一种大豆抗病毒基因及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种大豆抗病毒基因的发现、抗病性检测及其应用。\n背景技术\n[0002] 大豆花叶病毒病是由大豆花叶病毒（Potyviridae，Soybean Mosaic Virus，SMV）引起的世界性病害,它严重影响大豆产量和品质。大豆花叶病毒从病毒分类学上属于马铃薯Y病毒科，马铃薯病毒属的一个种。马铃薯病毒属成员共同点是种子带毒，蚜虫为主要传毒介体。大豆花叶病毒病危害重、流行广，难以控制，培育抗病品种是目前控制SMV流行最有效方法。该病于1899年首次在中国东北发现，相继又在美国、朝鲜、德国、苏联等国家发现。近年来该病在中国东北地区发生越来越严重，一般流行年造成减产25%-60%，大流行年可造成绝产。花叶病毒病不但影响大豆的产量，还影响大豆的种子质量，可造成病株籽粒出现褐斑，严重时病粒率高达50%以上，严重降低大豆的商品价值。\n[0003] 大豆花叶病毒的体外保毒期在环境为室温、4℃和0℃以下分别为4～5 天、15天-2 -4\n和120天左右，致死温度为58~66℃，稀释限点为10 ～10 。SMV可以通过种子在上下代和不同地域之间传播，在田间又可通过汁液摩擦接种及蚜虫的非持久性进行传播。在大豆花叶病毒研究的早期，大豆花叶病毒在大豆上的症状被认为是由SMV株系决定的，因此在株系划分时把株系分为花叶株系、坏死株系、顶枯株系等。随着研究的不断深入，人们发现，症状的类型不仅与株系有关还与品种也有一定联系。同一株系在不同品种上或同一品种感染不同株系均可产生不同的症状，品种和株系之间存在明显的互作。环境条件，特别是温度对症状的表现有明显的影响。过高或过低的温度可使大豆带毒隐症或延迟显症。种传和接种病毒所造成的种皮斑驳现象同时受环境和遗传两个方面的影响。\n[0004] 大豆花叶病毒在植株上的症状主要分花叶和坏死两大类。花叶类症状表现为感染初期嫩叶上出现明脉，随着病程的发展，陆续出现轻花叶、花叶、黄斑花叶、叶片向下反卷，有些还出现疱叶、畸形叶、皱缩、矮化、增厚发脆，茎杆和豆荚上的茸毛消失，产生“光荚”。坏死型症状主要表现为感染初期叶片上出现褐色小枯斑或叶脉坏死，随后坏死部分扩大甚至连成一片，严重者导致叶片脱落。某些品种感染特定株系后，主茎生长点坏死，形成所谓的“顶枯”。被大豆花叶病毒侵染的植株，其籽粒的种皮上会产生褐色或黑色的斑纹，即褐斑粒。斑纹的发生受大豆品种和发病程度的影响。大豆花叶病毒病在籽粒上形成的斑纹颜色与脐色一致或稍深，有时斑纹会遍布整个籽粒表面，多数呈现放射性或带状。\n[0005] 近年来对SMV抗性遗传规律的研究，已经从抗性大豆品种中，发现了一些大豆花叶病毒病抗性基因、位点：如PI96983、Ogden 分别携带Rsv1、Rsv1t；Raiden、Columbia分别携带Rsv2、Rsv3；Kwanggyo、Marshall、York分别携带一个与Rsv1 等位的单显性抗性基因Rsv1vk、Rsv1m 和Rsv1y。用不同品种大豆抗性品系杂交后发现，大豆花叶病毒病所引起的症状反应都是由同一组基因或与其紧密连锁的一些基因控制的，每种抗性基因可能是一对隐性基因或一组复等位基因，多种抗病基因聚合为成簇存在的家族基因。\n[0006] 由于大豆花叶病毒流行的初侵染源是种子带毒长出的幼苗, 蚜虫的非持久性传播形成再侵染。目前没有有效的化学药物可以杀灭病毒, 因此培育抗大豆花叶病毒的品种是最有效的防治手段。对近年来新育成大豆新品种的抗花叶病毒病鉴定试验结果表明：表现抗侵染品种约占品种总数的16%~27%,高抗品种约占15%左右，表现中抗、抗性一般以及中感的品种占三分之一，高感品种占到33%~40%,可见目前的品种抗性并不理想。在杂交育种中发现, 高抗扩展×感病农艺亲本组合后代的抗扩展遗传率显著高于中抗扩展×感病农艺亲本组合, 因此，应尽可能选择抗性强的品种做抗源亲本以培育抗性优异的新品种。\n[0007] 现代生物技术的迅速发展，为生物工程抗性育种提供了一种有效途径，可以应用基因芯片、表达谱分析等手段，从不同品种甚至异源生物中分离抗病基因，将其构建成植物表达载体并转化入受体植株，从而提高受体植株的抗病能力。\n发明内容\n[0008] 本发明的目的是提供一种培育抗植物病毒病转基因植物的方法，所述植物指大豆，所述基因为一种从抗大豆花叶病毒病品种中发现的抗病基因，可用常规杂交育种及转基因技术，将其转入不具有花叶病毒病抗性的植物品种中，用于增强植物抗病能力，从而提高产量。