生物活性蒙脱石粉的制备方法及其作为动物饲料添加剂的应用

1.一种生物活性蒙脱石粉的制备方法，所述方法如下：
(A)4℃保存的冻干菌种或-80℃保存的液体菌种进行活化：将枯草芽孢杆菌ACCC10619在事前准备好的LB固体培养皿上划线，然后放置于设定为37℃的生化培养箱中培养18小时；
(B)一级种子液的制备：从活化的培养皿上挑取典型均一的单菌落接种到事先准备好的LB液体无菌培养基里，然后置于恒温振荡培养器里，设定温度为37℃，转速为150rpm，培养18小时，获得一级种子液；
(C)二级种子液的制备：首先将制作种子液的发酵系统的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌，然后将事先配制的种子培养基导入发酵罐，用蒸气将培养基灭菌，待冷却至40℃时，将步骤
(B)制作的一级种子液按培养基体积的7％接入发酵罐，发酵条件为：温度37℃，转速为120rpm，通气量为培养基体积的0.3-0.5倍/min，罐内压力维持在0.03MPa，培养18小时；所述种子培养基为添加0.1毫升/升的消泡剂的LB培养基；
(D)生物活性蒙脱石粉的制备：
①将生产用发酵系统的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌；
②配制发酵培养基，培养基配方为：蛋白胨15克/升，酵母浸粉5克/升，玉米淀粉3克/升，KH2PO4·H2O 0.5克/升，MnSO4·H2O 0.02克/升，消泡剂0.1毫升/升；培养基的量为发酵罐容积的65％；
③将发酵培养基导入发酵罐，并按每升培养基1.4克的量加入细度为 300目，纯度为
98％的医药级蒙脱石粉，开动搅动电机，转速为260rpm，通蒸汽进行灭菌；
④将灭菌后的培养基冷却至40℃，按培养基量的0.5％接入二级种子液，发酵条件为：
通入精度为0.01μm高效空气除菌过滤器过滤的除菌空气，通入量为培养基体积的0.5倍/min，罐内压力维持在0.05MPa，搅动转速为260rpm，培养温度为37℃，培养时间为48小时；
⑤发酵完成后，罐压保持0.03MPa，将发酵液的温度快速降至10℃，再静止24小时，去上清液，取沉淀物离心，离心温度控制在4℃，离心转速为6000rpm，离心后的物料按重量比
1∶0.3的量加入白炭黑，用混合机搅拌均匀，35℃沸腾干燥至水份含量低于8％，干燥物用粉碎机粉碎至过80目筛后，制得所述的生物活性蒙脱石粉。

生物活性蒙脱石粉的制备方法及其作为动物饲料添加剂的\n应用\n技术领域\n[0001] 本发明生物活性蒙脱石粉涉及无机材料和微生物发酵领域，具体涉及生物活性蒙脱石粉作为动物饲料添加剂在饲料中的应用。\n背景技术\n[0002] 蒙脱石又名微晶高岭石，是一种层状结构、片状结晶的硅酸盐粘土矿，是膨润土的主要成分，属于蒙皂石(Smectite)族二八面体亚族，由二层共顶联接的硅氧四面体片夹一层共棱联接的铝(镁)氧(氢氧)八面体片构成2∶1型含结晶水结构，是粘土类矿物中晶体结构变异最强的矿物之一，通过衍射仪慢速扫描的试验结果表明为天然纳米材料。蒙脱石颗粒具层纹状结构及非均匀性电荷分布，对消化道内的病毒、细菌及其y产生的毒素有吸附固定作用，并且蒙脱石不进入血液循环，长期服用无毒，因而可作为药物和药物载体，特别是可以用于治疗腹泄及其他胃肠道疾病。已知蒙脱石作为兽药和饲料添加剂成分，用于畜禽腹泻及其它胃肠道疾病的预防和治疗(CN1326746A)；纳米蒙脱石加氯化、壳聚糖制得的饲料添加剂用于降低畜禽、水生动物的重金属残留(CN1371619A)，蒙脱石粉用于饲料添加剂，一般每吨饲料的添加量为2-5千克。\n[0003] 微生物饲料添加剂是根据微生态平衡理论，微生态失调理论、微生态营养理论和微生态防治理论选用对动物有特定有益功能的微生物菌株，将其发酵后，制成一种微生物制剂。食品安全问题是关系人民健康和国计民生的重在问题，安全饲料是动物性食品安全的基础。微生物饲料添加剂由于其不会造成抗生素、激素和农药残留，符合当前食品安全概念，是目前公认的安全饲料添加剂。\n[0004] 目前，国内外微生物饲料添加剂已有多种产品上市，如国外产品“Probios”、“Biomaax40”、“Primalac”、“EM”等，国内有“益生素”、“促生康”等。微生物饲料添加剂从菌种存活状态可分活菌、灭活菌制剂；从菌种构成可分单一菌剂和多菌复合菌剂；从剂型上分液体、粉剂、颗粒剂型，也有少量微囊化包埋制剂。