一种检测人体汗液分泌物的方法

1.一种检测人体汗液分泌物的方法，其特征在于，包括：
(1)将汗潜指印转移到基底上，得到指印样本；
(2)往所述指印样本的汗潜指印上加入纳米金标记的待检测目标分泌物抗体溶液进行孵育10-45min，孵育完成后用洗涤溶液进行冲洗；
(3)将所述的指印样本干燥，然后向汗潜指印上加入银染液，避光显色后，将指印样本冲洗、干燥，判断：
若显示指纹，则汗潜指印中含有待检测目标分泌物；否则，则汗潜指印中不含有待检测目标分泌物；
所述的待检测目标分泌物为表皮生长因子、溶菌酶；
所述纳米金标记的待检测目标分泌物抗体溶液的浓度为0.05～0.2mg/mL；
所述纳米金标记的待检测目标分泌物抗体溶液的溶剂为含2％BSA，0.1％吐温-20的PBS。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，若显示指纹，通过扫描电化学显微镜读取指印样本的指纹特征。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基底为玻璃板、塑料板、不锈钢板、锡箔、硬纸片或胶带。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的洗涤溶液为含0.1％吐温-20的PBS。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述避光显色的时间为15～20min。

一种检测人体汗液分泌物的方法\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物分析和指纹检测技术领域，尤其涉及一种检测人体汗液分泌物的方法。\n背景技术\n[0002] 指纹是人类手指末端指腹上由凹凸的皮肤所形成的纹路，在皮肤发育过程中形成并定型，具有特殊的生理结构和特征体系。在人类的进化过程中，指纹的生理用途是使手在接触物件时增加摩擦力，从而更容易发力及抓紧物件。后来人们又根据其特异性和不变性，将其应用于人身识别及法医鉴定，并延伸到日常生活中的安全检验、个人认证等领域。\n[0003] 指印根据能否被肉眼直接可见分为明显指印和潜在指印，明显指印一般由手沾油漆、血液、墨水等物品转印而成；潜在指印则是经身体自然分泌物如汗液，转移形成的指纹纹路，目视不易发现，是案发现场中最常见的指纹。一枚普通的汗指印约为0.11mg，其中\n99%是水，剩下1%中有一半是氯化钠等无机物，另一半则是油脂、溶菌酶、氨基酸等有机物。\n正是这些微量有机物让科学家在常规的光学显现以及物理吸附法之外，发展出很多化学显现指纹的方法。近年来研究者利用质谱成像、红外/拉曼成像及免疫标记成像等新技术进行指纹显现及指纹成分的检测，从而发掘出更多有价值的生物学和医学信息。比如，恐怖分子是否接触过爆炸物、一个人是否具有吸烟的习惯，科学家都可以通过指纹检测来获取相关信息。\n[0004] 1989年Saunders（74th Annual Enducational Conference,Penacola,USA,1989）提出用多金属沉积法显现潜在指印。其原理是将按有指印的样本放入柠檬酸金中浸泡，一段时间后其中的纳米金粒子就会吸附到指印的嵴上，接着用银染液显影样本，由于纳米金对银离子的还原具有催化的能力，所以银单质会更快的在嵴上析出，使指印的嵴变黑加粗显现出来。该方法中纳米金对指印吸附时的选择性会直接影响显现效果，而且影响结果的因素很多，如溶液pH。后来又有很多科学家对该方法进行改进（如公开号为CN 101703404A的中国专利共公开的“显现多种客体表面指纹且保留DNA信息的方法”），利用的都是纳米金与指印的亲疏水性和静电吸附，但是仍然非特异性吸附严重，影响指纹成像效果，且操作繁琐。\n发明内容\n[0005] 本发明提供了一种检测人体汗液分泌物的方法，可简单、快速、特异的检测目标分泌物，同时还可对含目标分泌物的对象进行人身识别。\n[0006] 一种检测人体汗液分泌物的方法，包括：\n[0007] （1）将汗潜指印转移到基底上，得到指印样本；\n[0008] （2）往所述指印样本的汗潜指印上加入纳米金标记的待检测目标分泌物抗体溶液进行孵育，孵育完成后用洗涤溶液进行冲洗；\n[0009] （3）将所述的指印样本干燥，然后向汗潜指印上加入银染液，避光显色后，将指印样本冲洗、干燥，判断：\n[0010] 若显示指纹，则汗潜指印中含有待检测目标分泌物；否则，则汗潜指印中不含有待检测目标分泌物。\n[0011] 当手指皮肤接触到物体时，皮肤上的分泌物就会在其表面留下痕迹，形成指纹的镜像图。指印由汗垢和油垢组成的嵴线区域和空白的峪线区域组成。指纹的嵴线除大部分水分外，还含有机脂肪酸、氨基酸、溶菌酶和表皮生长因子等人体分泌物。\n[0012] 2006年，英国东英格兰大学的法医学专家David Russell曾提出，吸烟者的汗液里会分泌可替宁（尼古丁的一种代谢产物），借此鉴识人员可以通过检测指纹中的可替宁，来判断指纹所有者是否吸烟。2007年，Russell研究组成功实现了这一设想，后来其还证实了吸毒人员的汗液中会存在相关的毒品代谢物。