\n[0009] 本发明提供的方法，为从抗大豆花叶病毒病的大豆品种中克隆抗病相关基因Gm-RSMV3，将此基因构建转化载体并将其转入大豆模式品种Williams82（为花叶病毒病易感品种），得到的转基因植株后代对大豆花叶病毒病的侵染具有高抗或免疫作用。\n[0010] 本发明涉及一种大豆基因Gm-RSMV3（Genbank HQ711935）,其核苷酸序列见序列表中序列1，其氨基酸序列见序列表中序列2。它是一种钾离子通道AKT2/3样蛋白，具有很强的体内抗植物病毒病活性，它具有一个锚蛋白重复结构域、一个CAP受体结构域和一个离子通道结构域。\n[0011] 本发明应用大豆内源抗病毒基因Gm-RSMV3构建转化载体，转化大豆花叶病毒病敏感品种，对转化后的植株进行抗除草剂筛选，然后依次进行基因组DNA PCR、bar基因表达检测、RT-PCR、Southern blot、inverse PCR，证实得到的确实是转基因植株且外源基因已正确表达。T0代植株自交，得到的T1代继续自交得到T2纯合植株，对得到的纯合T2代植株接种大豆花叶病毒，进行抗病性检测，发现原本不抗大豆花叶病毒病的品种，其转基因植株后代的抗病能力达到高抗水平。通过以上实验，发现并证实了Gm-RSMV3基因为广谱、高效的大豆内源抗病毒病基因。\n[0012] 所述转化载体为pB7RWG2_Gm-RSMV3，其核酸全序列见序列表中序列3， Gm-RSMV3基因编码区为其中的9764～11798bp（反向插入）。\n[0013] 所述转基因大豆植株，用inverse PCR方法鉴定外源基因插入位点，已证实2个株系的外源基因插入位点，分别在第12号染色体的6019723与6019724bp之间（反向插入），侧翼序列insertion-chr12见序列表中序列4，对应于大豆基因组DNA的第12号染色体上\n6019498bp到6019723bp的226个碱基序列；和第3号染色体的24073531与24073532bp之间（正向插入），侧翼序列insertion-chr03见序列表中序列5，对应于大豆基因组DNA的第\n3号染色体上24073293到24073531的239个碱基序列。\n[0014] 本发明提供的方法，包括如下步骤：\n[0015] 1. 大豆内源抗花叶病毒病基因的发现和克隆：\n[0016] （1）分别培养大豆花叶病毒病抗性株系Rsmv和易感株系Ssmv；\n[0017] （2）分别在这两个株系的植株上接种大豆花叶病毒，并在接种后不同时期分别取叶片材料；\n[0018] （3）提取不同植物材料的RNA，使用Affymetrix大豆芯片做不同材料、接种花叶病毒后不同时期的表达谱分析；\n[0019] （4）分析芯片表达谱数据，找出可能与大豆花叶病毒病抗性相关的差异表达基因，并用qRT-PCR方法验证；\n[0020] （5）使用RT-PCR方法，从抗病大豆中克隆抗病候选基因Gm-RSMV3。\n[0021] 2. 转化载体构建和大豆遗传转化\n[0022] （1）应用gateway方法，将Gm-RSMV3重组到转化载体pB7RWG2中，得到pB7RWG2_Gm-RSMV3；\n[0023] （2）将载体pB7RWG2_Gm-RSMV3通过电激法转入农杆菌EHA101；\n[0024] （3）以大豆Williams82的子叶节为外植体，使用农杆菌侵染转化法，将Gm-RSMV3基因转入Williams82；\n[0025] （4）子叶节经除草剂筛选、生长，得到转基因大豆T0代植株。\n[0026] 3.大豆植株的转基因鉴定：\n[0027] （1）取大豆叶片，提取基因组DNA，用Gm-RSMV3基因和bar特异引物扩增，检测外源基因是否进入大豆植株；\n[0028] （2）取大豆叶片，处理后用QuickStix™ Kit for LibertyLink® (bar) Cotton leaf&seed试剂盒，检测bar基因是否在转基因植株中表达；\n[0029] （3）大豆植株的基因组经电泳、转膜，以bar基因和Gm-RSMV3基因的片段为探针，做DNA Southern blot检测这些基因是否整合到大豆基因组中，以及它们的拷贝数；\n[0030] （4）根据载体pB7RWG2_Gm-RSMV3上left border和right border的序列，设计PCR引物及相应的酶切位点，做inverse PCR，检测外源基因在大豆基因组中的插入位置。