一种非诊断目的的HIV抗体免疫检测方法及试剂盒

1.一种非诊断目的的HIV抗体免疫检测方法，其特征在于包括：
使HIV抗原特异性地捕获检测样本中的HIV抗体，然后加入生物素标记二抗，孵育形成抗原-抗体-生物素标记二抗复合物；
在链霉亲和素存在的条件下，加入生物素化引物Biotin-I，孵育使所述复合物与Biotin-I结合，然后加入生物素化的发卡链Biotin-H1和发夹链H2进行杂交反应；
加入亲和素标记的辣根过氧化物酶，催化底物液显色，通过测定吸光度进行HIV抗体的定量检测；
所述Biotin-I碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3’；
所述Biotin-H1碱基序列为5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3’；
所述H2的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3’;
所述生物素标记二抗为生物素化的羊抗人IgG或生物素化的鼠抗人IgG;
将HIV抗原包被于酶标板上，用封闭液处理后，将含有HIV抗体的检测样本加入微孔板，
36 38℃温育，使HIV抗原特异性地捕获HIV抗体；加入生物素标记二抗在36 38℃温育，在微~ ~
孔板上形成抗原-抗体-生物素标记二抗复合物；
所述Biotin-H1和H2先经下述预处理：经95 98℃水浴1 3min后，立即冰浴；
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免疫反应之后，向微孔板中加入链霉亲和素在36 38℃温育，甩去孔中液体后拍干，加~
入Biotin-I在36 38℃温育，使所述复合物与Biotin-I结合；
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加入Biotin-H1和H2，室温下反应1 3h，使Biotin-H1和H2打开发夹结构、交替杂交，形~
成有缺口的双链DNA聚合物；
加入亲和素标记的辣根过氧化物酶在36 38℃温育后倒出液体，加入底物缓冲液及底~
物液在36 38℃温育，再加入终止液，混匀后比色。
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2.一种HIV抗体免疫检测试剂盒，其特征在于包括：
HIV抗原、生物素标记二抗、链霉亲和素、生物素化引物Biotin-I、生物素化的发卡链Biotin-H1、发夹链H2和亲和素标记的辣根过氧化物酶、包被液、封闭液、洗液、底物液、底物缓冲液和终止液；
所述Biotin-I碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3’；
所述Biotin-H1碱基序列为5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3’；
所述H2的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3’；
所述HIV抗原浓度为80 120 ng/mL；
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所述生物素标记二抗浓度为1.0 2.0 μg/mL；
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所述链霉亲和素浓度为0.8 1.2 μg/mL；
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所述Biotin-I浓度为4 6 nM，配置时加入SPSC缓冲液；
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所述Biotin-H1和H2浓度均为80 120 nM，配置时加入SPSC缓冲液；
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所述亲和素标记的辣根过氧化物酶浓度为18 22 μg/mL；
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所述包被液为含80 120 ng/mL HIV抗原的8 12 mM PBS缓冲液；封闭液为含鲑鱼精DNA ~ ~
40 60 μg/mL的0.8 1.2%BSA溶液。
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一种非诊断目的的HIV抗体免疫检测方法及试剂盒\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物医学工程领域，尤其涉及一种非诊断目的的检测HIV抗体的方法及试剂盒。\n背景技术\n[0002] 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)是引起获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)的病原体。HIV抗体是HIV病毒进入人体后由人体免疫应答反应所产生，这种抗体对HIV病毒基本无效，但可一定程度上反应HIV的感染状态，是人体一项生理指标。