一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术

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一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术\n技术领域\n[0001] 本发明涉及植物脱毒与组培快繁技术领域，具体涉及一种紫马铃薯的根尖脱毒和组培快繁技术。\n背景技术\n[0002] 紫色马铃薯属茄科一年生作物，原产澳大利亚。薯型长椭圆型，表皮光滑，薯肉呈紫黑色，富含花青素、Vc、胡萝卜素等，兼具食用、药用功能。花青素是存在于植物中的水溶性色素，属类黄酮化合物，是目前科学界发现的防治疾病，维护人类健康最直接、最有效、最安全的自由基清除剂，其清除自由基的能力是VC的20倍，VE的50倍。花青素具有小分子结构，是唯一能透过血脑屏障清除自由基保护大脑细胞的物质，同时能减少抗生素给人体的一些危害。花青素除对致癌物质有抑制作用外，还可以增强人体免疫力，延缓衰老，增强体质，增强视力。此外，紫马铃薯果肉淀粉含量高，口感较好，品质极佳，适合深加工。因此，紫马铃薯具有很好的研究开发和综合利用价值。\n[0003] 2000年后本项目组成员从澳大利亚引进了21个紫色马钤薯品种，通过组织继代从中培养了6个品系，2006年移植大地，进行系统选育，获得芽眼浅、表皮光滑、肉色深紫，口感好，并适合加工的甬紫1号新品种，并利用根尖脱毒技术获得脱毒试管苗，通过组织培养技术在实验室进行快速大量繁殖，至今实验室已完成脱毒试管苗15.1万株，同时进行了试管苗移栽试验，移栽成活率达到了98％以上，生产试管薯原原种32万粒，繁殖原种129余亩，初步摸索出了一套适合紫马铃薯的栽培技术。\n[0004] 但在紫马铃薯的田间试植和组培快繁的过程中，很快发现存在有以下两个问题：\n[0005] 一是紫马铃薯田间植株病毒发病严重。经检测，紫马铃薯病毒病是由18种病毒复合侵染所致，其中，9种是专门寄生于马铃薯的病毒，另9种是来自其它寄主植物的病毒。\n其中的马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll virus，PLRV)、马铃薯X病毒(Potato Virus X，，PVX)及马铃薯S病毒(Potato Virus S，PVS)，这\n4种是危害马铃薯(包括紫马铃薯)最严重的病毒，是农业部严格规定必须植检的重点病毒种类；同时这些病毒又均具有难以分离、纯化的特点。针对这一特点，本实验室已研究成功采用多重RT-PCR同步快速检测技术，对紫马铃薯实施高灵敏度的病毒检测，该技术无需分离、纯化，即能快速对紫马铃薯植株或试管苗实施是否带这4种主要病毒及带其中何种病毒的检测。\n[0006] 二是紫马铃薯组培快繁污染率高。在采用传统马钤薯茎尖脱毒的情况下，存在有操作难度大、工作效率低(在显微镜下，用手术工具连续剥离十余层包裹于茎尖外的茎片)，导致难以彻底剥离与消毒，一般组培苗污染率高达60％左右；同时还存有外植体分化速度和脱毒试管苗繁殖速度较慢，微型薯长势弱及移植大田生产薯亩产偏低等问题。\n[0007] 至目前，关于采用以紫马铃薯的根尖为外植体进行脱毒和组培快繁的技术，目前尚未见有文献报导。\n发明内容\n[0008] 本发明目的是，针对马钤薯组培传统茎尖脱毒技术所存在的操作繁琐、效率低、消毒难彻底、组培苗污染率高等问题，提出一种操作简便、效率高、消毒易彻底、组培苗污染率低、繁殖速度快，苗质好并与病毒检测技术相配套的一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术。\n[0009] 一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术，该技术按以下步骤进行：\n[0010] (1)培养基的配制，包括基本培养基和各阶段培养基的组分及其每升所含的重量为：\n[0011] 1)基本培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO350mg/L+KH2PO4500mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7-9g/L，pH 5.6-5.8；\n[0012] 2)根 尖诱 导 培 养基：马铃 薯 基 本培 养 基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.5-1mg/L+NAA0.3-0.7mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0013] 3)增殖培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.2-0.5mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0014] 