一般每吨饲料的添加量为0.5-2千克。\n[0005] 王彦波(2006年)研究发现附载复合菌株的纳米级蒙脱石颗粒对养殖水体的pH值、氨氮、亚硝酸盐和COD等起到了很好的去除作用。温军辉(2009)对载菌蒙脱石的构建条件进行了研究并在罗非鱼的养殖上进行了试验应用。本发明的生物活性蒙脱石粉，不同于上述的载菌蒙脱石，主要差异为：1、制作工艺不同。2、使用领域不同。\n[0006] 现有文章所述的载菌蒙脱石的制备是益生菌发酵完成后再加入蒙脱石粉，使益生菌吸附到蒙脱石上。这种方法的主要缺点是蒙脱石的生物活性低和操作过程中易感染杂菌。载菌蒙脱石粉的主要应用领域为水产养殖过程中的水质改良，其应用到饲料添加中到目前仍未见报道。\n[0007] 以上所述的蒙脱石粉和微生物饲料添加剂在饲料中的应用，还存在着效果不够明确，产品质量不稳定、用量大，使用成本高等缺点。\n发明内容\n[0008] 本发明的目的在于提供一种新型饲料添加剂-生物活性蒙脱石粉，其主要作用是保护动物肠道，减少饲料中的抗原物质和有害菌对肠粘膜的破坏作用，防治动物腹泻，特别是仔猪断奶或贩运造成的仔猪腹泻。\n[0009] 本发明的另一目的是提供生物活性蒙脱石粉的制备方法。\n[0010] 本发明是将两种对动物肠道有修复和调节作用的物质，通过本发明的工艺加工而成一种新型的生物活性物质，可以克服原有物质在功效、成本等方面的不足，其功效也比原有两种物质简单混合的效果更加明显。\n[0011] 本发明制得的生物活性蒙脱石粉有使用效果明确，产品质量稳定，并且用量每吨饲料只需要5-50克，是单一蒙脱石产品用量的1-10％。\n[0012] 本发明的目的是通过下述方式实现的：\n[0013] 具体步骤为：\n[0014] 1.蒙脱石粉的预处理：将纯度80％以上的蒙脱石粉制成80目以上的粉体，优选纯度为95％以上，细度为200目以上的医药级蒙脱石粉做为功能材料。\n[0015] 2.选择菌种，优选农业部公告第1126号饲料添加剂品种目录中的允许使用的菌种，其中优选枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、粪肠球菌，包括但不限于上述菌种，如凝结芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌也可做为发酵时的选择菌种。\n[0016] 3.活化菌种，制作种子液。如菌种为芽孢杆菌，种子液培养基为LB培养基，配方为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠(NaCl)5g/L，水为自来水，pH值为7.0左右；如菌种为乳酸杆菌，种子液培养基为MRS培养基(配方为：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温80 1.0mL/L，乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g/L，磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g/L，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g/L，水为蒸馏水，pH6.2～6.6。\n[0017] 4.对空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌。\n[0018] 5.配制生产培养基：根据菌种的不同，配制不同的发酵培养基。如果是枯草芽孢杆菌，培养基配方为：蛋白胨6-15克/升，酵母浸粉2-7克/升，玉米淀粉1-3克/升(需先糊化)，磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)0.5-1克/升，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.001-0.02克/升，消泡剂0.05-0.5毫升/升；如果是地衣芽孢杆菌，培养基配方为：蛋白胨6-15克/升，酵母浸粉2-7克/升，玉米淀粉3-5克/升(需先糊化)，磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)0.5-1克/升，丙酸钠3-5克/升，