一种含腐植酸的生物蛋白饲料及制备方法

1.一种生物蛋白饲料，为在含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基中接种菌种，发酵，得到生物蛋白饲料；
所述菌种为枯草芽孢杆菌和酿酒酵母两种菌种；
所述含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基由主料、辅料和水组成；所述主料由啤酒糟、麸皮和豆粕组成；所述辅料由腐植酸钠、糖蜜、尿素、(NH4)2SO4、K2HPO4和MgSO4组成；
所述啤酒糟占所述主料的质量百分比为70-80%；
所述麸皮占所述主料的质量百分比为15-20%；
所述豆粕占所述主料的质量百分比为5-10%；
所述腐植酸钠占所述主料的质量百分比为4-6%；
所述糖蜜占所述主料的质量百分比为0.2-0.4%；
所述尿素占所述主料的质量百分比为1.3%-1.8%；
所述(NH4)2SO4占所述主料质量百分比为1.0%-1.4%；
所述K2HPO4占所述主料的质量百分比为0.9%-1.2%；
所述MgSO4占所述主料的质量百分比为0%-0.03%；
所述主料和所述辅料组成的原料与所述水的质量比为1:（1-1.5）。
2.根据权利要求1所述的生物蛋白饲料，其特征在于：
8 9
所述生物蛋白饲料中总菌数为10-10cfu/g；所述生物蛋白饲料中腐植酸含量为
3%-4%；所述生物蛋白饲料中粗蛋白含量为40%-45%。
3.一种制备权利要求1或2所述生物蛋白饲料的方法，包括如下步骤：在权利要求1或
2所述的生物蛋白饲料中的所述含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基中接种菌种，发酵，即得到生物蛋白饲料；
所述菌种为枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述接种为按照所述含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基质量百分含量的8-10%接种混合菌液；
所述混合菌液为将枯草芽孢杆菌的菌悬液和酿酒酵母菌的菌悬液按照体积比为8:2混合得到；
8
所述枯草芽孢杆菌的菌悬液和所述酿酒酵母菌的菌悬液的浓度均为（1-9）×10cfu/ml；
所述发酵的温度为30-34℃；所述发酵的时间为60-70h。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：
在所述发酵后还包括如下步骤：将所述发酵得到的产物依次经干燥、粉碎，得到生物蛋白饲料；
在所述发酵前还包括分别制备所述枯草芽孢杆菌的菌悬液和所述酿酒酵母的菌悬液的步骤：
所述枯草芽孢杆菌的菌悬液按照如下方法制备：培养枯草芽孢杆菌，得到枯草芽孢杆菌的菌悬液；
所述酿酒酵母的菌悬液按照如下方法制备：培养酿酒酵母，得到酿酒酵母的菌悬液。
6.一种啤酒糟固态培养基，为权利要求1或2所述生物蛋白饲料中的所述含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基。

一种含腐植酸的生物蛋白饲料及制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种含腐植酸的生物蛋白饲料及制备方法。\n背景技术\n[0002] 啤酒糟（Brewer’s spent grain，BSG）俗称麦糟，是麦芽和大米、淀粉等辅料经过糊化、糖化、过滤糖化醪后，分离的不溶性残渣物。鲜啤酒糟一般含水量为69%，粗蛋白为\n6.2%，粗脂肪为11%，粗纤维为3.4%，无氮浸出物为10.4%。我国是一个啤酒生产大国，但因其含水量高，易霉烂，不便贮存，利用率低，易造成环境污染，啤酒糟的利用已成为亟待解决的问题。为了更好地利用啤酒糟，以啤酒糟为发酵原料，采用混菌发酵技术，利用微生物体内的各种酶系协同作用，将啤酒糟中禽畜不易消化吸收的复杂的大分子化合物成分纤维素可转化成单糖，且促进菌体大量增殖，从而增加啤酒糟的蛋白含量，降低其抗营养因子，合成营养价值高、适口性好的生物蛋白饲料。可将啤酒废糟变废为宝，减少环境污染，缓解生物蛋白饲料短缺、人畜争粮等问题。\n[0003] 腐植酸是一类从泥炭、褐煤或风化煤中提取的高分子化合物，根据其溶解度、颜色及分子量大小,可分将其分为黑腐酸、棕腐酸和黄腐酸。腐植酸不仅对农作物具有广泛的促进作用，对畜禽生长和免疫也具有促进和增强作用，同时对酿酒酵母和霉菌等有益微生物具有刺激生长、促进繁殖和加速新陈代谢的作用。腐植酸促进微生物生长可能的原因有以下几个方面：(1)在腐植酸特殊的大分子结构作用下，菌种体可能产生内源性生长调节物质；(2)腐植酸可能吸附培养基中抑制菌种生长的代谢物，且对pH值有一定的缓冲作用，从而改善了菌种生长的环境；(3)腐植酸可能促进菌胞外蛋白酶的合成，从而增强了菌体对营养物质的分解与吸收。