4)继 代生 长 培 养基：马铃 薯 基 本培 养 基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/0.5L+BA0.2-0.5mg/L+NAA0.1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0015] 5)生根培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0016] 6)微型薯诱导培养基：采用马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+6BA0.5-1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0017] (2)根尖脱毒与快繁：\n[0018] 1)材料预处理和根尖外植体的选取、灭菌：将紫马铃薯种薯放入灭菌细沙内于\n37土2℃下进行热处理6-12周至抽生出根系；取1-2cm长主根根尖，经70％酒精消毒\n30秒、0.1％升汞加一滴土温摇动消毒8分钟及无菌水洗3-5次后，在显微镜下将前端长\n0.1-0.2mm的根尖切下作为外植体，备用；\n[0019] 2)根尖诱导再生植株培养：将外植体接种在步骤(1)2)根尖诱导培养基上，在25土2℃、光强1000lux、光照16小时/d下培养，至四周后其余条件不变光强增强到2000lux，六周后增强到4000lux，八周后减弱到1500lux下继续培养直至从根尖诱导出再生植株幼芽，此阶段总共需培养3.5-4.5个月；\n[0020] 3)幼芽增殖培养：将幼芽接种在步骤(1)3)增殖培养基上，在25土2℃，光强\n2000-3000lux、光照16小时/d下培养1个月至长成8-10cm长小苗；\n[0021] 4)继代生长培养：将小苗剪成2-2.5cm长小段接种在步骤(1)4)继代生长培养基上，在25土2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/d下培养至长成8-10cm长小苗；以后每隔3-4周按同上工艺进行一次继代扩繁，直到满足苗数要求；\n[0022] 5)生根培养：将继代扩增小苗接种到步骤(1)5)生根培养基上，在25土2℃，光强\n2000-3000lux、光照16小时/d下培养，1周后长出根系成为完整试管苗；\n[0023] 6)试管微型薯的培育：将长高至8-10cm的试管苗，剪成带有1-2个叶片和腋芽的茎段，按每瓶5-6个茎段接种至装于三角瓶内的步骤(1)6)微型薯诱导培养基上；在22℃、黑暗条件下培养10-15天始形成微型薯，相同条件下继续培养6-8周后即可收获微型薯；\n[0024] (3)紫马铃薯试管苗或试管微型薯的病毒检测：\n[0025] 1)紫马铃薯病毒ssRNA的制备：选取紫马铃薯马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll virus，PLRV)、马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)及马铃薯S病毒(Potato Virus S，PVS)的叶片、叶梗、茎干或马铃薯块茎为材料，放入100mL0.5Triton X-100 0.4％Na2SO3的病毒浸提液中；置37℃浸提20min，室温浸提1h后取上清液；经12,000r/min离心机离心10min后，取上清液保存于-20℃，备用；\n[0026] 2)cDNA合成：根据马铃薯病毒CP基因序列设计出马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll virus，PLRV)及马铃薯S病毒(Potato Virus S)的特异性引物对；cDNA合成每个反应总体积为\n10μL，反应试剂包括病毒总RNA 2.5μL，1×MMLV，含3mmol/L MgCl2缓冲液，1.5mmol/L dNTPs，2.5U RNA酶抑制剂，50U MMLV反转录酶MMLVRT，0.5μmol/L反义引物；反应程序为\n25℃温育10mim，42℃反转录45mim，95℃灭活2mim；\n[0027] 所述的马铃薯病毒特异性引物对为：\n[0028] PVS上游引物P1：5‘-ATGCCGCCCAAACCGGATCCGTCA-3’\n[0029] PVS下游引物P2：5‘-TCATTGGGTGATTGCATTACGGTG-3’\n[0030] PVY上游引物P3：5‘-GCAAATGACACAATCGATGCAGGA-3’\n[0031] PVY下游引物P4：5‘-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’\n[0032] PVX上游引物P5：5‘-GAGCACAACACAGACCACAG-3’\n[0033] PVX下游引物P6：5‘-GACTAGTTATGGTGGTGGGAGAG-3’\n[0034] PLRV上游引物P7：5‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA-3’\n[0035] PLRV下游引物P8：5‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT-3’；\n[0036] 