虎皮兰多糖及其制备方法和应用

1.虎皮兰多糖TPS，它是由下述方法制得：
A. 虎皮兰粗多糖提取
1）取虎皮兰干粉，经石油醚提取，90℃回流至提取液基本无颜色，后用80%乙醇60℃回流2h；
2）采用恒温水浴锅提取，提取温度为90℃，提取时间为160min，固液比为1:30，热水浸提；
3）提取液经旋转蒸发仪减压浓缩，加3倍体积的95%乙醇4℃沉淀过夜；
4）沉淀经离心机离心，依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，最后经真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得虎皮兰粗多糖；
B.热水浸提得到的粗多糖采用酶法结合Sevage法脱蛋白
1）将待脱蛋白的多糖溶液调pH8.0，以2%的量加入胰蛋白酶，37℃条件下作用2h，间隔搅拌，然后升至80℃灭酶；
2）将处理过的提取液4000r/min离心10min，取上清液浓缩，用Sevag法脱蛋白，重复
3次；
3)用透析法将脱蛋白后的虎皮兰多糖浓缩液，放4℃用蒸馏水透析48h，中间更换数次，透析后浓缩，3倍95%乙醇沉淀，离心后真空冷冻干燥，即得初步纯化虎皮兰多糖TPS。
2.虎皮兰多糖TPS-H，它是由下述方法制得：
将权利要求1所述的虎皮兰多糖TPS 过DEAE-52柱层析纯化，依次用去离子水和
0.05、0.1、0.2、0.3mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，分别收集第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ洗脱峰，取第Ⅰ洗脱峰浓缩、透析至AgNO3检测无白色沉淀产生为止，冷冻干燥；收集的第Ⅰ洗脱峰，再经SephadexG-100柱分别层析纯化，即为虎皮兰多糖TPS-H。
3.虎皮兰多糖TPS-A，它是由下述方法制得：
将权利要求1所述的虎皮兰多糖TPS 过DEAE-52柱层析纯化，依次用去离子水和
0.05、0.1、0.2、0.3mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，分别收集第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ洗脱峰，取第Ⅱ洗脱峰浓缩、透析至AgNO3检测无白色沉淀产生为止，冷冻干燥；收集的第Ⅱ洗脱峰，再经SephadexG-100柱分别层析纯化，即为虎皮兰多糖TPS-A。
4.虎皮兰多糖在生产治疗人肺癌、人鼻咽癌或人皮肤T细胞淋巴瘤药物的应用，所述的虎皮兰多糖为权利要求1所述的虎皮兰多糖TPS、权利要求2所述的虎皮兰多糖TPS-H或权利要求3所述的皮兰多糖TPS-A。

虎皮兰多糖及其制备方法和应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种植物活性成份的提取，具体地说是虎皮兰多糖及其制备方法和应用。\n背景技术\n[0002] 虎皮兰（Sansevieria trifasciata）又名金边虎皮兰，典型的龙舌兰科虎尾兰属植物。这种植物源自于非洲西部，是一种常绿多年生草本植物，在热带、亚热带均有分布，对环境的适应能力强。\n[0003] 虎皮兰具有根状茎，叶片坚挺直立，姿态刚毅，剑型的叶片，深绿色叶片边缘伴有黄色带状条纹。它品种较多，株形和叶色变化较大，精美别致，是一种适合盆栽的室内观赏性植物，即使在低光照、少水分条件下依然可生存。此外，由于虎皮兰叶片中含有大量麻质纤维，叶片韧性强，可用于造纸加工业和优质纤维品种的开发中。\n[0004] 同时，虎皮兰还是一种能净化室内环境的观叶植物。