\n[0004] 生物蛋白饲料即菌体生物蛋白饲料，是指在适宜条件下，因微生物大量生长，而由其菌体提供的蛋白质饲料，也称之为单细胞生物蛋白饲料。这类饲料中不仅含有丰富的蛋白质，还含有脂肪、核酸、碳水化合物、维生素和无机盐，有较好的香味和性能，是一种具有较高营养价值的饲料。生物蛋白饲料\n发明内容\n[0005] 本发明的一个目的是提供一种生物蛋白饲料。\n[0006] 本发明提供的生物蛋白饲料，为在含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基中接种菌种，发酵，得到生物蛋白饲料。\n[0007] 在上述生物蛋白饲料中，所述菌种为枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中的一种或者两种；\n[0008] 所述菌种具体为枯草芽孢杆菌和酿酒酵母两种菌种。\n[0009] 在上述生物蛋白饲料中，所述含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基由主料、辅料和水组成；所述主料由啤酒糟、麸皮和豆粕组成；所述辅料由腐植酸钠、糖蜜、尿素、(NH4)2SO4、K2HPO4和MgSO4组成。\n[0010] 在上述生物蛋白饲料中，所述啤酒糟占所述主料的质量百分比为70-80%；\n[0011] 所述麸皮占所述主料的质量百分比为15-20%；\n[0012] 所述豆粕占所述主料的质量百分比为5-10%。\n[0013] 所述腐植酸钠占所述主料的质量百分比为4-6%；\n[0014] 所述糖蜜占所述主料的质量百分比为0.2-0.4%；\n[0015] 所述尿素占所述主料的质量百分比为1.3%-1.8%；\n[0016] 所述(NH4)2SO4占所述主料质量百分比为1.0%-1.4%；\n[0017] 所述K2HPO4占所述主料的质量百分比为0.9%-1.2%；\n[0018] 所述MgSO4占所述主料的质量百分比为0%-0.03%；\n[0019] 所述主料和所述辅料组成的原料与所述水的质量比为1:（1-1.5）。\n[0020] 在本发明的实施例中的含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基组分如下：啤酒糟、麸皮和豆粕以75%、20%和5%的质量百分比混合作为主料，按主料总质量的百分比进行辅料添加，其添加量分别为腐植酸钠6%、糖蜜0.3%、尿素1.5%、(NH4)2SO4 1.0%、K2HPO41.1%和MgSO40.03%，得到原料；再将原料和水按照质量比为1:1混合。\n[0021] 在上述生物蛋白饲料中，所述生物蛋白饲料中总菌数为108cfu/g以上，具体为\n8 9\n10-10cfu/g；所述生物蛋白饲料中腐植酸含量为3%以上，具体为3%-4%；所述生物蛋白饲料中粗蛋白含量为43%以上，具体为40%-45%。\n[0022] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述生物蛋白饲料的方法。\n[0023] 本发明提供的方法，包括如下步骤：在上述含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基中接种菌种，发酵，即得到生物蛋白饲料。\n[0024] 在上述方法中，所述菌种为枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中的一种或者两种；所述菌种具体为枯草芽孢杆菌和酿酒酵母两种菌种。\n[0025] 在上述方法中，所述接种为按照所述含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基质量百分含量的8-10%接种混合菌液；\n[0026] 所述混合菌液为将枯草芽孢杆菌的菌悬液和酿酒酵母菌的菌悬液按照体积比为\n8:2混合得到；\n[0027] 所述枯草芽孢杆菌的菌悬液和所述酿酒酵母菌的菌悬液的浓度均为\n8\n（1-9）×10cfu/ml。\n[0028] 上述方法中，所述发酵的温度为30-34℃；所述发酵的时间为60-70h。\n[0029] 在上述方法中，在所述发酵后还包括如下步骤：将所述发酵得到的产物依次经干燥、粉碎，得到生物蛋白饲料；\n[0030] 上述干燥为将所述发酵得到的产物干燥至含水量小于10%，得到干燥产物；上述粉碎为将干燥产物粉碎至40-60目。\n[0031] 在所述发酵前还包括分别制备所述枯草芽孢杆菌的菌悬液和所述酿酒酵母的菌悬液的步骤：\n[0032] 所述枯草芽孢杆菌的菌悬液按照如下方法制备：培养枯草芽孢杆菌，得到枯草芽孢杆菌的菌悬液；\n[0033] 所述酿酒酵母的菌悬液按照如下方法制备：培养酿酒酵母，得到酿酒酵母的菌悬液。