3)PCR扩增：PCR反应总体积为25μL，取4μL反转录合成的cDNA作为PCR反应模板；多重PCR的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，3.5mmol/L dNTPs，Taq DNA聚合酶2U，0.5mmol/L特异性引物对；扩增程序为94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min；其中PCR反应中所加引物的体积比例为PVX∶PVY∶PLRV∶PVS＝0.4∶0.5∶0.9∶1.0；\n[0037] 4)观察电泳条带：以电泳条带对照、确立紫马铃薯试管苗或试管微型薯有否感染相应病毒。\n[0038] 本发明的有益效果是：\n[0039] 一、本发明在紫马铃薯组培工作中将传统的茎尖脱毒改进为根尖脱毒，产生了以下几点优异效果：\n[0040] 1、操作容易、效率显著提高：因马钤薯的“茎尖”是由外围十余层茎片包裹中心的茎尖而组成，以往在显微镜下，用手术工具连续剥除十余层茎片是一项难度较大而效率很低的工作；而马钤薯的“根尖”直接暴露在外，在显微镜下切取其根尖的尖端就显得十分容易，效率可提高几十倍至上百倍；\n[0041] 2、消毒彻底，污染率低：茎尖脱毒由于其外围茎片不易除净，消毒也就难以彻底，导致组培苗污染率往往高达60％左右；而根尖脱毒由于其外围无任何包裹，消毒容易而彻底，故其组培苗污染率可下降至13.3％(见表1)；\n[0042] 3、提高了组培苗的质量：本发明以根尖为外植体不仅成功培育出了紫马铃薯组培苗，并通过试验后明确，根尖组培苗比茎尖组培苗在外植体分化速度、植株再生速度、试管苗繁殖速度及微型薯产量上均有提高(见表1)；\n[0043] 4、经大田种植试验后明确，根尖脱毒组培苗其生根率和移栽成活率高达98％以上，薯产量也较茎尖脱毒组培苗略有提高。\n[0044] 二、本发明针对紫马铃薯尤其是其根尖的特点，对各级培养基作了适应性改进与调整，确保了根尖组培的成功。\n[0045] 三、本发明对根尖外植体彻底的消毒措施与独特的多重RT-PCR同步快速检测病毒技术相结合，确保了紫马铃薯组培苗的零带毒，从而为紫马铃薯组培苗的优质、安全、高产和大面积推广奠定了基础。\n具体实施方式\n[0046] 通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。\n[0047] 实施例1：(一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术1)\n[0048] (1)培养基的配制，包括基本培养基和各阶段培养基的组分及其每升所含重量为：\n[0049] 1)基本培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO350mg/L+KH2PO4500mg/L+蔗糖25g/L+琼脂7g/L，pH 5.8；\n[0050] 2)根 尖诱 导 培 养基：马铃 薯 基 本培 养 基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.7mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0051] 3)增殖培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0052] 4)继 代生 长 培 养基：马铃 薯 基 本培 养 基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/0.5L+BA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0053] 5)生根培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0054] 6)微型薯诱导培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.1mg/L+6BA0.75mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0055] 所述的马铃薯基本培养基为：马铃薯200g/L+蔗10g/L+琼脂20g/L；\n[0056] (2)根尖脱毒与快繁：\n[0057] 1)材料预处理和根尖外植体的选取、灭菌：将紫马铃薯种薯放入灭菌细沙内于37土2℃下进行热处理6-12周至抽生根系；取1-2cm长主根根尖，经70％酒精消毒30秒、\n0.1％升汞加一滴土温摇动消毒8分钟及无菌水洗3-5次后，在显微镜下将前端0.1-0.2mm根尖切下作为外植体，备用；\n[0058] 