经NASA研究发现，虎皮兰能够提高室内空气质量，被动吸收类似氮氧化合物及甲醛等有害气体，常作为一种室内环保型观叶植物深受大众喜爱。另外，药理作用方面，金边虎皮兰味甘微辛， 性平， 无毒，具有润肺、化痰止咳之功， 可用于化痰定喘， 治咳嗽吐血、治哮喘等。\n[0005] 近年来研究表明，虎皮兰中含有大量的蛋白质、钙、粗纤维、色素及各种人体所必需的营养元素，虎皮兰中的氨基酸种类齐全、含量丰富，所含多种人体必需的微量元素，维生素C含量较高，重金属元素的含量低于我国食品重金属残留限量国家标准。\n[0006] 多糖（polysaccharides）又称多聚糖，是由多个单糖单位、如醛糖或酮糖通过苷键连接在一起的多聚物。多糖按其在生物体内的功能可分为两类：一类水不溶性的，用于形成动植物的支持介质，如植物中的纤维素、动物中的甲壳素等；另一类是动植物的贮存养料，在酶的催化作用下水解释放单糖来提供能量，如淀粉、糖原等。其中，由一种单糖组成的多糖称作均多糖， 由两种以上单糖组成的多糖称作杂多糖。多糖广泛存在于高等植物、微生物（真菌、细菌）、藻类等细胞壁中，以及动物细胞膜中，目前对其研究较多的是植物多糖和真菌类多糖。\n[0007] 自从1936年Shear发现了多糖抑制肿瘤活性以来，科学家相继提出一些高等植物多糖和真菌类生物多糖也具有明显的抗肿瘤活性。20世纪50年代，随着我国中药和天然药物化学的发展，中药多糖显著的免疫活性，为中药免疫药理学提供了依据。70年代以来，随着对新药物资源的探索与研究，人们对多糖及其复合物作用的认识逐步深入，多糖作为能量来源与构成材料，存在于细胞膜结构中，并参与细胞的各种生命活动，从而有了后继对于多糖其他生物活性的研究，如抗肿瘤、免疫调节、抗菌抗病毒、抗氧化、降血脂、抗辐射等作用，近年来，又发现多糖在控制细胞的分裂和分化，调节自身的生长和衰老方面起着决定性作用。因此，针对多糖的分离纯化、化学组成和结构分析，以及生物活性测定等方面展开一系列深入研究，并对其进行化学修饰，通过研究多糖构效关系，从而提高多糖的活性，为寻求和探索靶向抗肿瘤药物的研制提供坚实的理论基础。\n[0008] 日本对植物多糖的提取纯化技术有日新月异的发展，分别从新工艺、新资源、新用途上对多糖的利用进行改进。在欧美一些国家，一些特殊的真菌多糖以及多糖蛋白结合物作为传统医药被用于多种疾病如：肝炎、高血压、高血脂和胃癌的治疗中。\n[0009] 我国在多糖方面的研究起步晚，尚未形成多糖生物化学及药用相关方面的研究战略和机构。依赖于我国比较丰富的中草药资源和完备的传统中医理论，近年来对植物多糖的研究也有了一定的进展。至今为止我国已对上百种多糖进行了结构分析和生物活性鉴定，已上市销售的几种多糖也取得了良好的经济效益。近年来，天津药业生物科技有限公司通过对草本植物有效功效部位生物活性化提取，将传统提取的多糖混合物转化成具有生物活性的多糖分子—GPS，该种多糖的纯度达到98%以上，从而使中国天然植物多糖提取技术达到世界领先水平。经国家权威机构药理、药效研究证明：这种活性多糖具有激活、增强和调节人体免疫能力和抵制肿瘤、抗炎、抗病毒、修复自身免疫性疾病的功效。\n[0010] 近年来，真菌类多糖由于其潜在功能在化工、制药、食品等行业引起广泛关注。香菇多糖、灵芝多糖等药理作用以及分离、纯化技术已成为国内众多领域的研究热点，其中，银耳多糖、槐耳（Trametesrobin iophila）、云芝多糖（Coriolan）的发开利用较多，已分别作为国家中药一类、二类新药投入生产。随着多糖基础研究步伐的加快，菌类多糖类制品将会在药物、保健品、食品、化妆品、环保材料等方面取得相应发展。