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.001-0.02克/升，消泡剂0.05-0.5毫升/升；如果是乳杆菌(其中之一是植物乳酸菌或嗜酸乳杆菌或保加利亚乳杆菌)，培养基配方为：大豆蛋白胨8-15克/升，酵母浸粉5-10克/升，红糖8-15克/升，无水醋酸钠5-10克/升，一水柠檬酸1-2克/升，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.02克/升，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.005克/升，消泡剂0.05-0.5毫升/升；如果是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌混合发酵，培养基配方为：蛋白胨6-15克/升，酵母浸粉2-7克/升，玉米淀粉3-5克/升(需先糊化)，磷酸二氢钾0.5-1克/升，硫酸锰0.02克/升，消泡剂0.05-0.5毫升/升。上述培养基为发酵时的优选培养基，本发明仍可根据菌种和菌株的差异，优化培养基。发酵培养基的量为发酵罐容积的60-75％。\n[0019] 6.在生产培养基中按比例加入符合要求的蒙脱石粉，加入量为每升发酵培养基加\n0.5-10克，最优加入法为每升发酵培养基加入纯度为95％以上、细度为200目以上医药级蒙脱石粉1.4克，并调节培养基pH值为7.0左右。\n[0020] 7.用蒸汽进行灭菌，灭菌时开动电机对培养基搅动，转速为200-300rpm。灭菌后，降温至40℃左右，接种子液，接种量为发酵培养基量的0.1-10％。根据菌种特性，确定发酵条件。\n[0021] 如果进行好氧发酵，发酵条件为：\n[0022] (1)通入精度为0.01um高效空气除菌过滤器过滤的除菌空气，通入量为培养基体积的0.3-1倍/min，罐内压力维持在0.03-0.05MPa之间。\n[0023] (2)搅动转速为80-270rpm。\n[0024] (3)培养温度为30-37℃。\n[0025] (4)培养时间为18-58小时。\n[0026] 如果进行厌氧发酵，发酵条件为：\n[0027] (1)通入精度为0.01um高效空气除菌过滤器过滤除菌的二氧化碳，维持罐内压力在0.03-0.05MPa之间。\n[0028] (2)搅动转速为80-270rpm。\n[0029] (3)培养温度为30-37℃。\n[0030] (4)培养时间为18-64小时。\n[0031] 8.一般发酵完成后，将发酵液温度降至5-15℃，再静止8-48小时，去上清液，取沉淀物离心，离心温度控制在2-15℃，离心转速为4500-1200rpm，离心后的物料按1∶0.3：\n的量加入白炭黑，用混合机搅拌匀均，15-45℃真空干燥或沸腾干燥。干燥后水份含量要低于8％。干燥物用粉碎机粉至过80目筛后，制得本发明所述的生物活性蒙脱石粉，本发明所述的生物活性蒙脱石粉，不但含有益生菌，还含有益生菌发酵时的代谢产物。经测定，每克\n8\n生物活性蒙脱石粉所含益生菌的量大于或等于5×10CFU。\n[0032] 9.生物活性蒙脱石粉作为饲料添加剂在饲料中的应用方法\n[0033] 按每吨全价饲料添加5-50克的量，先用5-20％沸石粉、1-5％白炭黑和75-96％玉米淀粉组成的辅料稀释10-200倍后，再加入到生产预混料、浓缩料或全价饲料的物料中一起混合制成含生物活性蒙脱石粉的预混料、浓缩料或全价饲料，或者用辅料稀释后与全价饲料混合。直接饲喂或制粒后饲喂动物。\n具体实施方式：\n[0034] 实施例1：\n[0035] 发酵培养基中添加300目医药级蒙脱石粉发酵枯草芽孢杆菌，制成含枯草芽孢杆菌的生物活性蒙脱石粉。\n[0036] 具体步骤为：\n[0037] (1)4℃保存的冻干菌种或-80℃保存的液体菌种进行活化。将枯草芽孢杆菌ACCC10619在事前准备好的LB固体培养皿上划线，然后放置于设定为37℃的生化培养箱中培养18小时。\n[0038] (2)一级种子液的制备。从活化的培养皿上挑取典型均一的单菌落接种到事先准备好的LB液体无菌培养基里，然后置于恒温振荡培养器里，设定温度为37℃，转速为\n150rpm，培养18小时。获得一级种子液。\n[0039] (3)二级种子液的制备。