\n[0003] 检测血液中的HIV抗体是目前最常用的检测艾滋病病毒感染的实验室方法，一般要经过两个步骤：首先做初筛试验，如果为阳性，再做确认试验，确认试验阳性才可诊断为艾滋病病毒感染。\n[0004] 目前，用于HIV抗体筛查试验的检测方法主要有酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA)、化学发光免疫分析技术(chemiluminescence immunoassay，CLIA)、明胶颗粒凝集试验(gelatin particles agglutinate experiment，GPAT)、斑点免疫胶体金快速试验等。GPAT和斑点免疫胶体金快速试验等方法通过肉眼判断结果较为主观，且价格昂贵、结果不易保存。CLIA缺点在于标记催化酶或化学发光分子的发光反应不稳定，为间断的、闪烁性发光，而且在反应过程中易发生裂变，导致反应结果不稳定。此外，检测时需对结合相、游离相进行分离，操作步骤多，测试成本高。ELISA仍是临床上最常用的检测HIV抗体的方法，它具有灵敏、特异、快速等优点，然而ELISA的检测下限仍具有局限性，不能满足感染早期低浓度的HIV抗体水平的检测。\n[0005] 杂交链反应(hybridization chain reaction，HCR)是一种新型高效的核酸扩增方法，HCR可以在无酶的条件下实现DNA的扩增。中国发明专利申请CN103940989A公开了一种基于HCR和单分子计数的免疫荧光技术检测TNF-α。已有HIV抗体筛查方法仍存在诸多问题，需要建立检测灵敏高、便捷的检测方法。\n发明内容\n[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种HIV抗体免疫检测方法及试剂盒，以降低HIV抗体的检测下限浓度，提高检测灵敏度。\n[0007] 为了解决上述技术问题，本发明通过HCR体系引入ELISA进行信号放大来实现HIV抗体的检测。该方法利用间接法ELISA捕获血清中的HIV抗体，通过生物素-亲和素系统引入HCR体系，HCR体系在常温下进行扩增，形成DNA双链聚合物。该聚合物标记了生物素，可以和亲和素标记的辣根过氧化物酶结合，从而进行显色检测。\n[0008] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种非诊断目的的HIV抗体免疫检测方法，包括：\n[0009] 使HIV抗原特异性地捕获检测样本中的HIV抗体，然后加入生物素标记二抗，孵育形成抗原-抗体-生物素标记二抗复合物；\n[0010] 在链霉亲和素存在的条件下，加入生物素化引物Biotin-I，孵育使所述复合物与Biotin-I结合，然后加入生物素化的发卡链Biotin-H1和发夹链H2进行杂交反应；\n[0011] 加入亲和素标记的辣根过氧化物酶，催化底物液显色，通过测定吸光度进行HIV抗体的定量检测；\n[0012] 所述Biotin-I碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3’；\n[0013] 所述Biotin-H1碱基序列为5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3’；\n[0014] 所述H2的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3’。\n[0015] 在一个具体实施方式中，将HIV抗原包被于酶标板上，用封闭液处理后，将含有HIV抗体的检测样本加入微孔板，36～38℃温育，使HIV抗原特异性地捕获HIV抗体；加入生物素化羊抗人IgG在36～38℃温育，在微孔板上形成抗原-抗体-生物素标记二抗复合物。\n[0016] 所述生物素标记二抗可以为生物素化的羊抗人IgG或生物素化的鼠抗人IgG。\n[0017] 在一个具体实施方式中，Biotin-H1和H2先经下述预处理：经95～98℃水浴1～\n3min后，立即冰浴。\n[0018] 在一个具体实施方式中，免疫反应之后，向微孔板中加入链霉亲和素在36～38℃温育，甩去孔中液体后拍干，加入Biotin-I在36～38℃温育，使所述复合物与Biotin-I结合。\n[0019] 在一个具体实施方式中，加入Biotin-H1和H2，室温下反应1～3h，使Biotin-H1和H2打开发夹结构、交替杂交，形成有缺口的双链DNA聚合物。\n[0020] 在一个具体实施方式中，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶在36～38℃温育后倒出液体，加入底物缓冲液及底物液在36～38℃温育，再加入终止液，混匀后比色。\n[0021] 本发明还提供一种HIV抗体免疫检测试剂盒，包括：\n[0022] HIV抗原、生物素标记二抗、链霉亲和素、生物素化引物Biotin-I、生物素化的发卡链Biotin-H1、发夹链H2和亲和素标记的辣根过氧化物酶；\n[0023] 所述Biotin-I碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3’；\n[0024] 所述Biotin-H1碱基序列为5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3’；\n[0025] 所述H2的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3’。