因此，若人具有吸烟、吸毒习惯等等，其汗液中便会分泌出与烟、毒品相应的特征代谢物。\n[0013] 因此，本申请利用免疫反应的特异性识别机制实现代谢物检测与人身识别的结合。若汗潜指印中含有待检测目标代谢物，则携带有待检测目标分泌物抗体的纳米金颗粒即可定向结合到指纹嵴线上，经银单质沉积显色就可区分出指纹的轮廓和结构，显现出可视化的指纹纹路，同时还可进一步根据显现的指纹来达到人身识别的目的，若经本申请的方法处理后未显现指纹，则汗潜指印中不含有待检测的目标代谢物。\n[0014] 步骤（3）中，将指印样本冲洗、干燥后，若指纹显现，则可通过扫描电化学显微镜进一步读取指印样本的指纹特征。扫描电化学显微镜（SECM）在含有银单质的嵴线上和几乎不含银的峪线处扫描得到的电流大小具有差异，可将地理位置特征转化成电流信号，进一步转化为图像后放大指纹细节。SECM能精确到纳米级尺寸，可最大限度地放大指纹细节。\n[0015] 作为指印的承载物，本申请对基底并没有严格要求，所述的基底为玻璃板、塑料板、不锈钢板、锡箔、硬纸片、胶带、合金、载玻片、导电铜贴、手机膜、糖果纸等。\n[0016] 所述的待检测目标分泌物为表皮生长因子、溶菌酶或可替宁。\n[0017] 所述纳米金标记的待检测目标分泌物抗体溶液的浓度为0.05～0.2mg/mL，优选为0.1～0.2mg/mL。抗体溶液的浓度过高不仅浪费试剂，还会导致非特异性结合，或显色背景重，而浓度过低，则会导致抗原与抗体的反应不完全，银染效果差，从而影响指纹成像效果。其中，纳米金的粒径为一般为15nm。\n[0018] 所述纳米金标记的待检测目标分泌物抗体溶液的溶剂为含2%BSA，0.1%吐温-20的PBS，PBS的浓度为0.01M，pH为7.4。PBS中添加适量的BSA和吐温-20后可降低抗体对基底的吸附作用，使指纹图像更清晰。\n[0019] 为使反应充分进行，所述孵育的时间为10-45min，优选为15min。\n[0020] 所述的洗涤溶液为含0.1%吐温-20的PBS。\n[0021] 所述的银染液为Sigma-aldrich银增强溶液，购买公司为Sigma-aldrich，包括A液和B液，其中A液货号为S5020，B液货号为S5145，使用时将A液和B液按体积比1：1混合。\n[0022] 所述避光显色的时间为15～20min，优选为15min。显色时间过长过短均不利于指纹的清晰成像，若时间太短反应不充分，时间太长则背景过深。\n[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：\n[0024] （1）本发明的方法基于免疫与多金属沉积，特异性高，并且还可通过显现的指纹对含目标分泌物的对象进行人身识别，且指纹显现清晰，指纹显现后可通过肉眼观察到指纹细节特征的一级和二级结构，目标分泌物含量高的情况下可以观察到三级结构汗腺孔。\n[0025] （2）电化学扫描显微镜（SECM）发明于1989年，并得以商业化。SECM测量的是由化学物质氧化或还原给出的电化学电流，样品不限制于导体，也可以是绝缘体或半导体。SECM除了能给出样品表面的形貌外，还能提供丰富的化学信息。本发明的方法在利用SECM显现后可克服深色背景的干扰，对基底的导电性无要求，并能清晰地显现三级汗腺孔结构，是残缺指印识别的重要依据。\n[0026] （3）本发明在指纹显现方面与刷粉等传统方法相比，所需药品毒害小，有利于保护操作人员的安全和减少对环境的污染。\n[0027] （4）在汗液分泌物检测方面，该方法与质谱、红外等相比，具有无需大型仪器辅助、操作简便、结果目视可见等优点。\n[0028] （5）与荧光法相比，本发明的方法不需要外加激发光源，因此不存在背景光干扰，指纹图像更加显著清晰。\n[0029] （6）本发明的方法在对人体代谢物测试的同时可获取被测试者的身份信息，故可推广使用于违禁药品毒品的纠察、刑侦及日常安全如毒驾、酒驾的监察中。\n附图说明\n[0030] 图1为人体汗液分泌物检测的操作流程图。\n[0031] 图2为SECM成像系统的结构示意图；\n[0032] 图3为图2所示的SECM成像系统中样品反应池的结构示意图；\n[0033] 其中，1、样本反应池；2、双恒电位控制仪；3、三维定位装置；4、底座；5、池体；6、凹槽；7、O型密封圈；8、螺栓；9、电极孔；10、工作电极；11、对电极；12、参比电极；13、计算机。