\n[0031] 4. 转基因大豆植株的抗花叶病毒病水平鉴定：\n[0032] （1）转基因大豆T0代自交得到T1代，T1代自交得T2代；\n[0033] （2）分子鉴定外源基因在T2代植株中表达水平正常；\n[0034] （3）在受体基因型和转基因T2植株上分别接种大豆花叶病毒，观察发病情况；\n[0035] （4）统计不同株系对花叶病毒病的抗性。\n[0036] 本发明提供了一种植物抗病基因，在大豆中对大豆花叶病毒病的不同株系均有很强的抗性，可用于培育具有高度抗大豆花叶病毒病的大豆新品种。\n[0037] 本发明提供的基因对其它植物病毒病也有一定的抗性，可转入其它植物的病毒病易感品种中，对这些品种提供一定的病毒病抗性作用，特别是对马铃薯Y病毒科具有较好的抗性，可用于培育其它植物的抗病毒病新品种。\n附图说明\n[0038] 附图1抗花叶病毒病载体pB7WG2D_Gm-RSMV3图谱；\n[0039] 附图2是接种SMV后对照植株和转基因植株中SMV含量（mock 未接种SMV对Williams82，\n[0040] Williams82接种SMV；RSMV-oe1和RSMV-oe2，两个Gm-RSMV3转基因株系分别接种SMV；\n[0041] 0 DAI, 14 DAI和28DAI，分别为接种大豆花叶病毒当天、14天后和28天后）；\n[0042] 附图3是转基因大豆植株Bar基因试纸条检测结果（箭头所示2条带表示bar转基因阳性）；\n[0043] 附图4、5是转基因大豆southern blot结果（箭头所示为外源基因的条带附图4探针为bar基因片段、附图5探针为Gm-RSMV3基因片段）；\n[0044] 附图6是 Gm-RSMV3基因在接种SMV后不同转基因株系中表达水平检测（mock为Williams82未接种对照；Williams82为转基因受体基因型接种SMV；RSMV3-oe1， RSMV3-oe2，RSMV3-oe3，RSMV3-oe4为转Gm-RSMV3基因的四个株系。0 DAI, 14DAI和28DAI，分别为接种SMV之前、之后14天和之后28天）；\n[0045] 附图7、8、9、10是 转基因株系和对照株系接种SMV后不同时期的表型，Williams82在14天时开始发病，在28天时病症严重；转基因植株在14天和28天时均未出现明显病症（附图7为Williams82接种SMV后14天 ；附图8为转基因植株接种SMV后\n14天；附图9为Williams82接种SMV后28天；附图10为转基因植株接种SMV后28天）。\n具体实施方式\n[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。\n[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。\n[0048] 实施例1. 抗病转基因植物的获得\n[0049] 一、抗病基因的鉴定和克隆\n[0050] 1. 抗病基因的鉴定：\n[0051] （1）植物材料处理及取材：以广谱、高抗大豆花叶病毒病的大豆品种Rsmv为抗性基因供体材料，以感病的大豆品种Ssmv为对照材料， 将两个品种的大豆分别播种，每种15株。生长条件为昼夜温度分别为27℃、18℃，光周期17小时光照、7小时黑暗。待大豆幼苗生长至第二片三出复叶完全展开后，将大豆花叶病毒和空白对照缓冲液分别接种于第一片三出复叶，待症状（感病品种叶片出现黄色斑点）出现后，分别取不同发病时期的叶片（接种后14天、28天、35天），-70℃冻存。\n[0052] （2）提取植物总RNA：将各材料接种大豆花叶病毒前、接种后发病前、发病后的-70℃冻存叶片，按单株每株分别取100mg，在研钵中加入液氮研磨成细粉，保持冷冻状态将叶粉装入液氮预冷的2ml离心管中，加入1ml Trizol(购自Invitrogen公司，货号\n15596026)迅速混匀，室温放置15分钟，每2～3分钟颠倒混匀一次，然后10,000rpm离心\n1分钟，吸取上清液转入新离心管，弃去沉淀。此后按照说明书的方法进行总RNA提取。用nano-drop测定RNA浓度及纯度。\n[0053] （3）芯片杂交及其结果分析：将同种、同时期采集的材料，每5个为一组，各取5μg混合，各为三组。然后按照Affymetrix公司推荐的方法标记探针，并与大豆芯片（Cat.