\n[0026] 在一个具体实施方式中，所述HIV抗原浓度为80～120ng/mL；\n[0027] 所述生物素标记二抗浓度为1.0～2.0μg/mL；\n[0028] 所述链霉亲和素浓度为0.8～1.2μg/mL；\n[0029] 所述Biotin-I浓度为4～6nM，配置时加入SPSC缓冲液；\n[0030] 所述Biotin-H1和H2浓度均为80～120nM，配置时加入SPSC缓冲液；\n[0031] 所述亲和素标记的辣根过氧化物酶浓度为18～22μg/mL。\n[0032] 在一个具体实施方式中，还包括包被液、封闭液、洗液、底物液、底物缓冲液和终止液；包被液为含80～120ng/mL HIV抗原的8～12mM PBS缓冲液；封闭液为含鲑鱼精DNA 40～\n60μg/mL的0.8～1.2％BSA溶液。\n[0033] 本发明相比现有技术具有如下优点：\n[0034] (1)HCR是利用一组互补的、动力学受限的发夹探针来实现杂交的链反应，它是在等温、无酶的条件下进行的，稳定而廉价。本发明将HCR引入了ELISA，本发明中抗体与酶是一对多的关系，在利用抗原抗体反应保证检测特异性的同时，利用HCR进行信号放大，实现了HIV抗体的超灵敏检测，检测下限低至9.5pg/mL，比传统ELISA约提高2个数量级。\n[0035] (2)本方法操作简便，无需特殊仪器，且具有易于自动化、稳定性强、毒性低等特点。\n附图说明\n[0036] 图1是本发明HCR-ELISA检测HIV抗体的原理示意图；\n[0037] 图2是传统ELISA和HCR-ELISA定量检测不同浓度HIV抗体的结果对比；\n[0038] 图3是40例临床标本检测结果。\n具体实施方式\n[0039] 本发明所述“室温”具有本领域公知的含义，具体是指20-30℃，优选20-25℃。\n[0040] 图1是本发明HCR-ELISA检测HIV抗体的原理示意图。HIV抗原包被于微孔板上，特异性地捕获血清中的HIV抗体。加入生物素化的羊抗人IgG(免疫球蛋白G)后，在微孔板上形成了抗原-抗体-生物素羊抗人IgG复合物。在链霉亲和素存在的条件下，通过生物素-亲和素之间的作用，这些复合物可进一步与生物素标记的引发链I(Biotin-I)结合。加入发夹H1和H2，引发链可催化H1和H2打开发夹结构，H1和H2交替杂交，形成有缺口的双链DNA聚合物，加入SA-HRP，该酶催化底物液显色，使信号得以放大显色。因此利用简易的紫外分光光度计即可对血清中的抗体进行定量检测。\n[0041] 在一个具体的实施方式中，本发明的一种基于杂交链反应的HIV抗体免疫检测方法，包括以下步骤：\n[0042] (1)间接法ELISA捕获检测样本中的HIV抗体：将HIV抗原包被于微孔板上，冷藏过夜。加入封闭液室温放置2～4h后弃去封闭液，拍干冷藏备用。将检测样本加入微孔板，36～\n38℃温育0.5～1h，HIV抗原可特异性地捕获血清中的HIV抗体。加入生物素化羊抗人IgG 36～38℃温育0.5～1h后，在微孔板上形成抗原-抗体-生物素鼠抗人IgG复合物。每步反应之后均用PBST洗液洗板，以除去未结合的试剂；\n[0043] (2)基于HCR信号放大的免疫检测技术：免疫反应之后，向微孔板中加入的链霉亲和素，36～38℃温育20～40min。甩去孔中液体后拍干，加入Biotin-I，36～38℃温育20～\n40min后洗板，加入Biotin-H1和H2，混匀，室温下放置使其反应1～3h。洗板除去未结合的发夹链；\n[0044] (3)显色及信号检测：加入亲和素标记的辣根过氧化物酶，36～38℃温育20～\n40min，洗板后充分拍干，加入底物缓冲液及底物液，36～38℃温育20～40分钟。加入终止液，混匀后比色。\n[0045] 其中，HIV抗原浓度为80～120ng/mL；生物素标记二抗浓度为1.0～2.0μg/mL；链霉亲和素(SA)浓度为0.8～1.2μg/mL；Biotin-I浓度为4～6nM，配置时加入SPSC缓冲液；\nBiotin-H1和H2浓度为80～120nM，配置时加入SPSC缓冲液；亲和素标记的辣根过氧化物酶(SA-HRP)的浓度为18～22μg/mL。\n[0046] 所述生物素化引物(Biotin-I)的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3’，如SEQ ID NO.1所示；\n[0047] 所述生物素化的发卡链H1(Biotin-H1)的碱基序列为5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3’如SEQ ID NO.2所示；\n[0048] 所述发夹链H2的碱基序列为5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3’如SEQ ID NO.3所示。\n[0049] 步骤(2)中Biotin-H1和H2需如下预处理：经95～98℃沸水浴1～3min后，立即冰浴，冷藏保存备用。煮沸可使发夹结构打开成为单链DNA。\n[0050] 下面结合附图和一个具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。