。\n2.抗体检测\n慢性幽门螺杆菌感染可引起病人产生局部或全身性的免疫应答而导致IgG和 IgA抗体的产生,而其抗体的水平又能较准确地反映幽门螺杆菌感染的状态, 因此在病人血清中检测幽门螺杆菌抗体是幽门螺杆菌感染的可信指标。\n目前国内外已有多种幽门螺杆菌抗体检测盒上市,其中多以用经培养的幽门 螺杆菌体抽提物作为抗原,采用如胶乳凝集试验、血球凝集试验、荧光免疫检测 试验和酶免度检测试验等免疫学方法检测人血清中(或血浆、全血、唾液等)的幽 门螺杆菌抗体。其中用得较多的是定性或定量酶免疫检测(EIA)幽门螺杆菌抗体检 测盒,它的检测能显示人群中的幽门螺杆菌感染率,但由于幽门螺杆菌在包括 我国在内的发展中国家的高感染率,因此对幽门螺杆菌抗体的检测在临床上不常 用作诊断工具,而多用于流行病学调查。\n随着医学研究的发展,对于幽门螺杆菌是不是产细胞毒素,在临床上分为两 种型别:I型幽门螺杆菌为产细胞毒素;II型幽门螺杆菌为不产细胞毒素。其中 约占50%~60%幽门螺杆菌为I型感染。I型幽门螺杆菌即VacA(+)和CagA(+) 幽门螺杆菌(VacA:空泡细胞毒素;CagA:细胞毒素相关基因蛋白抗原),它是 造成胃、十二指肠溃疡病的重要致病原。检测产细胞毒素幽门螺杆菌能为消化道 疾病的防治工作提供确切的实验室依据,尤其是对含高滴度CagA抗体的患者进 行积极的根治性治疗有着重要的指导意义。\n产细胞毒素幽门螺杆菌抗体检测目前尚属研究阶段,文献检索显示:\n1.HP菌具有高度异源性,不同来源的CagA基因显示大量核苷酸取代现象, 根据已报道的美国和意大利的CagA核苷酸序列相比,其异源性达21%。(Infection and Immunity 61(5):1799-1801 1993;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5791-5795 1993)\n2.1993年10月报道采用重组128KDa CagA蛋白检测CagA-IgG抗体的检测 试剂(Eur.J.Clin.Microbio.Infect.Dis 12(10):739-745 1993),但至今尚未见到 上市产品。\n3.CagA蛋白(128KDa)的抗原性是由CagA近C末端的核苷酸编码(Proc.Natl. Acad.Sei.USA 90:5791-5795 1993),但至今也尚未见到上市产品。\n目前在临床上应用的幽门螺杆菌抗体检测盒(包括EIA试剂、胶乳试剂等)均 采用培养的幽门螺杆菌菌体的抽提物制备而成,在我国临床样品的幽门螺杆菌抗 体(HP-IgG)的检测结果绝大多数均为阳性,这样造成了临床医师的无所适从,因 此对于胃肠道患者的诊断治疗仍主要依靠传统胃镜及活检报告。HP-IgG的检测 尚不适合我国临床诊断的需要。\n幽门螺杆菌按临床可分为产细胞毒素幽门螺杆菌和不产细胞毒素幽门螺杆 菌两类,它们在胃和十二指肠溃疡疾病中所造成的后果不一样:感染了不产细胞 毒素幽门螺杆菌后,虽然能复盖在部份胃粘膜上,并使人体产生相应的免疫应答 反应(HP-IgG为阳性),但不能侵入胃上皮细胞,一般可长期(数十年乃至终身)无 临床症状。与此相反,感染了产细胞毒素幽门螺杆菌后,由于细胞毒素的作用造 成胃上皮细胞空泡、损伤、坏死和溃疡,因此感染这类幽门螺杆菌与胃、十二指 肠溃疡及胃癌密切相关。国外研究结果显示,90%以上的十二指肠溃疡及75% 胃溃疡病人均感染了产细胞毒素幽门螺杆菌,同时80%以上胃癌病人也与此相 关,因此临床上迫切需要检测特异性的产细胞毒素幽门螺杆菌试剂。现研究结果 进一步表明,大约占50%~60%幽门螺杆菌能产生细胞毒素活性,其中细胞毒 素的表达与暴露在幽门螺杆菌表面的细胞毒素相关基因A(Cytotoxin associated gene A简称CagA)密切相关,该基因表达的蛋白仅存在于产细胞毒素的幽门螺 杆菌中,并具有良好的免疫原性。现已认为,CagA蛋白抗体与胃溃疡、十二指 肠溃疡及胃癌密切相关,。\n本发明的目的是提供一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗 原的制备工艺,它采用基因工程表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A(HP-CagA) 蛋白抗原,能为临床消化道疾患的诊断及预报提供依据,应用于免疫学诊断方法 中。