# \n900525）杂交，洗脱、扫描，得到不同材料、不同处理的基因表达谱初步结果。芯片实验结果经过归一化处理，用genespring GX10软件比较差异表达基因，从中筛选抗病品种接种花叶病毒后基因差异表达提高2倍以上的基因。查找这些芯片实验差异表达基因的CDS区域，在其人工翻译得到的氨基酸序列中查找已知抗病结构域，对有已知结构域的基因，从其CDS序列中设计PCR引物，用做芯片取的同批植物材料，提取总RNA，做RT-PCR验证基因芯片结果。（部分芯片实验差异表达基因及验证结果表1）\n[0054] 表1 接种大豆花叶病毒后芯片分析结果与real-time PCR 结果\n[0055] \n基因编号 探针编号 基因编号 芯片差异表达倍数 real-time PCR 验证表达倍数\n1 GmaAffx.11053.1.A1_at Glyma02g44040.1 2.32 3.71\n2 Gma.3165.1.S1_at Glyma06g20230.1 2.14 2.78\n3 GmaAffx.59248.1.S1_at Glyma08g20030.1 3.41 2.38\n4 GmaAffx.49439.1.S1_at Glyma09g13180.1 2.17 5.56\n5 GmaAffx.92621.1.A1_at Glyma10g02400.1 2.46 2.23\n7 Gma.8456.1.S1_a_at Glyma06g41700.1 4.02 6.42\n9 Gma.4680.1.A1_s_at Glyma14g08000.1 2.48 2.97\n11 Gma.17505.1.S1_at Glyma16g01470.1 2.04 2.92\n12 Gma.6913.1.A1_at Glyma20g02580.1 2.04 2.04\n16 GmaAffx.58721.1.S1_at Glyma08g24960.1 2.11 4.49\n17 GmaAffx.59249.1.S1_at Glyma05g29530.1 4.90 7.52\n18 GmaAffx.66290.1.S1_at Glyma18g51960.1 4.09 1.27\n19 GmaAffx.74228.1.S1_at Glyma01g32680.1 3.41 6.23\n20 GmaAffx.74510.1.S1_at Glyma19g07650.1 10.18 16.65\n22 GmaAffx.78466.1.S1_at Glyma14g05260.1 7.83 152.18\n23 GmaAffx.80474.1.S1_at Glyma17g19800.1 20.33 35.38\n[0056] 2. 抗病基因克隆：\n[0057] 对通过RT-PCR表达验证的基因，在其CDS区域的5’和3’端指定PCR引物，用高保真聚合酶做RT-PCR，扩增出这些基因的全长CDS，将产物测序，并与此基因在该基因型中相应位置的基因组DNA序列比较，完全一致后确认克隆到了此基因的CDS区域。为便于进行基因表达载体构建，在上、下游引物的5’端在分别加上attB1和attB2同源重组位点序列。对于其中的抗花叶病毒病候选基因Glyma08g20030.1（Genbank HQ711935），重命名为Gm-RSMV3，使用的克隆引物上下游序列分别为GR3f： acaagtttgtacaaaaaagcaggctATGCTAGCTGATCGTTACCCCCA（序列6）和GR3r： accactttgtacaagaaagctgggtTCAGCTTATCCAACAAAAAAAAAGTTTG（序列7）。PCR程序为预变性5分钟；变性30秒，退火45秒，延伸2分钟，20个循环；延伸10分钟。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带并使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收PCR产物。\n[0058] 二、 转化载体构建和大豆遗传转化\n[0059] 1. 构建植物转化载体：\n[0060] 回收的PCR片段与植物表达载体PB7RWG2一起，用Invitrogen公司的MultiSite Gateway Pro试剂盒，按照说明书的操作方法进行同源重组，得到PB7RWG2_Gm-RSMV3载体（载体图谱见附图1）。