尽管国内对多糖在分离纯化，生物活性和药理等方面的研究取得一定进展，然而对多糖的结构和构效关系的研究仍没有较大突破。因此，多学习借鉴别国先进的相关专利技术，在一定程度上可以使我们了解当今世界多糖的研究前沿，同时也为加深多糖生物学基础性研究和探索，加快多糖工程产业规模化的兴起，以及开展新药研发提供有益的借鉴。\n发明内容\n[0011] 本发明的目的是提供虎皮兰多糖TPS、TPS-H和TPS-A。\n[0012] 虎皮兰多糖TPS、TPS-H和TPS-A，它是由下述方法制得：\n[0013] 虎皮兰干粉经石油醚、乙醇溶液回流除杂，在采用热水浸提，收集提取液，经减压浓缩后加入乙醇使多糖沉淀，离心，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，真空冷冻干燥，得虎皮兰水溶性多糖粗品，再经酶法结合Sevage法脱蛋白，获得虎皮兰多糖TPS；\n[0014] 将虎皮兰多糖TPS 过DEAE-52柱层析纯化，依次用去离子水和0.05、0.1、0.2、\n0.3mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，分别收集第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ洗脱峰，取第Ⅰ或Ⅱ洗脱峰浓缩、透析至AgNO3检测无白色沉淀产生为止，冷冻干燥；收集的第Ⅰ洗脱峰，再经SephadexG-100柱分别层析纯化即为，虎皮兰多糖TPS-H；\n[0015] 收集的第Ⅱ洗脱峰，再经SephadexG-100柱分别层析纯化，即为虎皮兰多糖TPS-A；\n[0016] 本发明的又一个目的是虎皮兰多糖在生产治疗人肺癌、人鼻咽癌或人皮肤T细胞淋巴瘤药物的应用。\n[0017] 所述的虎皮兰多糖为虎皮兰多糖TPS、TPS-H或TPS-A；\n[0018] 优选虎皮兰多糖TPS-A。\n[0019] 本发明提供的虎皮兰多糖及其制备方法和应用，虎皮兰多糖是将虎皮兰叶经干燥、粉碎、过筛，加入一定体积的石油醚、乙醇回流除杂，提取液经抽滤得滤渣，滤渣风干备用。采用热水浸提法提取虎皮兰的多糖，粗多糖经酶法结合Sevag法脱蛋白。脱蛋白后的虎皮兰多糖TPS，依次经DEAE-52柱层析和Sephdex G-100柱层析分离纯化，分别得到四种均一组分：TPS-A、TPS-B、TPS-C、TPS-H，TPS 、TPS-H、TPS-A对人肺癌细胞A549、人鼻咽癌细胞系CNE和人皮肤T细胞淋巴瘤Hut 102的生长有明显的抑制作用，其中TPS-A效果最佳；对人结肠癌细胞LoVo细胞无抑制作用，对人正常肝细胞LO2无杀伤效果，为其在靶向抗肿瘤药物的研制中提供了科学依据。\n附图说明\n[0020] 图1 为DEAE-52柱分离纯化虎皮兰多糖洗脱结果；\n[0021] 图2 为SephadexG-100柱层析分离纯化虎皮兰多糖TPS-H洗脱结果；\n[0022] 图3 为SephadexG-100柱层析分离纯化虎皮兰多糖TPS-A洗脱结果；\n[0023] 图4 为SephadexG-100柱层析分离纯化虎皮兰多糖TPS-B洗脱结果；\n[0024] 图5 为SephadexG-100柱层析分离纯化虎皮兰多糖TPS-C洗脱结果；\n[0025] 图6 为虎皮兰多糖TPS-H的紫外光谱扫描结果；\n[0026] 图7 为虎皮兰多糖TPS-A的紫外光谱扫描结果；\n[0027] 图8 为虎皮兰多糖TPS-B的紫外光谱扫描结果；\n[0028] 图9为虎皮兰多糖TPS-C的紫外光谱扫描结果；\n[0029] 图10为本发明虎皮兰多糖A549细胞活性试验结果；\n[0030] 图11本发明虎皮兰多糖CNE细胞活性试验结果；\n[0031] 