\n本发明的又一目的是提供一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋 白抗原在消化道疾病的诊断预报和预防治疗中的制备应用,用于检测幽门螺杆菌 细胞毒素相关基因A(HP-CagA)蛋白抗原的抗原或抗体,以指导患者进行根除性 治疗。\n本发明的技术解决方案如下:\n一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原的制备工艺,在基因 工程中质粒的制备和纯化、限制性内切酶水解、酶切后DNA纯化、DNA连结、 连结物转化大肠杆菌受体菌、转化子筛选,按一般常规操作或采用市售商品试剂 及试剂盒进行操作;\n首先选用在细菌中产生融合蛋白和完全天然蛋白的质粒载体;在确定质粒载 体后,使用与之相适应的大肠杆菌受体菌,以获得高表达率的基因工程菌;\n然后制备目的DNA:\n以CagA阳性菌染色体DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增目的DNA 片段;\n(1)DNA模板\n采用国际CagA阳性标准菌株,以及用国际标准菌株证实的国内外CagA阳 性流行菌株的菌体染色体DNA作PCR扩增模板;\n(2)引物\n选用图1所示的CagA基因核苷酸2229-3018bp序列及根据载体酶切点的序 列设计引物,使插入目的DNA表达符合读格;\n(3)扩增反应\n在0.5ml灭菌离心管内混合,其中\n灭菌水 30μl\n10X扩增缓冲液 10μl\n4种dNTP混合物,每种浓度 1.25m mol/L16μl\n引物1(溶于5μl水) 100p mol\n引物2(溶于5μl水) 100p mol\n模板DNA 1ug\n加水至终体积100μl\n其中10X扩增缓冲液:\n500m mol/LKCl\n100m mol/LTris.HCl(PH8.3室温)\n15m mol/LMgCl2\n0.1%明胶\n(4)扩增参数\n上述混合液在94℃加热5分钟,加入2u Taq聚合酶,用100μl液体石蜡复 盖反应混合液上,然后按以下参数进行扩增:\n循环变性退火聚合\n首轮循环 94℃5分钟50℃2分钟 72℃3分钟\n后续循环 94℃1分钟50℃2分钟72℃3分钟\n末轮循环 94℃1分钟50℃2分钟72℃10分钟\n循环25~30次;\n目的DNA与质粒DNA重组(连结)后转化大肠杆菌;\n最后进行CagA蛋白抗原的表达和纯化:\n重组质粒转化后,经小量培养筛选表达率高的重组转化子作为基因工程菌, 基因工程菌经增菌及IPTG诱导后表达CagA蛋白抗原;\n基因表达的CagA为近C末端蛋白抗原,其分子量大小随不同菌株而定,为 27~38Kda;\nCagA蛋白抗原的纯化需根据载体的情况使用融合蛋白抗体、相应抗体。亲 和层析柱或HPLC进行。\n一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原在消化道疾病的诊 断预报中的制备应用,应用于产细胞毒素幽门螺杆菌免疫诊断试剂及试剂盒的制 备,它包括检测产细胞毒素幽门螺杆菌抗原(CagA)及抗体(CagA IgG、CagA IgA、CagA IgM)的胶乳凝集检测试剂及试剂盒、金标记检测试剂及试剂盒、血 球凝集检测试剂及试剂盒、萤光免疫检测试剂及试剂盒、酶免疫检测试剂及试剂 盒、以及放射免疫检测试剂及试剂盒。\n一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原在消化道疾病的预 防中的制备应用,应用于疫苗的制备,包括口服疫苗和注射疫苗的制备。\n一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原在消化道疾病的预 防及治疗中的制备应用,制备包括单克隆抗体及多克隆抗体的CagA蛋白抗体及 CagA蛋白拮抗物,用作特异性药物使之与胃、十二指肠产细胞毒素幽门螺杆菌 结合,或作为保健品预防产细胞毒素幽门螺杆菌侵入胃、十二指肠组织。\n本发明采用基因工程表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A(HP-CagA)蛋白抗 原,并应用于诊断预报检测试剂盒的制备、疫苗制备、药品及保健品的制备中。 