将质粒用热激法转入大肠杆菌DH5α，转化产物涂LB-SpR平板，挑单克隆摇菌，菌液测序，证实Gm-RSMV3已整合到载体的正确位置。\n[0061] 2.载体pB7RWG2_Gm-RSMV3通过电激法转入农杆菌EHA101\n[0062] 制备农杆菌感受态细胞：挑取EHA101单菌落接种于3ml YM（每升含0.4g酵母提取物，10g甘露醇，0.1g氯化钠，0.1g 硫酸镁，0.5g磷酸氢二钾，调整pH值至7.0）液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600≈0.5，吸取0.5 ml菌液接种于50ml液体培养基中，\n300rpm 30℃振荡培养过夜，至OD600≈1.0，冰浴10min；3000 xg 4℃离心10min，弃去上清液，加入50 ml 预冷的无菌10%甘油重悬沉淀, 然后加入无菌10%甘油至500ml，再次3000 xg 4℃离心10min，丢弃上清液；重复以上的洗涤步骤一次。细胞沉淀重悬于25ml预冷的无菌10%甘油，3000 xg 4℃离心5min，弃去上清液，细胞沉淀重悬于0.5ml预冷的无菌10%\n10\n甘油，使细胞中浓度为5 x 10 细胞/毫升。分装200μl/管-70℃冻存。\n[0063] 电击法转化农杆菌：在离心管中加入<100ng（5μl TE）的PB7RWG2_Gm-RSMV3质粒，置于冰上， 加入20μl刚融化的上述处理的细胞，轻弹管壁混匀，将所有液体转入冰上预冷的0.1厘米电击杯底部，用Gene Pulser Xcell电击，参数为电容25微法，电阻200欧姆，电压2400伏特。电击后，立即向电击杯中加入1ml YM液体培养基，将所有液体从电击杯中吸出，250rpm 30℃振荡培养3小时，将培养液涂在YM固体培养基（含有卡那霉素、氯霉素及壮观霉素）平板上，30℃培养2天。\n[0064] 农杆菌转化子鉴定：挑取三抗性单菌落，用Gm-RSMV3鉴定引物做菌落PCR，阳性菌株即为转化了PB7RWG2_Gm-RSMV3质粒的农杆菌。\n[0065] 3. 农杆菌侵染转化：\n[0066] 农杆菌激活：将大豆Williams82种子单层摆放在90mm培养皿中，在其中倒入\n100ml消毒液（10%漂白水中加入3.5 ml浓盐酸），密闭消毒过夜。第二天在超净台中打开培养皿，吹30min除去多余氯气。将农杆菌EHA101接种在YEP固体培养基（5 g/L酵母提取物, 10 g/L 胰蛋白胨, 5 g/L 氯化钠, 12 g/L 细菌琼脂.用固体NaOH调整pH 至 7.0；\n添加50 mg/L 卡那霉素, 25 mg/L 氯霉素）上28℃培养2天，然后接种在含有相同抗生素的2ml液体培养基中250rpm振荡培养1天，从中取0.25ml接种至250ml 相同的液体培养基中，振荡培养过夜，次日继续培养至OD620 = 0.8-1.0。将菌液室温4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，重悬于25ml ×5管侵染培养基（1/10 Gamborg B5盐：1/10 B5大量元素, \n1/10 B5微量元素, 1/10 B5维生素, 2.8 mg/L铁盐, 3.8 mg/L Na乙二胺四乙酸二钠；\n以及30 g/L蔗糖, 3.9 g/L MES, pH 5.4。高压灭菌后加入过滤灭菌的激素GA3 (0.25 \n8\nmg/L), BAP (1.67 mg/L), 乙酰丁香酮40 mg/L），使菌体终密度达到0.5 X 10 细胞/ml。\n使用前于28℃ 60rpm摇动此液体30min以上。\n[0067] 农杆菌侵染：在超净台中，向装有灭菌后的大豆种子的培养皿中加入无菌去离子水，在黑暗中浸泡种子过夜。将吸涨后的种子从培养皿中取出，吸去表面多余水分，用解剖刀沿种脐纵向分开子叶和种皮，将子叶节根部的胚轴切开约3毫米，并除去子叶节连接处的胚芽。在90毫米培养皿中放入约60个上述方法处理的半粒外植体，加入30ml农杆菌侵染液，使外植体完全浸没在液体中，室温放置20～30分钟并经常轻轻晃动。\n[0068] 共培养：农杆菌侵染完成后，将种子腹面向上放在无菌滤纸上吸干菌液，然后将半粒种子外植体转移到盛有共培养培养基（1/10X Gamborg B5基本培养基：1/10X B5大量盐, 1/10X B5微量盐, 1/10 B5维生素, 2.8 mg/L铁盐, 3.8 mg/L Na乙二胺四乙酸二钠；30 g/L蔗糖, 3.9 g/L MES, and 4.25 g/L琼脂, pH 5.4。