一种水产用复合微生态制剂及其预混料

1.一种水产用复合微生态制剂，其特征在于该制剂的主要成分为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.4628、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.5094 和粪肠球菌(Enterococcus faccalis)CGMCC No.5092,制剂中枯草芽孢杆菌 CGMCC No.4628、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094 和粪肠球菌CGMCC No.5092 的配比为1 ∶
1 ∶ 2。
2.如权利要求1所述的水产用复合微生态制剂，其特征在于所述的制剂为液态制剂或颗粒剂；所述的液态制剂为枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628 的发酵液、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094的发酵液和粪肠球菌CGMCC No.5092 的发酵液的混合液；所述的颗粒剂为枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628 的菌泥、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094 的菌泥和粪肠球菌CGMCC No.5092 的菌泥分别与载体混合，制成颗粒剂。
3.如权利要求2所述的水产用复合微生态制剂，其特征在于所述的液态制剂pH为
10
6.4-7.2，活菌数为1-2×10 cfu/ml。
4.如权利要求2所述的水产用复合微生态制剂，其特征在于所述的载体为玉米淀粉、麦芽糊精、玉米芯粉、麦麸粉中的一种或两种与石粉的混合，颗粒剂中的活菌数为
10
3-4×10 cfu/g。
5.一种包含权利要求1 所述水产用复合微生态制剂的预混料，其特征在于预混料中复合微生态制剂添加的重量百分比为0.1-1%。

一种水产用复合微生态制剂及其预混料\n技术领域\n[0001] 本发明属于应用生物技术领域，涉及一种水产用复合微生态制剂及其预混料。 背景技术\n[0002] 随着水产养殖集约化程度不断提高，养殖水体的理化环境和生态环境日趋恶化；\n同时，人类生活污水、各种工业废水、农业废水等超量排放，均加剧了养殖水体质量的下降；\n这些问题造成养殖病害日趋严重；与此同时，人们生活水平提高，食品安全意识的提高，以及加入WTO后对动物源产品的要求越来越规范，在生产和使用渔药时，必不可少地需要考虑该渔药是否符合食品安全要求，否则不能生产或使用，这是与过去的渔药生产与使用的最大区别。人们从过去只重视渔药的效果，而不顾及对环境的破坏、药残对人类健康的影响，到现在，美国和欧盟等国家和地区相继出台了相关法律限制一些渔药如孔雀绿和抗生素等在水产养殖上的应用，因此水产养殖必须提供安全、优质的无公害绿色的水产品是大势所趋。很多研究结果表明微生态制剂不仅能够降低水体的有机污染，净化水体，还可以抑制杀死病原微生物，并可作为适量添加剂从而部分替代抗生素的使用。复合微生态制剂由于同时具有改善肠道内环境、增加进食、抑制有害菌群、改善水质等多方面的作用，越来越多的被人们应用到水产养殖业中。 \n[0003] 市场上已经存在多种能够在水质改良和预防疾病某一或者某些方面取得明显效果的复合微生态制剂，但是很多制剂仍存在菌种性能不稳定、功能单一和环境适应性能差等问题，使其不能适应水体复杂多变的环境，施于水体后效果不稳定，从而限制了微生态制剂在水产养殖上的推广应用。 \n发明内容：\n[0004] 本发明的目的是提供一种水产用复合微生态制剂，该制剂可作为水产用饲料添加剂，也可用于水产养殖水体净化和调理，该制剂环境适应性强、功能稳定且能够有效降解水体中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮和COD等污染物。 \n[0005] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的： \n[0006] 本发明提供一种水产用复合微生态制剂，该制剂的主要成分为枯草芽孢杆菌CGMCC No. 4628、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094和粪肠球菌CGMCC No.5092。 [0007] 其中，本发明制剂中枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094和粪肠球菌CGMCC No.5092的配比为1-5∶1-5∶2-7。 \n[0008] 进一步，本发明制剂中枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094和粪肠球菌CGMCC No.5092的配比为1∶1∶2。 \n[0009] 本发明的复合微生态制剂可制备成液态制剂或颗粒剂；所述的液态制剂为枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628的发酵液、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094的发酵液和粪肠球菌CGMCC No.5092的发酵液的混合液；所述的颗粒剂为枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628的菌泥、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094的菌泥和粪肠球菌CGMCC No.5092的菌泥分别与载体混合，制成颗粒剂。 \n[0010] 其中，所述的液态制剂pH为6.4-7.2，活菌数为1-2×1010cfu/ml。 [0011] 所述的载体为玉米淀粉、麦芽糊精、玉米芯粉、麦麸粉中的一种或两种与石粉的混\n10\n合，颗粒剂中的活菌数为3-4×10 cfu/g。 \n[0012] 本发明还提供了一种包含该水产用复合微生态制剂的预混料，其特征在于预混料中复合微生态制剂添加的重量百分比为1-10‰。 \n[0013] 本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为申请人从牛肠道中分离、经定向初筛和复筛得到。其营养细胞杆状，其芽孢为椭圆或长筒形，为中生或次端生，孢囊稍膨大。孤立或呈短链，杆端半圆形。在1 2～16h内能形成菌落，菌落为圆形，或不规则，边缘毛发状，菌落白色，不透明，无褶皱。革兰氏阳性。申请人对此株地衣芽孢杆菌进行了耐酸性、耐胆盐、耐高温性、发酵特性和抑菌活性等实验，此株地衣芽孢杆菌具有对逆环境耐受性强、粘附性强、生长快、生物量大、抑菌活性好等特点。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.5094。本发明的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)为申请人从猪大肠中分离得到，其生物学特征如下：菌落圆整，表面光滑，不透明，乳白色，边缘光滑，革兰氏阳性菌；单个菌体为球状或椭圆状。本发明的粪肠球菌经过人工胃液、胆汁液及耐热性的筛选；又经过产酶能力筛选和抑菌能力筛选，可以耐受pH2.0，1％胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3％的人工胆汁液，可以耐受85℃的制粒温度，也可以抑制致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，具有较强的产酸和抑制豆粕、棉粕、玉米秸秆中霉菌的能力。本发明的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)申请人已于2011年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址同上，保藏编号为CGMCC No.5092。本发 明所用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为申请人从传统发酵豆豉中分离得到，其生物学特征如下：菌落表面粗糙，不透明，污白色，菌落圆形，边缘呈锯齿状，革兰氏阳性菌；芽孢形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。本发明的枯草芽孢杆菌显著区别于现有的枯草芽孢杆菌，可以耐受pH2.0，1％胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3％的人工胆盐，可以耐受80℃的制粒温度，可以抑制致病性大肠杆菌K88，K99和金黄色葡萄球菌，具有较强的产纤维素酶的能力，可以降解纤维素。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)已于2011年3月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址同上，保藏编号为CGMCC No.4628。 [0014] 有益效果： \n[0015] 1、本发明制剂含三种高质量的益生菌，其菌种是严格按照微生态学规律进行选种、选育的，保证菌种的优良，活菌含量高，其中液态的微生态制剂保质期长达6个月，而固态的微生态制剂保质期可达24个月，均具有良好的微生态调节、优化水质、促进水产动物的生长、增强免疫力的作用，且质量稳定，安全可靠，绿色环保，无污染。 [0016] 2、本发明制剂能够显著促进水产动物的个体增重，提高单位面积产量和总量，从而增加水产养殖的收入，提高效益。 \n[0017] 3、本发明活菌含量高、保质期长、作用范围大、生产成本低，是专门改善水质、增加水产动物免疫力及防治水产类病害发生的理想复菌剂。 \n[0018] 4、本发明的液态水产微生态单独使用能够在水中迅速扩散，并有良好的繁殖能力，更好的改善水质和抑制水中致病微生物。 \n[0019] 5、本发明的颗粒微生态产品单独使用可以迅速沉入水底，改善水底的环境和降解水底的有机物质，优化水产养殖环境。 \n[0020] 通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何形式限制本发明的范围。 \n具体实施方式：\n[0021] 实施例1三种菌的高密度发酵液及液体复合微生态制剂的制备 \n[0022] 1、粪肠球菌CGMCC No.5092高密度发酵液的制备 \n[0023] 1)平板培养复壮：将粪肠球菌菌种接种于MRS平板培养基上，于37℃培养18h，使粪肠球菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，37℃培养24h； [0024] 2)一级种子的制备：将步骤1)培养的粪肠球菌菌种转接装有300m1MRS液态培养基2L摇瓶里，37℃静置培养24h，至对数后期，得一级种子； \n[0025] 3)二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子转接到装有80LMRS种子培养基的\n100L种子罐中，温度37℃，转速60rpm，培养12h，得二级种子液。 \n[0026] 4)粪肠球菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照1％的接种量接种到\n3\n0.5-0.8m 发酵培养基的发酵罐中，温度37℃，转速60rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1∶0.6，\n9\n培养12h，可得菌数为7.72×10cfu/ml的粪肠球菌发酵液。 \n[0027] 发酵粪肠球菌时用的发酵培养基由以下成分组成：红糖18g/L，蛋白胨4g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸粉，0.8g/L，七水合硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.005g/L，pH为7.2。 [0028] 2、地衣芽孢杆菌CGMCC No.5094高密度发酵液的制备 \n[0029] 1)平板培养复壮：将地衣芽孢杆菌菌种接种于BPY平板培养基上，于32℃培养\n24h，使地衣芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，32℃培养24h； [0030] 2)一级种子的制备：将步骤1)培养的地衣芽孢杆菌菌种转接茄子瓶BPY斜面培养基上，32℃培养16h，使处于对数后期，得一级种子； \n[0031] 3)二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有60L BPY种子培养基的100L种子罐中，温度32℃，转速250rpm，罐压0.05MPA，通风比：\n1∶0.8，培养14h，得二级种子液。 \n[0032] 4)地衣芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照5％的接种量接\n3\n种到6m 发酵培养基的发酵罐中，温度32℃，转速300rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1∶1，培\n10\n养16h，得芽孢生成率90％以上，活菌数为1.32×10 cfu/ml的地衣芽孢杆菌发酵液； [0033] 所述的发酵培养基为(质量百分比)：麸皮1.5％，玉米粉1.0％、豆粕1.2％，硫酸铵0.6％，硫酸镁0.04％；柠檬酸铵0.8％、消泡剂0.06％，pH为6.8。 \n[0034] 3、枯草芽孢杆菌CGMCC No.4628高密度发酵液的制备 \n[0035] 1)平板培养复壮：将枯草芽孢杆菌菌种接种于BPY平板培养基上，于30℃培养\n24h，使枯草芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种培养基上，30℃培养24h； [0036] 2)一级种子的制备：将步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌种转接茄子瓶BPY斜面培养基上，37℃培养24h，使处于对数后期，得一级种子； \n[0037] 3)二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有\n60L BPY种子培养基的100L种子罐中，温度30℃，转速300rpm，罐压0.05MPA，通风比：1∶1培养14h，得二级种子液。 \n[0038] 4)枯草芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按10％的接种量\n3\n接种到600L发酵培养基的1m 发酵罐中，温度30℃，转速300rpm，罐压0.05Mpa，通风比：\n10\n1∶1，培养 16h，得芽孢生成率90％以上，活菌数为1.09×10 cfu/ml的枯草芽孢杆菌发酵液； \n[0039] 所述的发酵培养基为(质量百分比)：蔗糖1.0％，蛋白胨1.0％、酵母浸粉0.5％，硫酸铵0.2％，硫酸镁0.04％；硫酸锰0.08％、消泡剂0.06％，pH为6.8。 [0040] 4、本发明微生态制剂的制备 \n[0041] 将1、2，3得到的发酵液按2∶1∶1的比例混合均匀后调节pH至7.0左右，进行\n10\n分袋包装，每袋1000mL，制剂中活菌数为1×10 cfu/mL。 \n[0042] 实施例2本发明微生态制剂颗粒剂的制备 \n[0043] 按体积比分别取实施例1中1、2、3的发酵液进行离心，其比例为：粪肠球菌：地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌＝2∶1∶1，离心转速为15000rpm，将离心后得到的菌泥进行混合，然后加入离心前3种发酵液总体积的25％的载体与菌泥进行混合，采用旋转挤压造粒法进行造粒，并通过震动流化床进行干燥，进风70℃，出风35℃，进料速度为120kg/h；得到\n10\n水分含量为8.5％微生态制剂颗粒剂，活菌数在3.5×10 cfu/g。 \n[0044] 实施例3本发明的微生态制剂对鲫鱼消化酶活性和肠道内菌群的影响 [0045] 将180尾鱼种随机分为3组，每组3个重复，分别投喂3种饲料：基础日粮(I组)，在基础日粮(组成成分和营养水平如表1所示)中加入质量百分比为0.02％的实施例2中的复合微生态颗粒制剂(II组)，在基础日粮中添加质量百分比为0.02％的复合微生态液态(III组)。试验水族箱体积为0.85m×0.45m×0.55m，每箱投20尾鱼。 \n[0046] 表1鲫鱼基础日粮的成分及营养水平 \n[0047] \n[0048] \n[0049] 注：添加剂含微量元素和维生素等。 \n[0050] 试验组饲料的制备：将上述各原料粉碎，过60目筛后充分混合，实施例2中复合微生态制剂颗粒剂用碾钵碾细，先与磷酸二氢钙混合，再加添加剂、棒土、沸石粉等，最后加适量水，用小型绞肉机制成直径为2.5mm左右的湿颗粒料，而液态复合微生态制剂组的制作方法是用液体复合微生态取代水，进行添加，然后也制成直径2.5mm大小的湿颗粒料，然后三种饲料均在40℃下烘干12h(至饲料中质量水分为10％左右)。 \n[0051] 饲喂方法：将鲫鱼驯化15天后称重，按鱼体重的2％一4％投喂试验日粮，每天投喂3次(8∶30、13∶30、18∶30)，吸出多余物料，根据饲喂情况调整投饲量，尽量使其饱食而无饲料剩余。饲养期间，水温平均为24.4±3℃。早晚各吸污一次，采用流水系统。饲养75d后分析消化酶活性、肠道菌群等。采用福林酚试剂法测定蛋白酶活性，淀粉酶试剂盒测定淀粉酶活性，结果见表2。 \n[0052] 表2复合微生态制剂对鲫鱼消化酶的影响 \n[0053] \n[0054] 由表2结果可知，与I组相比，II组的肠道食糜中的蛋白质、淀粉酶的活性分别提高了24.3％和58.56％，差异显著(p＜0.05)，肝脏中蛋白酶和淀粉酶活性差异不显著(p＞0.05)，但后者提高了16.20％；与I组相比，III组的肠道食糜中的蛋白质淀粉酶活性也有较大的提高，由此可见，鱼饲料中添加本发明的复合微生态制剂能够提高鲫鱼的消化酶的分泌，从而提高饲料的利用率。 \n[0055] 通过对三组肠道食糜中的菌群的分析，得出结果如表3所示。对菌群的分析方法为科研人员所熟知的方法。 \n[0056] 表3复合微生态制剂对鲫鱼肠道菌群的影响 \n[0057] \n[0058] 由表3结果可见，与I组相比，II和III组的肠道食糜中的芽孢杆菌、乳酸菌的数量分别提高了9.6％、6.9％和23.6％、19.6％，而大肠杆菌则减少9.45％和9.67％，由此可见，饲料中添加本发明的复合微生态制剂，能够促进动物肠道菌群增加，产生一些能够抑制有害菌的挥发性脂肪酸，从而促进乳酸菌的生长，从而使得肠道中的有益菌增加，病原菌减少，形成有益菌的优势菌群，维持和调整肠道微生态平衡。 \n[0059] 实施例4鱼池试验检测本发明复合微生态制剂使用效果 \n[0060] 试验分为三个池，两个处理a和b，一个对照c，每个池2公顷。鱼池初期水源相同，处理池与对照池投放的虾苗和鱼苗量相同。在整个养殖周期内，添加复合微生态制剂的两个处理池a和b，不使用任何抗生素和杀菌剂，平均15d投放一次，投放量为液体微生态制剂\n30L、颗粒微生态制剂为3公斤，对照池平均15d用一次杀菌剂，使用情况如表4所示。 [0061] 表4本发明复合微生态制剂的鱼池使用效果 \n[0062] \n[0063] 由表4结果可知，对照池的氮源污染物含量呈现升高的趋势，而两个处理池在加菌后污染物含量都有所降低，其中处理池b的处理效果要比处理a效果好，其亚氨氮、硝酸