\n[0051] 实施例1\n[0052] 实施例中用到的各种溶液配方如下：\n[0053] 磷酸钠-氯化钠缓冲溶液(sodium phosphate-sodium chloride  buffer solution，SPSC)(50mM Na2HPO4/1.0M NaCl)：17.9g的Na2HPO4·12H2O，58.5g的NaCl加少许超纯水溶解，用盐酸调pH至7.5，定容至100mL。\n[0054] 10mM磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)(pH＝7.4)：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4·12H2O、0.24g KH2PO4溶解到1L超纯水中，用盐酸调节pH＝7.4，高压灭菌后4℃保存备用。\n[0055] Biotin-I的配制：将按已知序列合成的3.3nmol Biotin-I用33μl超纯水溶解至\n100μM，并用SPSC缓冲液稀释至5nM。分装，-20℃冷冻保存备用，使用前避免反复冻融。\n[0056] Biotin-H1和H2的配制：将按已知序列合成的2.1nmol H1用21μl超纯水溶解，\n2.2nmol H2用21μl超纯水溶解，用SPSC缓冲液稀释至100nM。-20℃冷冻保存备用，使用前避免反复冻融。\n[0057] 所用到的洗液、底物缓冲液、底物液和终止液，为ELISA的常用试剂。\n[0058] 本实施例的基于杂交链反应的HIV抗体免疫检测方法，具体步骤如下：\n[0059] (一)间接法ELISA捕获检测样本中的HIV抗体：\n[0060] (1)Biotin-H1和H2预处理：100nM的Biotin-H1和H2经98℃沸水浴2min后，立即冰浴，保存在4℃备用；\n[0061] (2)将100ng/mL的HIV抗原溶液(含有HIV抗原100ng/mL的10mM PBS溶液)注入96孔聚苯乙烯微孔板中，每孔200μL，4℃过夜；甩去包被液，每孔加入封闭液(含鲑鱼精DNA 50μg/mL的1％BSA溶液)200μL，室温放置2h后弃去封闭液，拍干4℃冷藏备用；\n[0062] (3)将100μL含有不同浓度的HIV抗体的样本加入微孔板，37℃水浴箱温育1h；\n[0063] (4)甩去孔中液体后，PBST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100μL 1.5μg/mL(1:4000)生物素化羊抗人IgG溶液，37℃水浴箱温育1h；\n[0064] (二)基于HCR信号放大的免疫检测技术：\n[0065] (5)甩去微孔中液体后，PBST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100μL 1μg/mL的SA，37℃水浴箱温育30min；\n[0066] (6)甩去孔中液体后拍干，加入100μL 5nM的Biotin-I，37℃温育30min；\n[0067] (7)甩去孔中液体后，常规洗液洗一遍，浸泡60s，拍干，加入40nM的Biotin-H1和H2各50μL，混匀，室温下放置使其反应1h；\n[0068] (三)显色及信号检测：\n[0069] (8)甩去孔中液体后，PBST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100μL 20μg/mL的SA-HRP，\n37℃温育30min后倒出液体；\n[0070] (9)将含2％的Tween 20的PBS洗液注满各孔，静置60s后弃去孔内洗液，重复5次后拍干即可；\n[0071] (10)加入底物缓冲液(含过氧化脲的柠檬酸-磷酸盐缓冲液)及底物液(含TMB的溶液)各50μL，轻轻振荡混匀，置37℃水浴箱温育30分钟。再加入终止液(2mol/L硫酸溶液)50μL，混匀后比色；\n[0072] (11)反应溶液450nm处的吸光度值(OD)使用RT 6100微孔板分光光度计进行测定。\n室温下利用UV-2450紫外可见吸收分光光度计测量溶液300-700nm波长范围内的吸收光谱。\n[0073] 对该实施例所建立方法进行检测性能考察，结果如下：\n[0074] 配制不同浓度的HIV抗体样本，使浓度分别为0、10-11、10-10、10-9、10-8g/mL，检测方法同实施例1，考察450nm处OD值与HIV抗体浓度之间的关系。结果表明，当HIV抗体浓度在\n10-11g/mL至10-8g/mL的范围时，HIV抗体浓度与450nm处吸光度的吸光度值呈拟线性关系(附图2)。若将空白对照的三倍标准差定义为检测下限，该方法检测HIV抗体的下限为9.5pg/mL。对HIV抗体浓度分别为10-11g/mL、10-10g/mL、10-9g/m和10-8g/mL的血清进行3次平行测定，450nm处吸光度值的相对标准偏差(RSD)分别为1.1％、5.3％、4.3％和4.7％。因此，HCR-ELISA法定量检测HIV抗体具有较高的灵敏度和可重复性。\n[0075] 采用本发明实施例1实验步骤对40例临床患者血清标本进行检测，同时与商品化的HIV抗体ELISA检测试剂盒(珠海丽珠试剂股份有限公司)进行对比，结果如附图3所示，两种方法检测结果基本一致，说明本发明检测HIV抗体具有较好的准确性。