高压灭菌后加入抽滤灭菌的GA3 (0.25 mg/L),BAP (1.67 mg/L),半胱氨酸(400 mg/L), 二硫苏糖醇(154.2 mg/L),40 mg/L 乙酰丁香酮。培养基在培养皿中固化后，在表面覆盖一层无菌滤纸）的培养皿中，腹面向下接触滤纸。用封口膜封住培养皿，在24℃ 1400lux 16小时光照/8小时黑暗环境培养3～5天。\n[0069] 芽诱导培养：共培养阶段结束后，将种子从共培养培养基中取出，放在无菌纸巾上吸干多余液体，然后放入芽诱导培养基（1X Gamborg B5 基本盐：1X B5大量盐, 1X B5微量盐, 1X B5维生素, 28 mg/L铁盐, 38 mg/L Na乙二胺四乙酸二钠；30 g/L蔗糖, 0.59 g/L MES,7 g/L琼脂, pH 5.7。以上成分高压灭菌后加入抽滤灭菌的BAP (1.11 mg/L), 特美汀 (50 mg/L), 头孢噻肟 (100 mg/L), 万古霉素(50 mg/L) 和草胺膦 (8 mg/L)），使子叶节进入培养基中并与表面呈30～45度角，再生区域与培养基表面平齐。外植体在\n24℃ 16小时光照/8小时黑暗环境培养14天后，在芽诱导培养基中继代一次，切除从子叶节和顶端长出的芽，将胚轴修剪到3毫米长，将新产生的伤口置于培养基中，分生区与培养基表面平齐，继续培养14天。\n[0070] 4. 抗性筛选及转基因植物种植\n[0071] 将子叶从外植体上除去，在外植体芽垫基部与培养基表面平齐出切一个伤口，将外植体转移到芽伸长培养基；每两周继代一次，每次在在芽垫基部水平切一个伤口，此阶段共八周。在含除草剂的培养基上长出的芽长度达到3厘米以上时，将它们从芽垫上切下，转移到生根培养基中，芽基部插入培养基中0.5厘米深。24℃ 16小时光照/8小时培养1～\n2周。\n[0072] 当芽长出2条以上根时，轻轻将幼苗从生根培养基中取出，用自来水洗去多余的培养基，移栽到小盆土中，在幼苗顶部加罩保湿，24℃ 16小时光照/8小时环境炼苗至少1周。当幼苗长出至少两片三出复叶时，用250mg/L的basta溶液，滴在两个三出复叶的每个中间叶片的中脉处，五天后观察除草剂抗性结果，叶片没有枯死的是抗性转基因植株，移栽到大盆中。\n[0073] 三、大豆植株的转基因鉴定：\n[0074] 1. PCR鉴定转基因植株\n[0075] 快速提取大豆基因组DNA：在温室中正常管理种植转基因植株，至开花结种得到T1代种子。T1代种子种植出幼苗，待生长到长出2片以上三出复叶时，取一片单叶剪碎放入\n1. 5 ml离心管中，加入750μl DNA提取液（200 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸 pH7.5，\n25 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠 pH8.0，250 mmol/L NaCl，0.5% SDS），用微型研磨棒将叶片捣碎至溶液成绿色,放置3～5 分钟；加入750μl氯仿/异戊醇(体积比24∶1) ,涡旋混合均匀, 12000rpm离心5分钟;取上清液至另一1.5 ml离心管中，加入500μl异丙醇，颠倒混合均匀，室温下放置5 min, 12000rpm离心5分钟；弃去上清液,加入1ml 70%乙醇漂洗5分钟，12000rpm离心1分钟，弃去上清液，放置15分钟晾干乙醇,加入50μl TE溶解DNA。\n[0076] PCR鉴定：在转基因大豆基因组DNA中用PCR检测Gm-RSMV3基因。用1μl上述DNA溶液为模板，Gm-RSMV3基因特异引物RSMV3-up（5’-ACTAAAGTTTCCAAGGGTAAGCAT-3’）（序列8）、RSMV3-down（5’-TGATCACATCAACGGAGTCTATTT-3’）（序列9）做PCR，退火温度56℃，程序为96℃ 5分钟；96℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环；72℃ 10分钟。同时以为转基因的大豆Williams82基因组DNA为阴性对照，水为空白对照。目标PCR产物大小为204bp。\n[0077] 2.