首先将制作种子液的发酵系统的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌，然后将事先配制的种子培养基(LB培养基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡剂)导入发酵罐，用蒸气将培养基灭菌，待冷却至40℃时，将步骤2)制作的一级种子液按培养基体积的7％接入发酵罐。发酵条件为：温度37℃，转速为120rpm，通气量为培养基体积的0.3-0.5倍/min，罐内压力维持在0.03MPa左右，培养18小时。\n[0040] (4)生物活性蒙脱石粉的制备。\n[0041] ①将生产用发酵系统的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌。\n[0042] ②配制发酵培养基，培养基配方为：蛋白胨15克/升，酵母浸粉5克/升，玉米淀粉3克/升(需先糊化)，磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)0.5克/升，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.02克/升，消泡剂0.1毫升/升。培养基的量为发酵罐容积的65％。\n[0043] ③将发酵培养基导入发酵罐，并按每升培养基1.4克的量加入细度为300目，纯度为98％的医药级蒙脱石粉。开动搅动电机，转速为260rpm，通蒸汽进行灭菌。\n[0044] ④将灭菌后的培养基冷却至40℃，按培养基量的0.5％接入二级种子液，发酵条件为：通入精度为0.01um高效空气除菌过滤器过滤的除菌空气，通入量为培养基体积的\n0.5倍/min，罐内压力维持在0.05MPa，搅动转速为260rpm，培养温度为37℃，培养时间为\n48小时。\n[0045] ⑤发酵完成后，罐压保持0.03MPa，将发酵液的温度快速降至10℃，再静止24小时，去上清液，取沉淀物离心，离心温度控制在4℃，离心转速为6000rpm，离心后的物料按重量比1∶0.3的量加入白炭黑，用混合机搅拌匀均，35℃沸腾干燥，干燥后水份含量要低于8％。干燥物用粉碎机粉至过80目筛后，制得本发明所述的生物活性蒙脱石粉。经测定，\n8\n每克生物活性蒙脱石粉所含益生菌的量大于6×10CFU。\n[0046] 实施例2：\n[0047] 生物活性蒙脱石粉添加到饲料中防治断奶仔猪腹泻及促生长的应用\n[0048] 仔猪早期断奶引起的胃肠道应激消化不良及仔猪拉稀，是多年以来困扰养猪业的老问题。为了解决仔猪早期腹泻问题，国内外普遍采用在饲料中添加超大剂量氧化锌和抗生素的方法，从涩肠、杀菌或抑制肠道病原微生物的机理上，降低仔猪腹泻率。但副作用及药物残留问题已越来越引起人们的关注，蒙脱石和益生菌是新发展起来用以防治断奶仔猪拉痢的新方法，此两种方法未见毒副作用方面的报道，本试验就本发明实施例1所制的生物活性蒙脱石与普通的蒙脱石和益生菌在产品功效上做一比较。\n[0049] 1、材料与方法\n[0050] 1.1、试验动物分组与处理\n[0051] 饲养试验选取35天断奶，体重相近、发育良好的大长二元杂断奶仔猪128头(山东济宁某猪场提供)，预饲3天后，随机分为四个处理组，每组4个重复，每个重复8头仔猪(公母仔猪比例为1∶1)，各个重复统计检验差异不显著，平均体重8.50kg。处理一(对照组)饲喂基础日粮，处理二(益生菌组)、处理三(蒙脱石组)和处理组四(生物活性蒙脱\n8\n石组)分别在基础日粮中添加1000mg/kg的益生菌(有益菌菌含量为≥100×10cfu/g)、\n3000mg/kg饲料级蒙脱石和0.5mg/kg的生物活性蒙脱石粉。\n[0052] 1.2、试验日粮及饲养管理\n[0053] 日粮为参照美国NRC(1998)仔猪营养需要配制而成的粉状全价饲料，(加含药物预混剂，其中药物预混剂提供至全价料：金霉素120ppm+盐霉素40ppm，试验组药物预混剂减半)。预饲期3d，在此期间进行驱虫和防疫注射；每个重复的8头仔猪饲养于同一栏中，试验过程中如有仔猪腹泻或其他疾病则给与治疗。试验猪全期按照猪场中生产管理规程进行，提供适宜的生长环境条件，按照常规免疫程序进行免疫接种，保持各试验组管理与环境条件的一致性。试验期为30天。\n[0054] 试验期内每日记录投料量，观察猪只健康，并记录腹泻头数和天数与猪只发病死亡状况。