本发明中的CagA蛋白抗原可应用于免疫学诊断方法中各种诊断试剂及试剂盒的 制备,包括检测产细胞毒素幽门螺杆菌抗原(CagA)及抗体(CagA IgG、CagA IgA、CagA IgM)的胶乳凝集检测试剂及试剂盒、金标记检测试剂及试剂盒、血 球凝集检测试剂及试剂盒、萤光免疫检测试剂及试剂盒、酶免疫检测试剂及试剂 盒、以及放射免疫检测试剂及试剂盒等,用来检测CagA抗体,能为临床胃部疾 患的诊断及预报提供依据,尤其对含高滴度CagA抗体的胃、十二指肠患者进行 积极的抗菌素根除性治疗有着重要的指导意义,对45岁以下的CagA抗体检测阴 性的患者可免除胃镜检查的痛苦。本发明中的CagA蛋白也可用作制备预防消化 道疾病的疫苗;同时,CagA抗体可应用于特异性治疗消化道疾病及预防消化道 疾病的药物和保健品。\n下面结合附图对本发明的实施例作进一步描述。\n图1表示了CagA基因核苷酸序列。\n图2表示出HP-CagA蛋白表达及纯化。\n一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原的制备工艺,在基因 工程中质粒的制备和纯化、限制性内切酶水解、酶切后DNA纯化、DNA连结、 连结物转化大肠杆菌受体菌、转化子筛选,按一般常规操作或采用市售商品试剂 及试剂盒进行操作。\n1.质粒载体的使用\n可选用在细菌中产生融合蛋白和完全天然蛋白的各种质粒载体。\n使用产生融合蛋白的载体有:表达1acZ融合基因的载体系统:如PUR载体、 PMR载体及PEX载体等。表达6XHis融合蛋白的载体系统有PQE系统等,还有 其它融合蛋白的载体系统。\n表达完全天然CagA蛋白抗原也可采用PKC载体等。\n2.大肠杆菌受体菌的使用\n在确定质粒载体后,可使用与之相适应的大肠杆菌受体菌,如K12 71/18、 JM103、XL1 Blue、JM109、TG1、M15[PREP4]或SG13009[PREP4]等以获得 高表达率的基因工程菌。\n3.目的DNA的制备\n以CagA阳性菌染色体DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增目的DNA 片段。\n(1)DNA模板\n采用国际CagA阳性标准菌株,以及用国际标准菌株证实的国内外CagA阳 性流行菌株的菌体染色体DNA作PCR扩增模板。\n(2)引物\n参见Tummurn et al报道的CagA核苷酸序列(Infection and Immunity 61(5):1799-1809 1993)(参见图1),选用图中核苷酸2229-3018bp序列及根据载体 酶切点的序列设计引物,使插入目的DNA表达符合读格。图2中条1为诱导前 细胞电泳图谱,条2为IPTG诱导后细胞电泳图谱,条3为纯化蛋白电泳图谱, 条4为标准分子量(MW=29000)电泳图谱。\n(3)扩增反应\n在0.5ml灭菌离心管内混合,其中\n灭菌水30μl\n10X扩增缓冲液10μl\n4种dNTP混合物,每种浓度1.25m mol/L16μl\n引物1(溶于5μl水) 100p mol\n引物2(溶于5μl水) 100p mol\n模板DNA 1ug\n加水至终体积100μl\n其中10X扩增缓冲液:\n500m mol/LKCl\n100m mol/LTris.HCl(PH8.3室温)\n15m mol/LMgCl2\n0.1%明胶\n(4)扩增参数\n上述混合液在94℃加热5分钟,加入2u Taq聚合酶,用100μl液体石蜡复 盖反应混合液上,然后按以下参数进行扩增:\n循环变性退火聚合\n首轮循环 94℃5分钟50℃2分钟 72℃3分钟\n后续循环 94℃1分钟50℃2分钟 72℃3分钟\n末轮循环 94℃1分钟50℃2分钟 72℃10分钟\n循环25~30次。\n目的DNA与质粒DNA重组(连结)后转化大肠杆菌。\n4.CagA蛋白抗原的表达和纯化\n重组质粒转化后,经小量培养筛选表达率高的重组转化子作为基因工程菌。 基因工程菌经增菌及IPTG诱导后表达CagA蛋白抗原。具体操作参见Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook et al 1989)或Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al 1995)。