\n[0034] 所述枯草芽孢杆菌的菌悬液制备方法中，所述培养为将枯草芽孢杆菌依次进行斜面培养、一级培养、二级培养和三级培养，得到枯草芽孢杆菌的菌悬液；\n[0035] 所述酿酒酵母的菌悬液制备方法中，所述培养为将酿酒酵母依次进行斜面培养、一级培养、二级培养和三级培养，得到酿酒酵母的菌悬液。\n[0036] 上述各菌株斜面培养的温度均为30-35℃，时间均为2d；\n[0037] 上述各菌株一级培养的温度为30-35℃，时间均为24h；\n[0038] 上述各菌株二级培养的温度为30-35℃，时间均为24-30h；\n[0039] 上述各菌株三级培养的温度为30-35℃，时间均为24-30h。\n[0040] 上述枯草芽孢杆菌的斜面培养基组成为牛肉膏(3g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)和琼脂(2g/L)；上述酿酒酵母的斜面培养基为麦芽汁琼脂培养基。\n[0041] 上述枯草芽孢杆菌的一级种子液培养基组成为牛肉膏(3g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)；上述酿酒酵母的一级种子液培养基采用麦芽汁培养基。\n[0042] 上述枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的二级种子液培养基均为如下：豆粕5%，蛋白胨\n1%，牛肉膏3%，葡萄糖5%，MgCl2 0.02%、K2HPO40.01%。\n[0043] 上述枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的三级种子液培养基均为如下：豆粕5%，葡萄糖\n2%，MgCl20.02%、K2HPO40.01%。\n[0044] 在本发明的实施例中，发酵为将三级枯草芽孢杆菌种子液（菌悬液）和三级酿酒酵母种子液（菌悬液）按照体积比为8:2混合，得到混合菌液，以10%(质量百分含量)接种于含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基中，于34℃发酵培养62h，得到发酵产物。\n[0045] 上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC1.0892购自中国微生物菌种保藏中心；上述酿酒酵母为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC2.119购自中国微生物菌种保藏中心。\n[0046] 本发明的第三个目的是提供一种啤酒糟固态培养基。\n[0047] 本发明提供的啤酒糟固态培养基，为上述含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基。\n[0048] 本发明的实验证明，本发明利用微生物固态发酵技术，在发酵培养基啤酒糟中添加腐植酸钠以促进菌体生长，提高产物蛋白含量及营养价值，制备出含有腐植酸的生物蛋白饲料，以该产品饲喂动物，可提高动物的生产性能，同时可增强机体免疫力；另外，本发明还能变废为宝、减少环境污染、缓解生物蛋白饲料短缺和粮食争端等问题。\n具体实施方式\n[0049] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。\n[0050] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。\n[0051] 下述实施例啤酒糟、麸皮、豆粕、腐植酸钠、糖蜜、尿素均购自于市场。\n[0052] 下述实施例中的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC1.0892购自中国微生物菌种保藏中心；\n[0053] 下述实施例中的酿酒酵母为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC2.119购自中国微生物菌种保藏中心。\n[0054] 下述实施例中所用的培养基如下：\n[0055] 斜面培养基：枯草芽孢杆菌的培养基组成为牛肉膏(3g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)和琼脂(2g/L)；酿酒酵母采用麦芽汁琼脂培养基。\n[0056] 一级种子液培养基：枯草芽孢杆菌的培养基组成为牛肉膏(3g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)；酿酒酵母采用麦芽汁培养基。\n[0057] 二级种子液培养基：豆粕5%，蛋白胨1%，牛肉膏3%，葡萄糖5%，MgCl20.02%、K2HPO40.01%。\n[0058] 三级种子液培养基：豆粕5%，葡萄糖2%，MgCl20.02%、K2HPO40.01%。