\n[0055] 1.3、测定指标和方法\n[0056] 分别于试验开始、15d日龄和30日龄早上9:00时，将已空腹12小时的试验猪称取重量，按天统计采食量(以重复为单位)，并每天观察记录仔猪发病、腹泻和死亡等情况。\n计算平均日增重(ADG，Average daily gain)、腹泻指数，腹泻频率。其中，腹泻指数＝粪便评分之和/供试猪总头数；粪便评分标准见表1。\n[0057] 表1粪便评分标准\n[0058] \n[0059] 高\n[0060] 腹泻频率＝∑(腹泻仔猪头数×仔猪腹泻天数)/(试验仔猪头数×试验天\n数)×100％。\n[0061] 1.4数据处理与统计方法\n[0062] 试验所有数据用SPSS(13.0)统计软件进行方差分析，用邓肯氏(Duncan)新复极差法进行多重比较。试验结果采用平均数±标准误(M±SE)表示。\n[0063] 2结果\n[0064] 2.1断奶仔猪平均日增重，结果见表2\n[0065] 表2断奶仔猪平均日增重(g/d.头)\n[0066] \n[0067] 注：同列肩标字母完全不同者，表示差异显著(P＜0.05)；含相同字母或未标字母者，表示差异不显著(P＞0.05)，下同。\n[0068] 试验前期，益生菌组的ADG比对照组提高0.6％(P＞0.05)，蒙脱石组的ADG比对照组提高5.3％(P＞0.05)，生物活性蒙脱石组的ADG比对照组提高7.8％(P＜0.05)。\n试验后期，益生菌组的ADG比对照组提高1.6％(P＞0.05)，蒙脱石组的ADG比对照组提高\n0.8％(P＞0.05)，生物活性蒙脱石组的ADG比对照组提高5.9％(P＜0.05)。说明试验前期益生菌和蒙脱石有一定的促进生长的效果，但统计检验差异不显著。试验后期益生菌和蒙脱石均不能促进仔猪生长。生物活性蒙脱石试验的全程都可以促进仔猪的生长，相比对照组达9.0％(P＜0.05)，差异显著。\n[0069] 2.2断奶仔猪腹泻的结果\n[0070] 益生菌、蒙脱石粉和生物活性蒙脱石粉对断奶仔猪腹泻的影响，结果见表3。\n[0071] 表3\n[0072] \n[0073] 试验前期，益生菌组、蒙脱石组和生物活性蒙脱石组的腹泻频率分别为6.35％、\n4.20％和1.91％，远低于对照组的16.4％；试验后期益生菌组、蒙脱石组和生物活性蒙脱石组腹泻频率分别为1.22％、0.53％、0.12％，相比与对照组的1.26％，益生菌组与对照组无大的差异，蒙脱石组和生物活性蒙脱石组都优于对照组。试验前期益生菌组、蒙脱石组和生物活性蒙脱石组的腹泻指数分别为0.49、0.53和0.14，比对照组的2.64，分别低5倍、5倍和19倍；试验后期三试验组的腹泻指数分别为0.11、0.12和0.05，也好与对照组的0.28。\n以上数据说明，益生菌有一定的控制腹泻的效果，蒙脱石和生物活性蒙脱均能很好地控制仔猪腹泻，但生物活性蒙脱石的效果要优于普通的饲料级蒙脱石。\n[0074] 实施例3\n[0075] 发酵培养基中添加200目医药级蒙脱石粉发酵地衣芽孢杆菌，制成含地衣芽孢杆菌的生物活性蒙脱石粉。\n[0076] 具体步骤为：\n[0077] (1)4℃保存的冻干菌种或-80℃保存的液体菌种进行活化。将地衣芽孢杆菌CICC23584在事前准备好的LB固体培养皿上划线，然后放置于设定为35℃的生化培养箱中培养24小时。\n[0078] (2)一级种子液的制备。从活化的培养皿上挑取典型均一的单菌落接种到事先准备好的LB液体无菌培养基里，然后置于恒温振荡培养器里，设定温度为32℃，转速为\n150rpm，培养22小时。获得一级种子液。\n[0079] (3)二级种子液的制备。首先将制作种子液的发酵系统的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌，然后将事先配制的种子培养基(LB培养基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡剂)导入发酵罐，用蒸气将培养基灭菌，待冷却至40℃时，将步骤2)制作的一级种子液按培养基体积的7％接入发酵罐。发酵条件为：温度37℃，转速为120rpm，通气量为培养基体积的0.3-0.5倍/min，罐内压力维持在0.03MPa左右，培养18小时。\n[0080] (4)生物活性蒙脱石粉的制备。\n[0081] a、将生产用发酵系统的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌。\n[0082] b、配制发酵培养基，培养基配方为：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，丙酸钠3.0g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)1.0g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g/L，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.005g/L，消泡剂0.1毫升/升，pH水为自来水，。培养基的量为发酵罐容积的65％。\n[0083] c、将发酵培养基导入发酵罐，并按每升培养基2克的量加入细度为200目，纯度为\n98％的医药级蒙脱石粉。开动搅动电机，转速为270rpm，通蒸汽进行灭菌。\n[0084] d、将灭菌后的培养基冷却至40℃，按培养基量的0.8％接入二级种子液，发酵条件为：通入精度为0.01um高效空气除菌过滤器过滤的除菌空气，通入量为培养基体积的\n0.3-0.5倍/min，罐内压力维持在0.05MPa，搅动转速为260rpm，培养温度为35℃，培养时间为56小时。\n[0085] e、发酵完成后，罐压保持0.03MPa，将发酵液的温度快速降至10℃，再静止24小时，去上清液，取沉淀物离心，离心温度控制在4℃，离心转速为6000rpm，离心后的物料按重量比1∶0.3的量加入白炭黑，用混合机搅拌匀均，45℃真空干燥，干燥后水份含量要低于8％。干燥物用粉碎机粉至过80目筛后，制得本发明所述的生物活性蒙脱石粉。经测定，\n8\n每克生物活性蒙脱石粉所含益生菌的量大于5×10CFU。\n[0086] 实施例4：\n[0087] 发酵培养基中添加200目饲料医药级蒙脱石粉发酵地衣芽孢杆菌，制成含地衣芽孢杆菌的生物活性蒙脱石粉。\n[0088] 具体步骤为：\n[0089] (1)、4℃保存的冻干菌种或-80℃保存的液体菌种进行活化。将地衣芽孢杆菌ACCC10146在事前准备好的LB固体培养皿上划线，然后放置于设定为37℃的生化培养箱中培养24小时。\n[0090] (2)、一级种子液的制备。从活化的培养皿上挑取典型均一的单菌落接种到事先准备好的LB液体无菌培养基里，然后置于恒温振荡培养器里，设定温度为37℃，转速为\n150rpm，培养22小时。获得一级种子液。\n[0091] (3)、二级种子液的制备。首先将制作种子液的发酵系统的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌，然后将事先配制的种子培养基(LB培养基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡剂)导入发酵罐，用蒸气将培养基灭菌，待冷却至40℃时，将步骤2)制作的一级种子液按培养基体积的7％接入发酵罐。发酵条件为：温度37℃，转速为120rpm，通气量为培养基体积的0.3-0.5倍/min，罐内压力维持在0.03MPa左右，培养18小时。\n[0092] (4)、生物活性蒙脱石粉的制备。\n[0093] a、将生产用发酵系统的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌。\n[0094] b、配制发酵培养基，培养基配方为：蛋白胨15克/升，酵母浸粉5克/升，玉米淀粉5克/升(需先糊化)，磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)0.5克/升，丙酸钠3克/升，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.01克/升，消泡剂0.5毫升/升，pH为7.0，水为自来水，。培养基的量为发酵罐容积的65％。\n[0095] c、将发酵培养基导入发酵罐，并按每升培养基5克的量加入细度为200目的饲料级蒙脱石粉。开动搅动电机，转速为270rpm，通蒸汽进行灭菌。\n[0096] d、将灭菌后的培养基冷却至40℃，按培养基量的0.6％接入二级种子液，发酵条件为：通入精度为0.01um高效空气除菌过滤器过滤的除菌空气，通入量为培养基体积的\n0.3-0.5倍/min，罐内压力维持在0.05MPa，搅动转速为260rpm，培养温度为37℃，培养时间为56小时。