\n[0034] 图4a为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体（PBS稀释）检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0035] 图4b为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体（PBS-T-BSA稀释）检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0036] 图5a为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体(浓度为0.02mg/mL)检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0037] 图5b为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体(浓度为0.20mg/mL)检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0038] 图5c为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体(浓度为0.40mg/mL)检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0039] 图6a为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体(显色时间为10min)检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0040] 图6b为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体(显色时间为15min)检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0041] 图6c为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体(显色时间为20min)检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0042] 图7a为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体（孵育时间为5min）检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0043] 图7b为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体（孵育时间为15min）检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0044] 图7c为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体（孵育时间为60min）检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0045] 图8a为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体（孵育温度为常温20±2℃）检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0046] 图8b为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体（孵育温度为37℃）检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0047] 图9a为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体（洗涤溶液为PBS）检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0048] 图9b为用纳米金标记的羊抗人IgG抗体（洗涤溶液为PBS-T）检测得到的人免疫球蛋白G模拟指印银染显色图。\n[0049] 图10为用纳米金标记的可替宁抗体检测得到的潜在指纹银染显色图。\n[0050] 图11为用纳米金标记的溶菌酶抗体检测得到的潜在指纹银染显色图。\n[0051] 图12是表皮生长因子（EGF）作为检测目标物，经免疫多金属沉积后的指纹图像。\n[0052] 图13为人免疫球蛋白G（hIgG）模拟指印经免疫多金属沉积后的图像及用SECM局部放大后的图像。\n[0053] 图14为人免疫球蛋白G（hIgG）模拟指印在不同基底上经免疫多金属沉积后的图像。\n具体实施方式\n[0054] 下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。\n[0055] SECM成像系统可采用常规的结构，具体购自上海辰华仪器公司，型号为CHI920C。\n[0056] 如图2和图3所示，SECM成像系统包括样本反应池1、双恒电位控制仪2、高分辨的三维定位装置3和计算机13。\n[0057] 双恒电位控制仪2包括工作电极10、对电极11和参比电极12，计算机13对整个过程进行操控，其中，工作电极为直径25μm的超微电极（Pt），对电极为铂丝，参比电极为Ag电极。\n[0058] 三维定位装置3由步进电机与压电晶体组成，可对超微电极进行三维定位，允许\n50毫米的运行距离并达到纳米的空间分辨。