图12本发明虎皮兰多糖Hut 102细胞活性试验结果；\n[0032] 图13为TPS-A对LO2细胞影响的倒置显微镜下观察结果，其中,1：对照组；2：加样组；\n[0033] 图14为TPS-A对A549细胞影响的倒置显微镜下观察结果，其中,1：对照组；2：加样组；\n[0034] 图15为TPS-A对CNE细胞影响的倒置显微镜下观察结果，其中,1：对照组；2：加样组；\n[0035] 图16为TPS-A对Hut102细胞影响的倒置显微镜下观察结果，其中,1：对照组；2：\n加样组。\n具体实施方式\n[0036] 实施例1\n[0037] 1）取虎皮兰干粉，经石油醚提取，90℃回流至提取液基本无颜色，后用80%乙醇\n60℃回流2h。\n[0038] 2）采用DK-98-1恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）提取，在条件提取温度为90℃，提取时间为160min，固液比为1:30下采用热水浸提。\n[0039] 3）提取液经RE-52C旋转蒸发仪（上海青浦仪器厂）减压浓缩，加3倍体积的95%乙醇4℃沉淀过夜。\n[0040] 4）沉淀经DL-5-B离心机离心（上海安亭科学仪器厂），依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，最后经FD-1B-50真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）冷冻干燥，即得虎皮兰粗多糖。\n[0041] 实施例2热水浸提得到的粗多糖采用酶法结合Sevage法脱蛋白 \n[0042] 1）将待脱蛋白的多糖溶液调pH8.0，以2%的量加入胰蛋白酶，37℃条件下作用2h，间隔搅拌，然后升至80℃灭酶。\n[0043] 2）将处理过的提取液4000r/min离心10min，取上清液浓缩，用Sevag法脱蛋白，重复3次。\n[0044] 3)用透析法将脱蛋白后的虎皮兰多糖浓缩液，放4℃用蒸馏水透析48h，中间更换数次，透析后浓缩，3倍95%乙醇沉淀，离心后真空冷冻干燥，即得初步纯化虎皮兰多糖TPS。\n[0045] 实施例3 脱蛋白后的多糖过DEAE-52柱层析纯化：\n[0046] 1)选用规格为3.2cm×40cm的层析柱，用3-5倍柱体积的去离子水在恒定压力下走柱，以1ml/min的流速通过层析柱。\n[0047] 2)取脱蛋白后的粗多糖溶于少量蒸馏水，采用0.5g上样量，上样体积为10ml。\n[0048] 3）依次用去离子水和0.05、0.1、0.2、0.3mol/L的NaCl溶液洗脱，控制流速\n0.75ml/min，SBS-100自动部分收集器（上海沪西仪器厂）收集洗脱液，每管约10ml收集。\n[0049] 4）分别合并收集第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ洗脱峰，浓缩，透析至AgNO3检测无白色沉淀产生为止，真空冷冻干燥。5个洗脱峰依次记为：TPS-H、TPS-A、TPS-B、TPS-C、TPS-D。DEAE-52柱分离纯化虎皮兰多糖洗脱结果见图1\n[0050] 实施例4 多糖的SephadexG-100柱层析纯化：\n[0051] 1)采用凝胶柱规格为2.6.cm×60cm，上样前用0.1mol/L的NaCl平衡层析柱至少\n3-5个柱体积。\n[0052] 2)取适量DEAE-52中收集的前四种主成分TPS-H、TPS-A、TPS-B、TPS-C，溶于\n0.1mol/L的NaCl溶液中，上样量为1%、5ml的多糖液。