试纸条鉴定转基因植株：\n[0078] 为了进一步确认转基因植株中的外源基因是否表达，采用美国envirologix公司试剂盒QuickStix™ Kit for LibertyLink® (bar) Cotton leaf&seed，按照说明书的方法，对PCR阳性的植株检测，结果如附图3所示，试纸条上出现两条带为阳性，只有一条说明是阴性。\n[0079] 3.Southern blot：\n[0080] 为检测外源基因在大豆基因组中的拷贝数、整合位置和抗病能力，需要得到纯合植株。T1代植株自交，种植其种子得到T2代植株，用检测基因组DNA中Gm-RSMV3基因的方法，用PCR检测各T1单株的后代是否分离，如有分离，说明T1代仍为杂合体，需要继续种植下一代检测纯合。如无分离，可确定T1代已为纯合体，可进行转基因拷贝数、外源基因整合位点及抗病性检测。\n[0081] 采用高盐CTAB法（Kidwell KK, Osborn TC: Simple plant DNA isolation procedures. In Plant genomes: methods for genetic and physicalmapping. Edited by Beckman JS, Osborn TC. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer AcademicPublishers; 1992:1–13.）提取基因组DNA。用ND-1000分光光度计测量浓度，然后将DNA于-20℃储存备用。\n[0082] 酶切基因组DNA：取25μl 基因组DNA（约20μg）加入5μl NEB buffer2，1μl HindⅢ (NEB），0.5μl 100X BSA，20μl ddH2O，37℃酶切5小时。\n[0083] 标记探针方法：在0.2ml PCR管中加入需要标记的DNA(一般使用1ug标记后分几次使用) ，用双蒸馏水将体积稀释到15μl, 放入沸水中变性10分钟，快速放于冰上。加入Hexanucleotide Mix (10×a) 2μl，dNTP Labeling Mix 2μl，Klenow enzyme labeling grade 1μl；混合后瞬时离心， 37℃反应24小时，加入0.2M 乙二胺四乙酸二钠（pH 8.0）\n2μl ， 终止反应，或者65℃加热10分钟终止反应。\n[0084] 电泳和转膜： 1%琼脂糖凝胶电泳酶切的大豆基因组DNA，电压13V，电泳36h。使用Hybond N+尼龙膜（Amersham公司，货号RPN303B），按照说明书方法，将在琼脂糖凝胶中分离的DNA转移到膜上。\n[0085] 杂交和检测：使用紫外交联仪固定转移到尼龙膜上的DNA，设定70000uJ/cm2 。膜正面有DNA一面朝上进行紫外交联。使用25ml空白杂交液（SDS 7%，去离子甲酰胺50%，\n5×SSC，阻断液 2%，十二烷基肌氨酸钠0.1%，磷酸钠 pH7.0 50mM）42℃预杂交2小时。含有探针的杂交液从冰箱中拿出，沸水煮10min，立即放于冰上冷却5min变性。回收空白杂交液，加入含有探针的杂交液杂交过夜。次日将含探针杂交液回收，用洗液I（1×SSC，0.1% SDS），65℃ 15min，洗膜一次；加入洗液II（0.5×SSC，0.1% SDS），65℃ 20min，洗膜两次，洗去多余探针。在常温下加入漂洗液（马来酸缓冲液：马来酸0.1M，马来酸 0.15M，用NaOH调pH至7.5；加3μl/ml吐温-20）适量，轻度漂洗1~5分钟。加入阻断液（阻断试剂1%溶于100ml马来酸缓冲液），杂交管中反应，两次30分钟/次，封闭蛋白。将抗体用10000rpm离心5min，吸取上清1μl 加入阻断液，配制成抗体液。将上步中阻断液倒出，加入抗体液，杂交管中反应60分钟。换管，将膜从抗体液中拿出，换入漂洗缓冲液（洗液I：1×SSC，0.1% SDS；洗液II：0.5×SSC，0.1% SDS）中漂洗2次，每次15分钟。洗掉多余抗体，将漂洗缓冲液倒出，加入检测缓冲液（三羟甲基氨基甲烷-盐酸 0.1M，NaCl 0.1M，用盐酸调pH至9.5），\n2~5分钟。提前配制好CSPD 液，取10μl CSPD原液，用检测缓冲液稀释至1.5ml，铺好保鲜膜，将杂交膜带有DNA的一面朝上放置，加入1ml CSPD 液使其均匀涂满整张膜，充分反应5分钟后，除去多余的CSPD液。将杂交膜置于37℃反应15分钟。