\n[0059] 样本反应池1包括底座4和用于容纳反应液的池体5，均可采用聚四氟乙烯材料或其他不会被反应液腐蚀的材料。底座4上具有用于样本的凹槽6。\n[0060] 池体5通过螺栓8固定在底座4上，池体5的两侧各设有一个电极孔9，工作时，参比电极12放置于其中一个电极孔内，对电极11放置于另一个电极孔内，池体5中空，池体\n5的中空部位正对凹槽6，且该中空部位设有O型密封圈7。\n[0061] 将免疫多金属沉积后的指印样本固定于SECM成像系统的样本反应池底座的凹槽\n6中，向池体5内加入反应液（反应液为含有1mM氯铱酸钾的硝酸钾水溶液（0.1M）），反应液液面要能没过参比电极和对电极；将反应池放置于SECM平台上，在“探针趋近模式”下施加±0.8V的电位将探针靠近指纹表面；确定需要进行扫描的区域，选择“探针扫描模式”分别沿着X和Y方向扫描，根据单线电流的变化趋势调节平台使其尽量趋于水平。最后选择“扫描电化学显微镜模式”采集指纹细节图像。\n[0062] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。\n[0063] 本发明可基于免疫多金属沉积和SECM显现指印并检测目标分泌物，将承载有汗指印的样本经纳米金修饰的抗体溶液孵育，洗涤氩气吹干后，加入银染液显影，用滤纸吸去银染液后用水冲洗吹干。接着将其固定于反应池中，加入反应液，施加电位后扫描采集指纹图像。\n[0064] 在本发明中，SECM的探头先移动至指纹表面，然后在X-Y的平面上进行扫描。由于探头很靠近指纹，当移动到指纹不同位置时，其电流会因为指纹嵴上的银单质对溶液中反应的促进作用而增大，得到产生电流与位置相关的图像。将各个点电流用不同颜色的点代表，就可以还原指纹细节。\n[0065] 纳米金标记的可替宁抗体由杭州隆基生物技术有限公司合成；纳米金标记的羊抗人IgG抗体纳米金标记的羊抗人表皮生长因子抗体和纳米金标记的溶菌酶抗体由上海生工生物股份有限公司合成，其中，纳米金为粒径15nm的柠檬酸修饰的金纳米粒子，羊抗人IgG抗体的货号为DAC1011（生工生物工程有限公司），溶菌酶抗体的货号为DAC1011（生工生物工程有限公司），羊抗人表皮生长因子抗体的货号为DA1709。\n[0066] 银染液：购买公司为Sigma-aldrich，包括A液和B液，其中，A液货号为S5020，B液货号为S5145。\n[0067] 实施例1\n[0068] 1、抗体溶剂对指纹成像的影响\n[0069] （1）基底处理\n[0070] 基底为专业指印提取胶带，其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上，将其作为支撑物。\n[0071] （2）人免疫球蛋白G模拟指印样本的制备：\n[0072] 试验者首先用肥皂将手洗净，去离子水冲洗后用吹风机吹干，在手指上涂抹上\n1mg/mL的人免疫球蛋白G溶液25μL，待干后轻轻按在胶带上2min，得到模拟的蛋白指印。\n[0073] （3）免疫多金属沉积成像：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池中加入100μL 0.1mg/mL纳米金标记的羊抗人IgG抗体溶液（溶剂为含2%BSA，0.1%吐温-20的0.01M PBS，pH为7.4；以pH为7.4的PBS为对照），常温孵育15min；\n[0074] 孵育完成后用洗涤溶液（0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲溶液）冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再加入200μL银染液（A：\nB=1：1），于暗室中避光显色15min，用去离子水冲洗后氩气吹干；经显色后的样本可直接用肉眼进行观察，或用数码相机拍照采集图像。\n[0075] 如图4a和图4b所示，采用PBS稀释纳米金标记的羊抗人IgG抗体，抗体对基底吸附严重（图4a），指纹成像不清晰，在PBS中添加了吐温和BSA后，明显减少了其对基底的吸附，指纹纹理清晰（图4b）。\n[0076] 2、不同浓度的纳米金标记的羊抗人IgG抗体溶液对指纹成像的影响\n[0077] （1）基底处理\n[0078] 基底为专业指印提取胶带，其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上，将其作为支撑物。\n[0079] （2）人免疫球蛋白G模拟指印样本的制备：\n[0080] 试验者首先用肥皂将手洗净，去离子水冲洗后用吹风机吹干，在手指上涂抹上\n1mg/mL的人免疫球蛋白G溶液25μL，待干后轻轻按在胶带上2min，得到模拟的蛋白指印。