\n[0059] 实施例1、生物蛋白饲料的制备\n[0060] 1、斜面培养\n[0061] 将枯草芽孢杆菌和酿酒酵母分别在各自的斜面培养基上35℃培养2d。\n[0062] 2、一级培养\n[0063] 将斜面培养后的各菌接在250ml三角瓶中进行培养，每瓶装有50ml一级种子液培养基；取斜面活化菌种1环接入培养基中，温度为35℃，220rpm旋转摇床培养24h，活菌数\n8\n达10cfu/ml，得到一级枯草芽孢杆菌种子液和一级酿酒酵母种子液。\n[0064] 3、二级培养\n[0065] 分别将一级枯草芽孢杆菌种子液和一级酿酒酵母种子液接种在1000ml三角瓶中进行培养，每瓶200ml二级种子液培养基，按3%接种量，温度为35℃，220rpm旋转摇床培养\n8\n24h，活菌数达10cfu/ml，得到二级枯草芽孢杆菌种子液和二级酿酒酵母种子液。\n[0066] 4、三级培养\n[0067] 将二级枯草芽孢杆菌种子液和二级酿酒酵母种子液分别接种到10L发酵罐中进行培养，5L发酵罐中装三级种子液培养基3L，温度为30℃，300rpm，培养时间30h，活菌数达\n8\n10cfu/ml，得到三级枯草芽孢杆菌种子液和三级酿酒酵母种子液。\n[0068] 5、固态发酵制得生物蛋白饲料\n[0069] 含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基：啤酒糟、麸皮和豆粕以75%、20%和5%的质量百分比混合作为主料，按主料的总质量进行辅料添加，其添加量分别为腐植酸钠6%、糖蜜\n0.3%、尿素1.5%、(NH4)2SO4 1.0%、K2HPO41.1%和MgSO40.03%，得到原料；再将原料和水按照质量比为1:1混合。自然pH值。\n[0070] 将三级枯草芽孢杆菌种子液（菌悬液）和三级酿酒酵母种子液（菌悬液）按照体积比为8:2混合，得到混合菌液，以10%(质量百分含量)接种于含有腐植酸钠的啤酒糟固态培养基中，于34℃发酵培养62h，得到发酵产物。发酵结束后，将发酵产物干燥至含水量9%，粉碎至60目；得到生物蛋白饲料。\n[0071] 实施例2、生物蛋白饲料的检测\n[0072] 1、生物蛋白饲料的营养成分分析\n[0073] 活菌数测定:采用平皿稀释涂布计数法。\n[0074] 粗蛋白含量测定：采用GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白测定方法。\n[0075] 粗纤维含量测定：采用GB/T 6434-1994饲料中粗纤维测定方法。\n[0076] 磷含量测定：采用GB/T 6437—92饲料中总磷量的测定方法－光度法。\n[0077] 酸性蛋白酶活测定：采用Folin酚法。\n[0078] 腐植酸含量测定：用氢氧化钠溶液从发酵产物中提取总腐植酸，抽提出的腐植酸中的碳用重铬酸钾氧化，过剩的重铬酸钾用硫酸亚铁铵标准溶液滴定（可参照：腐植酸的提取及其成分含量测定，黄金凤、赵义龙、赵金香、矫继峰、李太元；四川畜牧兽医；2007年第5期)。\n[0079] 结果如下表1：\n[0080] 表1 为生物蛋白饲料营养成分分析\n[0081] \n[0082] 因此由实施例1得到的生物蛋白饲料为含腐植酸的生物蛋白饲料。\n[0083] 2、动物生产性试验\n[0084] 1）动物生产性试验效果一\n[0085] 选择3月龄健康无病的寒杂羔羊120只，体质量接近，随机分为4组，每组30只羊。包括1个对照组和3个试验组，即对照组、实验组Ⅰ、实验组Ⅱ和实验组Ⅲ，每组15头，对照组饲喂精饲料（精饲料组成为玉米48.2％，豆粕14%，棉粕10%，葵饼6%，胡麻饼10%，食盐1.2%，营养添加剂1%，DDGS8%，小苏打1.6%）；3个试验组分别以5%，10%，15%由实施例1得到的含腐植酸的生物蛋白饲料（生物蛋白饲料）替代精饲料。4组均饲喂粗饲料，主要是野干草、玉米青贮等。试验预饲期7d，正式期60d。试验结果见表2。\n[0086] 表2 为含腐植酸的生物蛋白饲料对羔羊生长性能的影响\n[0087] \n[0088] 由表2可见，含腐植酸的生物蛋白饲料对肉羊日增重从高到低的顺序为实验组Ⅱ＞实验组Ⅲ＞实验组Ⅰ＞对照组，实验组Ⅱ比对照组提高了9.46%；料重比的顺序为对照组＞实验组Ⅰ＞实验组Ⅱ＞实验组Ⅲ。因此，综合日增重和料重比，含腐植酸的生物蛋白饲料以10%替代精饲料饲喂羔羊效果较好。\n[0089] 2）动物生产性试验效果二\n[0090] 选择60头泌乳中期的健康荷斯坦奶牛，按照年龄、日产奶量、泌乳天数、胎次相近的原则进行分组配对，随机分为4组，包括1个对照组和3个试验组，每组15头；对照组采用精饲料（玉米51.1％，麸皮10%，豆粕17.1%，棉粕15.8%，预混料1%，食盐1%，石粉1.5%，磷酸氢钙1%，氧化镁0.4%，小苏打1.1%）；3个试验组分别以5%，10%，15%由实施例1得到的