\n[0097] e、发酵完成后，罐压保持0.03MPa，将发酵液的温度快速降至10℃，再静止24小时，去上清液，取沉淀物离心，离心温度控制在4℃，离心转速为6000rpm，离心后的物料按重量比1∶0.3的量加入白炭黑，用混合机搅拌匀均，45℃沸腾干燥，干燥后水份含量要低于8％。干燥物用粉碎机粉至过80目筛后，制得本发明所述的生物活性蒙脱石粉。经测定，\n8\n每克生物活性蒙脱石粉所含益生菌的量大于5×10CFU。\n[0098] 实施例5：\n[0099] 生物活性蒙脱石粉在断奶仔猪上的应用\n[0100] 1材料与方法\n[0101] 1.1试验动物及分组\n[0102] 试验所用杜长金断奶仔猪由浙江省某农场提供。选择60头杜长大24天断奶仔猪(平均起始重7.51kg)，随机分成2组，分别为对照组(饲喂基础日粮)和生物活性蒙脱石制剂组(每吨基础日粮加50克实施例4所制的生物活性蒙脱石)，每组3个重复，每个重复\n10头仔猪(公母各半)。\n[0103] 1.2试验日粮及饲养管理\n[0104] 日粮为参照美国NRC(1998)仔猪营养需要配制而成的粉状全价饲料，(加含药物预混剂，试验组药物预混剂减半)。预饲期4d，在此期间进行驱虫和防疫注射；正试期28d。\n试验期间自由采食和饮水，室温、通风、日常管理和免疫都按常规进行。\n[0105] 1.4样品的采集与处理\n[0106] 以栏为单位记录每天采食量和腹泻头数，计算平均日增重、料重比和腹泻率。\n[0107] 腹泻率＝(每天腹泻头数×腹泻天数)/(试验猪头数×试验天数)\n[0108] 看\n[0109] 2试验结果\n[0110] 2.1生物活性蒙脱石粉对仔猪日增重和腹泻率的影响\n[0111] \n 项目 对照组 试验组\n 始重/kg 7.56 7.46\n 终重/kg 14.69 15.82\n 日增重/g 255 299\n 腹泻率 16.8％ 1.4％\n[0112] 由表1可以看出，与对照组相比，添加生物活性蒙脱石粉使仔猪日增重提高了\n17.3％。由于饲养管理较好，试验组仔猪发生腹泻率仅为1.4％，对照组也仅有16.8％。\n[0113] 实施例6：\n[0114] 发酵培养基中添加200目医药级蒙脱石粉发酵屎肠球菌，制成含屎肠球菌的生物活性蒙脱石粉。\n[0115] 具体步骤为：\n[0116] (1)、4℃保存的冻干菌种或-80℃保存的液体菌种进行活化。将屎肠球菌CICC6078在事前准备好的MRS固体培养皿上划线，然后放置于设定为35℃的生化培养箱中培养24小时。\n[0117] (2)、一级种子液的制备。从活化的培养皿上挑取典型均一的单菌落接种到事先准备好的MRS液体无菌培养基里，然后置于恒温振荡培养器里，设定温度为32℃，转速为\n150rpm，培养22小时。获得一级种子液。\n[0118] (3)、二级种子液的制备。首先将制作种子液的发酵系统的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌，然后将事先配制的种子培养基(MRS培养基，另外按0.1毫升/升的量加入消泡剂)导入发酵罐，用蒸气将培养基灭菌，待冷却至40℃时，将步骤2)制作的一级种子液按培养基体积的5％接入发酵罐。发酵条件为：温度30℃，转速为120rpm，过入无菌二氧化碳气体，罐内压力维持在0.03MPa左右，培养22小时。\n[0119] (4)、生物活性蒙脱石粉的制备。\n[0120] a、将生产用发酵系统的空气过滤器、空气管道和发酵罐用蒸汽进行灭菌。\n[0121] b、配制发酵培养基，培养基配方为：大豆蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母粉\n5.0g/L，葡萄糖5.0g/L，无水乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0g/L 2.0g/L，Tween 80 1.0g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4·H2O)2.0g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.2g/L，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.05g/L，碳酸钙(CaCO3)10.0g/L，消泡剂0.1毫升/升，pH为6.8，水为自来水。