\n[0081] （3）免疫多金属沉积成像：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池中加入100μL纳米金标记的羊抗人IgG抗体溶液（溶剂为含2%BSA，0.1%吐温-20的0.01M PBS，pH为7.4），于常温孵育15min；\n[0082] 孵育完成后用洗涤溶液（0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲溶液）冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再加入200μL银染液（A：\nB=1：1），于暗室中避光显色15min，用去离子水冲洗后氩气吹干；经显色后的样本可直接用肉眼进行观察，或用数码相机拍照采集图像。\n[0083] 图5a-5c示出了纳米金标记的羊抗人IgG抗体溶液的浓度分别为0.02、0.20、\n0.40mg/mL时采集的指纹图像，纳米金标记的羊抗人IgG抗体溶液的浓度太低（0.02mg/mL），银染显色效果不够明显（图5a）；浓度太高（0.40mg/mL）会使背景颜色加深（图5c）；\n0.20mg/mL的显色效果最好（图5b）。\n[0084] 3、银染显色时间对指纹成像的影响\n[0085] （1）基底处理\n[0086] 基底为专业指印提取胶带，其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上，将其作为支撑物。\n[0087] （2）人免疫球蛋白G模拟指印样本的制备：\n[0088] 试验者首先用肥皂将手洗净，去离子水冲洗后用吹风机吹干，在手指上涂抹上\n1mg/mL的人免疫球蛋白G溶液25μL，待干后轻轻按在胶带上2min，得到模拟的蛋白指印。\n[0089] （3）免疫多金属沉积成像：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池中加入100μL 0.1mg/mL纳米金标记的羊抗人IgG抗体溶液（含2%BSA，0.1%吐温-20的0.01M PBS，pH为7.4），于常温孵育15min；\n[0090] 孵育完成后用洗涤溶液（0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲溶液）冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再加入200μL银染液（A：\nB=1：1），于暗室中避光显色，用去离子水冲洗后氩气吹干；经显色后的样本可直接用肉眼进行观察，或用数码相机拍照采集图像。\n[0091] 图6a-6c示出了避光显色时间分别为10、15、25min时采集的指纹图像，银染时间太短（10min），颜色较浅，显色不够深（图6a）；银染时间太长（25min），会使背景颜色加深（图6c）；显色15min较为合适（图6b）。\n[0092] 4、孵育时间对指纹成像的影响\n[0093] （1）基底处理\n[0094] 基底为专业指印提取胶带，其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上，将其作为支撑物。\n[0095] （2）人免疫球蛋白G模拟指印样本的制备：\n[0096] 试验者首先用肥皂将手洗净，去离子水冲洗后用吹风机吹干，在手指上涂抹上\n1mg/mL的人免疫球蛋白G溶液25μL，待干后轻轻按在胶带上2min，得到模拟的蛋白指印。\n[0097] （3）免疫多金属沉积成像：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池中加入100μL 0.1mg/mL纳米金标记的羊抗人IgG抗体溶液（含2%BSA，0.1%吐温-20的0.01M PBS，pH为7.4），于常温孵育；\n[0098] 孵育完成后用洗涤溶液（0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲溶液）冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再加入200μL银染液（A：\nB=1：1），于暗室中避光显色15min，用去离子水冲洗后氩气吹干；经显色后的样本可直接用肉眼进行观察，或用数码相机拍照采集图像。\n[0099] 图7a-7c示出了孵育时间分别为5、15、60min时采集的指纹图像，银染时间太短（5min），颜色较浅，显色不够深（图7a）；孵育时间太长（60min），会使非特异性吸附增多且浪费时间（图7c）；孵育15min较为合适（图7b）。\n[0100] 5、孵育温度对指纹成像的影响\n[0101] （1）基底处理\n[0102] 基底为专业指印提取胶带，其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上，将其作为支撑物。\n[0103] （2）人免疫球蛋白G模拟指印样本的制备：\n[0104] 试验者首先用肥皂将手洗净，去离子水冲洗后用吹风机吹干，在手指上涂抹上\n1mg/mL的人免疫球蛋白G溶液25μL，待干后轻轻按在胶带上2min，得到模拟的蛋白指印。