2)根尖诱导再生植株培养：将外植体接种在步骤(1)2)根尖诱导培养基上，在25土2℃、光强1000lux、光照16小时/d下培养，至四周后其余条件不变光强增强到2000lux，六周后增强到4000lux，八周后减弱到1500lux下继续培养直至从根尖诱导出再生植株幼芽，此阶段总共需培养3.5-4.5个月；\n[0059] 3)幼芽增殖培养：将再生植株幼芽接种在步骤(1)3)增殖培养基上，在25土2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/d下培养1个月至长成8-10cm长小苗；\n[0060] 4)继代生长培养：将小苗剪成2-2.5cm长小段接种在步骤(1)4)继代生长培养基上，在25土2℃，光强2000-3000lux、光照16小时/d下培养至8-10cm长小苗；以后每隔\n3-4周按同上工艺进行一次继代扩繁，直到满足苗数要求；\n[0061] 5)生根培养：将继代扩繁小苗接种到步骤(1)5)生根培养基上，在25土2℃，光强\n2000-3000lux、光照16小时/d下培养，1周后长出根系成为完整试管苗；\n[0062] 6)试管微型薯的培育：将长高至8-10cm的试管苗，剪成带有1-2个叶片和腋芽的茎段，按每瓶5-6个茎段接种至装于三角瓶内的步骤(1)6)微型薯诱导培养基上，在22℃、暗培养条件下，培养10天至15天始形成微型薯；相同条件下继续培养6-8周后即可收获微型薯；\n[0063] (3)紫马铃薯试管苗的病毒检测：\n[0064] 1)紫马铃薯病毒ssRNA的制备：选取紫马铃薯马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll virus，PLRV)、马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)及马铃薯S病毒(Potato Virus S，PVS)的叶片、叶梗、茎干或马铃薯块茎为材料，放入100mL0.5Triton X-100 0.4％Na2SO3的病毒浸提液中；置37℃浸提20min，室温浸提1h后取上清液；经12,000r/min离心机离心10min后，取上清液保存于-20℃，备用；\n[0065] 2)cDNA合成：根据马铃薯病毒CP基因序列设计出马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll virus，PLRV)及马铃薯S病毒(Potato Virus S)的特异性引物对；cDNA合成每个反应总体积为\n10μL，反应试剂包括病毒总RNA 2.5μL，1×MMLV，含3mmol/L MgCl2缓冲液，1.5mmol/L dNTPs，2.5U RNA酶抑制剂，50U MMLV反转录酶MMLVRT，0.5μmol/L反义引物；反应程序为\n25℃温育10mim，42℃反转录45mim，95℃灭活2mim；\n[0066] 所述的马铃薯病毒(PVX、PVY、PLRV、PVS)特异性引物对为：\n[0067] \n[0068] \n[0069] 3)PCR扩增：PCR反应总体积为25μL，取4μL反转录合成的cDNA作为PCR反应模板；多重PCR的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，3.5mmol/L dNTPs，Taq DNA聚合酶2U，0.5mmol/L特异性引物对；扩增程序为94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min；其中PCR反应中所加引物的体积比例为PVX∶PVY∶PLRV∶PVS＝0.4∶0.5∶0.9∶1.0；\n[0070] 4)观察电泳条带：以电泳条带对照、确立本例紫马铃薯试管苗未感染相应病毒。\n[0071] 实施例2：(一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术2)\n[0072] (1)培养基的配制，包括基本培养基和各阶段培养基的组分及其每升所含重量为：\n[0073] 1)基本培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO350mg/L KH2PO4500mg/L+蔗糖25g/L+琼脂8g/L，pH 5.7；\n[0074] 2)根 尖诱 导 培 养基：马铃 薯 基 本培 养 基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.8mg/L+NAA0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0075] 