\n[0053] 3）用0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为0.5ml/min，每管收集5ml。\n[0054] 4）合并、收集各洗脱峰，透析，减压浓缩，冷冻干燥，即得精制虎皮兰多糖。\n[0055] 过柱后得到四种多糖组分：依次记为TPS-H、TPS-A、TPS-B、TPS-C。SephadexG-100柱层析分离纯化虎皮兰多糖洗脱结果见图2、3、4、5。\n[0056] 结果发现：经过SephadexG-100葡聚糖凝胶层析柱的洗脱峰均呈单一对称型窄峰，说明纯化后多糖组分在分子量分布上为均一组分。\n[0057] 实施例5\n[0058] 将多糖组分制成2mg/ml的溶液，用紫外分光光度计进行扫描。\n[0059] 结果发现：紫外光谱显示四种多糖组分在260、280nm处无明显吸收峰，说明纯化后多糖组分不含有核酸、蛋白质等杂质。多糖组分的紫外光谱扫描结果见图6、7、8、9。\n[0060] 实施例6\n[0061] 1）人肺癌细胞系A549、人鼻咽癌细胞系CNE、人皮肤T细胞淋巴瘤Hut 102、人结肠癌细胞LoVo、人正常肝细胞LO2五种。所用培养基均采用含10% 小牛血清、1% 双抗的RPMI-1640培养基，所有细胞系均在37℃、5%CO2的恒温环境条件下传代培养。\n[0062] 2) 铺板， 取处于对数生长期的细胞，待细胞长满瓶底70%左右时，经0.25%胰蛋白酶液消化，吹打分散成单细胞悬液，以每孔100µL的量接种于96孔细胞培养板中，调节细\n4\n胞数约至5×10 个/孔。放入37℃，5% CO2培养箱中24h。\n[0063] 3) 样品溶液制备 取粗多糖、纯化的多糖冻干样加RPMI 1640培养基溶解，调整糖液pH7.0，配制成终浓度为2mg/ml的多糖溶液，经0.22µm滤膜过滤除菌，待用。\n[0064] 4) 加样 将步骤1中铺板所制备的细胞培养板的营养液吸弃，分别加入糖浓度为\n2000、1000、500、250、125µg/ml的培养基100µl，每个浓度平行设3个复孔，并设置3个空白对照孔，空白对照孔加入不含糖液的培养液100ml。于37℃ ，5% CO2条件下培养48h。\n[0065] 5) 染色 轻轻吹打96孔细胞培养板各孔2-3次，弃去上清。每孔加入30µl染色液，室温放置3-5分钟。\n[0066] 6) 脱色 流水小心冲去染色液，吸取残留水分。每孔加入100µl脱色液，室温放置\n3-5分钟。\n[0067] 7) 比色 测定波长570nm，记录测定结果。按以下公式计算细胞生长抑制百分率。\n[0068] 抑制百分率＝（1-给药组平均OD值/空白对照平均OD值）×100%\n[0069] 1）虎皮兰多糖组分TPS、TPS-H、TPS-A对人肺癌细胞A549、人鼻咽癌细胞系CNE、人皮肤T细胞淋巴瘤Hut 102均有一定的抑制作用。抑制效果见图10、11、12。\n[0070] 2）其中以纯化后多糖组分TPS-A对人肺癌细胞A549和人皮肤T细胞淋巴瘤Hut \n102的抑制效果最好，当浓度达到2mg/ml时，TPS-A对A549的抑制率达到64.4%，对Hut 102的抑制率达到68.3%，且在浓度在0.5～2mg/ml之间时三种多糖组分与空白对照组相比作用均为显著（P＜0.05)。\n[0071] 3）三种多糖组分TPS、TPS-H、TPS-A对人正常肝细胞LO2无杀伤作用；对人结肠癌细胞LoVo细胞无抑制效果。\n[0072] 4）从细胞形态上观察，随着虎皮兰多糖浓度的增加，细胞的形态发生明显变化（图\n13、14、15、16），细胞间隙加大，形态变的不规则、失去原有特性，有逐渐裂解、凋亡的趋势。