\n[0105] （3）免疫多金属沉积成像：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池中加入100μL 0.1mg/mL纳米金标记的羊抗人IgG抗体溶液（含2%BSA，0.1%吐温-20的0.01M PBS，pH为7.4），孵育15min；\n[0106] 孵育完成后用洗涤溶液（0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲溶液）冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再加入200μL银染液（A：\nB=1：1），于暗室中避光显色15min，用去离子水冲洗后氩气吹干；经显色后的样本可直接用肉眼进行观察，或用数码相机拍照采集图像。\n[0107] 图8a-8b示出了孵育温度分别为常温（20±2℃）和37℃时采集的指纹图像，发现常温条件下（图8a）和37℃（图8b）时银染效果没有明显差异，故从实验简便考虑选择常温下进行孵育。\n[0108] 6、洗涤剂溶液对指纹成像的影响\n[0109] （1）基底处理\n[0110] 基底为专业指印提取胶带，其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上，将其作为支撑物。\n[0111] （2）人免疫球蛋白G模拟指印样本的制备：\n[0112] 试验者首先用肥皂将手洗净，去离子水冲洗后用吹风机吹干，在手指上涂抹上\n1mg/mL的人免疫球蛋白G溶液25μL，待干后轻轻按在胶带上2min，得到模拟的蛋白指印。\n[0113] （3）免疫多金属沉积成像：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池中加入100μL 0.1mg/mL纳米金标记的羊抗人IgG抗体溶液（含2%BSA，0.1%吐温-20的0.01M PBS，pH为7.4），于常温孵育15min；\n[0114] 孵育完成后用洗涤溶液冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再加入\n200μL银染液（A：B=1：1），于暗室中避光显色15min，用去离子水冲洗后氩气吹干；经显色后的样本可直接用肉眼进行观察，或用数码相机拍照采集图像。\n[0115] 图9a-9b示出了洗涤溶液分别为PBS（0.01M，pH7.4）和PBS-T（0.01M含0.1%吐温-20的PBS，pH7.4）时采集的指纹图像，使用含tween-20的洗涤溶液得到的显色图像（图\n9b）比不含tween-20的洗涤溶液得到的图像（图9a）中二级和三级结构更清晰。\n[0116] 实施例2基于免疫多金属沉积显现指印并检测指纹中的可替宁\n[0117] （1）基底处理\n[0118] 基底为专业指印提取胶带，其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上，将其作为支撑物。\n[0119] （2）汗潜指印样本的制备：吸烟者用香皂将手洗净，热风吹干后，戴上PE手套捂汗\n5min，然后在基底上按1min，得到汗潜指印。\n[0120] （3）免疫多金属沉积成像：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池中加入100μL 0.1mg/mL纳米金标记的可替宁抗体溶液（溶剂为含2%BSA，0.1%吐温-20的0.01M PBS，pH为7.4），于常温培养15min；\n[0121] 孵育完成后用洗涤溶液（0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲溶液）冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再加入200μL银染液（A：\nB=1：1），于暗室中避光显色15min，用去离子水冲洗后氩气吹干；经显色后的样本可直接用肉眼进行观察，或用数码相机拍照采集图像。图像如图10，可见指纹图像纹理清晰可见。\n[0122] 实施例3基于免疫多金属沉积显现指印并检测指纹中的溶菌酶\n[0123] （1）基底处理\n[0124] 基底为专业指印提取胶带，其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上，将其作为支撑物。（2）汗潜指印样本的制备：测试者用香皂将手洗净，热风吹干后，戴上PE手套捂汗5min，然后在基底上按1min，得到汗潜指印。\n[0125] （3）免疫多金属沉积成像：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池中添加100μL 0.1mg/mL纳米金标记的溶菌酶抗体溶液（溶剂为含2%BSA，0.1%吐温-20的0.01M PBS，pH为7.4），于常温孵育15min；\n[0126] 孵育完成后用洗涤溶液（0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲溶液）冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再加入200μL银染液（A：\nB=1：1），于暗室中避光显色15min，用去离子水冲洗后氩气吹干；\n[0127] 经显色后的样本可直接用肉眼进行观察，或用数码相机拍照采集图像，图像如图\n11，可见指纹图像纹理清晰可见。