\n基因表达的CagA为近C末端蛋白抗原,其分子量大小随不同菌株而定,为 27~38Kda。\nCagA蛋白抗原的纯化可根据载体的情况使用融合蛋白抗体、相应抗体。亲 和层析柱或HPLC进行,纯化结果参见图2。\n本发明的基因工程表达CagA蛋白抗原:\n1.本发明所采用的中国流行株为:医960818为经国际标准株NCTC 11637(14)(HP-CagA(+))及NCTC 12908(01)(HP-CagA(-))核对过为HP-CagA(+) 株。\n2.分别采用HP-CagA(+)的国际标准株NCTC 11637(14)和中国流行株医 960818染色体DNA为模板,自行设计产细胞毒素幽门螺杆菌CagA基因片段引 物,用聚合酶链反应(PCR)扩增其编码CagA蛋白抗原近C端基因片段作为插入 片段。\n3.采用表达载体[如PUR、PMR、PQE等表达载体],按常规操作(见 Molecular Cloning:a Laboratory Manual(Sambrook et al 1989)或Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al 1995)将插入片段与载体多克隆酶切位点连 结,使插入片段表达符合读格,然后转化至受体菌(如K12 71/18,JM103 XL1兰、 JM109、TG1、M15[pREP4]或SG 13009[pREP4]等大肠杆菌受体菌)中,并获得 表达率高的基因工程菌。\n4.基因工程菌经增菌及IPTG诱导表达CagA蛋白抗原经相应的亲和层析柱 纯化后获得纯化CagA蛋白抗原。\n本发明的基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原在消化道疾病 的诊断预报中的制备应用,应用于产细胞毒素幽门螺杆菌免疫诊断试剂及试剂盒 的制备,它包括检测产细胞毒素幽门螺杆菌抗原(CagA)及抗体(CagA IgG、CagA IgA、CagA IgM)的胶乳凝集检测试剂及试剂盒、金标记检测试剂及试剂盒、血 球凝集检测试剂及试剂盒、萤光免疫检测试剂及试剂盒、酶免疫检测试剂及试剂 盒、以及放射免疫检测试剂及试剂盒。\n实施例:产细胞毒素幽门螺杆菌IgG抗体酶免疫检测试剂盒的制备\n产细胞毒素幽门螺杆菌IgG抗体酶免疫检测试剂盒中,固相载体可包括聚苯 乙烯板(孔)、聚苯乙烯珠、聚丙烯板(孔)等。酶可采用辣根过氧化物酶、碱性磷酸 酶、尿酶等,底物可根据不同酶标记物选用相应的底物。以下用聚苯乙烯板为固 相载体,以辣根过氧化物酶制备酶标结合物,用3,3’、5,5’四甲基联苯胺为底物 制备试剂盒,\n产细胞毒素幽门螺杆菌IgG抗体酶免疫检测试剂盒包括:产细胞毒素幽门螺 杆菌抗原(CagA蛋白抗原)包被反应板条一袋;抗人-IgG-HRP酶标结合物一瓶; 样品稀释液一瓶;产细胞毒素幽门螺杆菌IgG抗体阴、阳性对照血清各一管;底 物A液一瓶;底物B液一瓶;终止液一瓶;20倍浓缩洗涤液一瓶。\n产细胞毒素幽门螺杆菌IgG抗体酶免疫检测试剂盒是非侵入型临床诊断检 测幽门螺杆菌IgG抗体并能达到幽门螺杆菌(HP)分型目的的唯一方法,能特异性 地检出引发胃、十二指肠溃疡和胃癌的产细胞毒素幽门螺杆菌感染,将为我国在 产细胞毒素幽门螺杆菌的流行病研究、溃疡病的实验室检测、溃疡病治疗疗效考 核及幽门螺杆菌疫苗的研制提供有效的工具。\n实施例:产细胞毒素幽门螺杆菌IgG抗体金标检测试剂盒的制备\n产细胞毒素幽门螺杆菌IgG抗体金标检测试剂盒中由于制备工艺的不同,可 有渗滤金标斑点法检测试剂盒、免疫金标层析试验检测试纸条等。下面描述渗滤 金标斑点法检测试剂盒的制备方法。\n该试剂盒包括渗滤法检测塑料小盒20个,抗人IgG-金标记溶液一瓶及洗涤 液一瓶。\n1.渗滤法检测塑料小盒的制备\n滤膜制备\n(1)点样:在孔径为0.22~0.45μ的滤膜上(可采用硝酸纤维素膜、醋酸-硝酸 纤维素膜、尼龙膜及预活化滤膜等),点样一定浓度CagA纯化蛋白抗原1~2μl作 样品检测,另在距此2mm处点样人IgG 0.5μl作为阴性对照用,待干。\n(2)封膜:将滤膜浸入含5%去脂奶粉的PBS液中封闭1小时取出待干。