培养基的量为发酵罐容积的75％。\n[0122] c、将发酵培养基导入发酵罐，并按每升培养基2克的量加入细度为200目，纯度为\n98％的医药级蒙脱石粉。开动搅动电机，转速为270rpm，通蒸汽进行灭菌。\n[0123] d、将灭菌后的培养基冷却至35℃，按培养基量的0.8％接入二级种子液，发酵条件为：通入精度为0.01um高效空气除菌过滤器过滤的除菌二氧化碳，罐内压力维持在\n0.05MPa，搅动转速为260rpm，培养温度为30℃，培养时间为56小时。\n[0124] e、发酵完成后，罐压保持0.03MPa，将发酵液的温度快速降至10℃，再静止24小时，去上清液，取沉淀物离心，离心温度控制在4℃，离心转速为6000rpm，离心后的物料按重量比1∶0.3∶0.1的量加入白炭黑和乳糖，拌匀均，40℃真空干燥，干燥后水份含量要低于8％。干燥物用粉碎机粉至过80目筛后，制得本发明所述的生物活性蒙脱石粉。经测\n8\n定，每克生物活性蒙脱石粉所含益生菌的量大于5×10CFU。\n[0125] 实施例7：\n[0126] 发酵培养基中添加200目医药级蒙脱石粉发酵植物乳杆菌，制成含植物乳杆菌的生物活性蒙脱石粉。\n[0127] 具体步骤为：\n[0128] (1)、4℃保存的冻干菌种或-80℃保存的液体菌种进行活化。将植物乳杆菌CGMCC \n1.19在事前准备好的MRS固体培养皿上划线，然后放置于设定为35℃的生化培养箱中培养\n24小时。\n[0129] 其他工艺条件同实施例6。\n[0130] 实施例8：\n[0131] 生物活性蒙脱石混合制剂对肉鸡生长性能的影响\n[0132] 1、材料与方法\n[0133] 1.1试验设计剂与日粮选用1日龄的罗斯308肉鸡216羽，平均体重为\n(42.89±2.35)g，随机分为对照组和试验组，每组3个重复，每个重复36羽(公、母各半)，对照组饲喂基础日粮，处理组在基\n[0134] 础日粮的基础上每千克饲料添加35mg生物活性蒙脱石混合制剂(实施例1制作的生物活性蒙脱石10mg，实施例3制作的生物活性蒙脱石5mg，实施例6制作的生物活性蒙脱石10mg，实施例7制作的生物活性蒙脱石10mg)。基础日粮(表1)参照美国NRC(1994)肉鸡营养需要配合成粉状全价料，添加药物预混剂。\n[0135] 表1基础日粮组成和营养成份(风干基础)\n[0136] \n[0137] 注：预混料可为每千克全价料提供：维生素A 12500IU，维生素D32500\n[0138] IU，维生素E 18.75IU，维生素K 32.65mg，维生素B2(核黄素)6mg，维生素B120.025mg，生物素0.0325mg，叶酸1.25mg，烟酸(尼克酸)50mg，泛酸12mg；铜8mg，铁\n80mg，锌75mg，锰100mg，硒0.15mg，碘10.35mg，杆菌肽锌4mg，硫酸粘杆菌素2mg。\n[0139] 1.3饲养管理试验期42d，采用地面平养，自由饮水和采食；24h光照；肉鸡舍第1周温度保持在33℃，以后每周平均降低2℃；按常规免疫程序对试验鸡进行免疫接种。\n[0140] 1.4测定指标与方法\n[0141] 生产性能记录试验鸡初始体重(IW)，根据鸡的实际数量计算1-21、22-42日龄和\n1-42日龄期间的平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)。\n[0142] 1.6统计分析数据采用SPSS15.0统计软件处理，并采用t检验进行显著性分析，结果以平均值±标准误表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。\n[0143] 2结果与分析\n[0144] 2.1生物活性蒙脱石混合制剂对肉鸡生产性能的影响由表2可见，日粮中添加生物活性蒙脱石混合制剂对肉鸡前期(1-22日龄)的生产性能无显著影响，日均增重和日均采食量只提高了4.4％和6％，统计检验差异不显著。而肉鸡后期(22-42日龄)的日增重和日采食量分别比对照组提高了16.00％和13.00％(P＜0.05)，全期分别提高了10.74％(P＜0.05)和7.19％(P＞0.05)。上述结果表明，生物活性蒙脱石混合制剂能显著促进肉鸡后期的采食及生长，从而改善肉鸡全期生长性能。