\n[0128] 实施例4基于免疫多金属沉积显现指印并检测指纹中的表皮生长因子\n[0129] （1）基底处理\n[0130] 基底为专业指印提取胶带，其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上，将其作为支撑物。\n[0131] （2）汗潜指印样本的制备：吸烟者用香皂将手洗净，热风吹干后，戴上PE手套捂汗\n5min，然后在基底上按1min，得到汗潜指印。\n[0132] （3）免疫多金属沉积成像：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池中加入100μL 0.1mg/mL纳米金标记的表皮生长因子（EGF）抗体溶液（溶剂为含2%BSA，0.1%吐温-20的0.01M PBS，pH为7.4），于常温培养\n15min；\n[0133] 孵育完成后用洗涤溶液（0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲溶液）冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再加入200μL银染液（A：\nB=1：1），于暗室中避光显色15min，用去离子水冲洗后氩气吹干；经显色后的样本可直接用肉眼进行观察，或用数码相机拍照采集图像。图像如图12，可见指纹图像纹理清晰可见。\n[0134] 实施例5基于免疫多金属沉积和SECM显现指印并检测人免疫球蛋白G模拟指印[0135] （1）基底处理\n[0136] 基底为专业指印提取胶带，其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上，将其作为支撑物。\n[0137] （2）人免疫球蛋白G模拟指印样本的制备：\n[0138] 试验者首先用肥皂将手洗净，去离子水冲洗后用吹风机吹干，在手指上涂抹上\n1mg/mL的人免疫球蛋白G溶液25μL，待干后轻轻按在胶带上2min，得到模拟的蛋白指印。\n[0139] （3）免疫多金属沉积成像：用免疫组化笔在指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池中加入100μL 0.1mg/mL纳米金标记的羊抗人IgG抗体溶液（含2%BSA，0.1%吐温-20的0.01M PBS，pH为7.4），于常温孵育15min；\n[0140] 孵育完成后用洗涤溶液（0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲溶液）冲洗以洗去未结合的抗体，用氩气将表面吹干，再加入200μL银染液（A：\nB=1：1），于暗室中避光显色15min，用去离子水冲洗后氩气吹干；经显色后的样本可直接用肉眼进行观察，或用数码相机拍照采集得图13中（a）所示图像。\n[0141] （4）SECM放大指印细节\n[0142] 将免疫多金属沉积后的指印样本固定于SECM成像系统的样本反应池中，向池体内加入反应液（反应液为含有氯铱酸钾（1mM）的硝酸钾水溶液（0.1M）），放置于SECM平台上并调节使其水平，施加0.8V的电位将探针靠近指纹表面，选择需要进行扫描的区域，扫描采集指纹细节图像如图13中（b）所示，同时可得到各处的电流值如图13中（c）所示。\n[0143] 实施例6基于免疫多金属沉积显现并检测不同基底上的人免疫球蛋白G模拟指印[0144] （1）指印样本制备\n[0145] 在不同的客体上（锡箔，合金，载玻片，导电铜贴，手机膜，糖果纸）试验者首先用肥皂将手洗净，去离子水冲洗后用吹风机吹干，在手指上涂抹上1mg/mL的人免疫球蛋白G溶液25μL，待干后轻轻按在各客体上2min，得到模拟的蛋白指印。\n[0146] （2）免疫多金属沉积成像\n[0147] 用免疫组化笔在指印样本的指印周围画一个圈，形成一个反应池，以避免抗体溶液扩散，向反应池内加入100μL含有0.2mg/mL纳米金标记的羊抗人免疫球蛋白G抗体溶液（溶剂是0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20、2%（w/v）BSA的磷酸盐缓冲溶液），常温孵育15min；\n[0148] 孵育完成后用洗涤剂（0.01M，pH 7.4，含0.15M NaCl、0.1%（v/v）Tween-20的磷酸盐缓冲溶液）洗涤指印样本3次后吹干，加入200μL银染液（A：B=1□：1）显色15min，滤纸吸干，用相机采集得图14所示图像，其中（a）：锡箔，（b）：合金，（c）：载玻片，（d）：导电铜贴，（e）：手机膜，（f）：糖果纸，图中可见，虽然客体不同，但采用本申请的方法均可获得清晰的指纹图像。