\n(3)包装:将滤膜装入渗滤检测用塑料小盒中,滤膜下铺有吸水纸垫。\n2.抗人-IgG金标记溶液的制备\n(1)在洁净的硅烷化后的三角烧瓶中,加入双蒸水1000ml,煮沸,然后加入 1%柠檬酸三钠10ml,煮沸。\n(2)加入2%氯金酸5ml,摇匀,继续煮沸20分钟,颜色改变显示胶体金形 成,当红-紫红色时胶体金颗粒大小在20-40nm,冷却至室温。\n(3)加1%PEG 20,000 2ml以稳定金溶胶,用0.1M K2CO3校正pH值至中 性。\n(4)在上述金溶胶中加入适量已透析去盐的抗人IgG,混匀,放置10分钟。\n(5)用0.1M K2CO3校正pH值至中性,置室温5分钟。\n(6)加入1%BSA封闭金溶胶。\n(7)离心,13,500rpm离心1小时,弃上清液,收集金溶胶标记物。\n(8)加入含0.2%PEG 20,000-1%BSA溶液100ml。\n(9)校正抗人IgG-金溶胶浓度使之检测HP-CagA符合质控标准。\n(10)分装抗人IgG-金溶胶。\n3.洗涤液\n(1)配制0.1M Tris-HCl(pH8)-100mM NaCl-2%PEG4000-1%吐温20-0.1% NaN3。\n(2)分装小瓶。\n本发明的基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原在消化道疾病 的预防中的制备应用,应用于疫苗的制备,包括口服疫苗和注射疫苗的制备。\n实施例:疫苗的制备\n本发明所制备的CagA蛋白抗原经高度纯化后可以用作疫苗免疫原,用来预 防胃及十二指肠溃疡或幽门螺杆菌感染的其它并发症(如慢性胃炎、萎缩性胃炎、 胃癌等)。\n免疫剂量的决定可先按标准程序给予动物不同量的抗原并测定其抗体反应 情况。\n疫苗中的成份还应包括适当的佐剂。\n给予疫苗的途径可通过口服,也可通过注射。\n由于疫苗为主动免疫过程,它对疾病的预防和治疗都起作用,因此本发明对 预防和治疗幽门螺杆菌的感染及其引起的胃、十二指肠溃疡等疾患是有效的方 法。\n本发明的基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原在消化道疾病 的预防及治疗中的制备应用,制备包括单克隆抗体及多克隆抗体的CagA蛋白抗 体及CagA蛋白拮抗物,用作特异性药物使之与胃、十二指肠产细胞毒素幽门螺 杆菌结合,或作为保健品预防产细胞毒素幽门螺杆菌侵入胃、十二指肠组织。\n实施例:制备CagA蛋白抗体及CagA蛋白拮抗物\nCagA抗体或CagA蛋白拮抗物能与产细胞毒素幽门螺杆菌特异性结合,使 产细胞毒素幽门螺杆菌与宿主胃、十二指肠化生细胞的受体结合受到竞争性抑 制,从而起到被动免疫的作用。\n本发明所制备的CagA蛋白通过免疫动物制备的多克隆抗体或单克隆抗体, 通过口服途径使感染产细胞毒素幽门螺杆菌病人达到治疗目的,对未感染幽门螺 杆菌健康人起到保健预防作用。
法律信息
- 2009-01-28
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
专利权的终止(未缴年费专利权终止)授权公告日:2003.4.9
- 2008-02-06
专利权的质押、保全及解除(专利权质押(保全)的解除)
专利权的质押、保全及解除(专利权质押(保全)的解除)质押(保全): 保全登记解除日: 2007.9.24
- 2007-05-16
专利权的质押、保全及解除专利权的质押(保全)
<质押(保全)>保全<登记生效日>2007.03.24
- 2003-04-09
- 2000-06-07
- 1999-08-11
引用专利(该专利引用了哪些专利)
序号 | 公开(公告)号 | 公开(公告)日 | 申请日 | 专利名称 | 申请人 |
1
| | 暂无 |
1995-06-07
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2
| |
1998-03-11
|
1996-02-15
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被引用专利(该专利被哪些专利引用)
序号 | 公开(公告)号 | 公开(公告)日 | 申请日 | 专利名称 | 申请人 | 该专利没有被任何外部专利所引用! |