3)增殖培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.35mg/L+NAA0.35mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0076] 4)继 代生 长 培 养基：马铃 薯 基 本培 养 基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/0.5L+BA0.35mg/L+NAA0.1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0077] 5)生根培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.3mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0078] 6)微型薯诱导培养基：采用马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.3mg/L+6BA0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0079] 步骤(2)的根尖脱毒与快繁中，其步骤、工艺同实施例1；\n[0080] 步骤(3)的病毒检测中，以紫马铃薯试管微型薯为材料，其余步骤、工艺同实施例\n1，检测结果明确紫马铃薯试管微型薯未感染相应病毒。\n[0081] 实施例3：(一种紫马铃薯根尖脱毒与快繁技术3)\n[0082] (1)培养基的配制，包括基本培养基和各阶段培养基的组分及其每升所含重量为：\n[0083] 1)基本培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO350mg/L KH2PO4500mg/L+蔗糖25g/L+琼脂9g/L，pH 5.6；\n[0084] 2)根 尖诱 导 培 养基：马铃 薯 基 本培 养 基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0085] 3)增殖培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0086] 4)继 代生 长 培 养基：马铃 薯 基 本培 养 基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/0.5L+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0087] 5)生根培养基：马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0088] 6)微型薯诱导培养基：采用马铃薯基本培养基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.5mg/L+6BA1.0mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；\n[0089] 步骤(2)的根尖脱毒与快繁中，其步骤、工艺同实施例1；\n[0090] 步骤(3)的病毒检测中，以紫马铃薯试管苗为材料，其余步骤、工艺同实施例1，检测结果明确紫马铃薯试管苗未感染相应病毒。\n[0091] 试验例：(紫马铃薯茎尖脱毒快繁与根尖脱毒快繁的效果对比试验)[0092] 该试验在浙江省农科院病毒学与生物技术研究所卫星车间-浙江省宁波市农科院组织培养中心内进行。\n[0093] 2005年7月11日将甬紫1号紫马铃薯种薯放入灭菌细沙内，于37土2℃下进行热处理6-12周至抽生出根系；取1-2cm长主根根尖158个，经70％酒精消毒30秒、0.1％升汞加一滴土温摇动消毒8分钟及无菌水洗5次完成灭菌后，在显微镜下将其前端0.1-0.2mm的根尖切下作为根尖组培用外植体；另取甬紫1号紫马铃薯茎尖518个，按同样方法经灭菌处理后，在无菌室内显微镜下，逐个用手术工具连续剥除包裹于其外的十余层茎片后，摘出其内长0.1～0.3mm的茎尖，并从中挑选出158个结构较为完整者作为茎尖组培用外植体；\n[0094] 以实施例1各阶段培养基作为培养基，并按该例的步骤、工艺，将上述的根尖和茎尖组培用外植体进行接种、管理与培养，最后将微型薯种入隔离网室进行生产薯生产，试验各阶段的对比结果见表1。\n[0095] 由表1可见，根尖污染21个，污染率为13.3％，而茎尖污染94个污染率高达\n59.5％；根尖平均愈伤组织为27天，而茎尖为28天；根尖形成再生植株平均为123天，而茎尖再生植株为128天；根尖苗的月平均繁殖速度为4.8倍，茎尖苗的月平均繁殖速度只有\n4.3倍；根尖组培苗的平均微型薯为3.1粒/株，茎尖组培苗的平均微型薯为2.4粒/株；\n根尖苗大田亩均产达3088斤，茎尖苗亩均产为2995斤。由此可见根尖组培苗比茎尖组培苗在外植体分化速度、植株再生速度、试管苗繁殖速度及微型薯的组培苗和大田产量均有所提高。\n[0096] 表1紫马铃薯茎尖脱毒与根尖脱毒的效果对比\n[0097]