然后将膜正面向上，于暗室中与X光片底片曝光30分钟。将曝光的X光片依次放入显影液、停影液、定影液，之后用水冲洗、晾干。Southern-blot结果见附图4、5，可见转基因植株中带有1-2个拷贝的外源基因。\n[0086] 4. inverse PCR:\n[0087] 应用inverse PCR方法，测定双元载体的T-DNA区整合到大豆染色体的位置。\n[0088] 基因组DNA的酶切和环化连接：取5μg大豆基因组DNA，加入20U TaqI内切酶+buffer4+BSA，在10μl体系中65℃酶切过夜，然后80℃热失活20分钟。 将体系稀释至\n500μl，加入10μl T4 DNA ligase，室温连接环化2小时。加入1ml -20℃预冷的95%乙醇，-20℃沉淀30分钟，14000rpm离心15分钟，丢弃上清后用1ml 70%冷乙醇洗涤沉淀一次，丢弃上清并吹干沉淀，将沉淀重溶于10μl TE中。\n[0089] PCR和测序：取1μl作为PCR模板，20μl体系PCR。根据转化载体T-DNA的右边界序列，设计inverse PCR引物如下： RB-out：tccgttcgtccatttgtat（序列10），RB-in：\nggcgggaaacgacaatct（序列11）。PCR程序为96℃ 5分钟；96℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ \n60秒，30个循环；72℃ 10分钟。PCR产物取5μl，用1%琼脂糖凝胶电泳检查，每个转基因大豆株系有1条数百bp的条带（具体大小因外源基因插入基因组的位置而异）。将此PCR产物测序，得到T-DNA插入位点的侧翼大豆基因组序列，即可确认插入具体位置。在本研究中，应用此方法，已确定了两个株系的外源基因插入位点，分别在第12号染色体的6019723与6019724bp之间（反向插入，序列见序列表中序列4）和第3号染色体的24073531与\n24073532bp之间（正向插入，序列见序列表中序列5）。\n[0090] 四、转基因大豆植株的抗花叶病毒病水平鉴定：\n[0091] 1.在T1代转基因植株和受体基因型植株中，接种大豆花叶病毒前后外源基因表达水平检测：\n[0092] 提取total RNA: PCR检测阳性的T1代转基因大豆植株，与野生型受体植株和敏感型植株同时接种大豆花叶病毒，此后分别于第14天和第28天，取叶片进行RT-PCR检测目的基因表达水平。采用Trizol（Invitrogen公司，货号15596026）法提取总RNA，取约50mg大豆叶片，按照试剂说明书进行提取，得到的RNA沉淀在空气中干燥10分钟，加入\n50μl DEPC水，65℃水浴助溶10分钟。用nano-drop检查RNA的浓度和纯度，然后将RNA置於-70℃备用。\n[0093] 反转录：以1μg总RNA为模板、1μl 0.5μg/μl OligodT为引物，使用M-MLV反转录酶（Invitrogen公司，货号28025-013）按照试剂说明书进行反转录，得到cDNA。\n[0094] Real-time qPCR：使用东洋纺的Realtime PCR Master Mix（Toyobo公司，货号QPK-201），按照说明书方法做real-time qPCR，检测转基因植株基因组DNA中Gm-RSMV3基因的表达水平。在每个0.2ml PCR管中，分别加入1μl 稀释的反转录产物，上下游引物（2.5μM）各1μl（同时以β-actin基因为阳性对照，同种材料总RNA为基因组DNA污染对照，非转基因大豆总RNA反转录产物为阴性对照，水为空白对照），2X SYBR green预混液\n10μl，PCR用水加至终体积20μl，放入荧光实时定量PCR仪中，用仪器预设的程序运行，同时检测各样品的激发光。程序运行结束后，运行仪器自带的分析软件，应用ΔΔCt法，得到Gm-RSMV3基因的相对表达丰度。结果发现不论是模拟接种对照、未接种的对照和各个转基因株系，其Gm-RSMV3基因的表达水平在接种0、14和28天时，同一个株系内基因表达水平均无明显变化，但是各个转基因株系中的RSMV3基因表达水平均比受体材料大幅度提高（结果见附图6）。\n[0095] 2.在T1代转基因植株和受体基因型植株中，接种大豆花叶病毒前后植株表型观察：\n[0096] 转基因植株抗病性鉴定：从-20℃冰箱中取出冻存的大豆花叶病毒染病叶片，在磷酸缓冲液中研碎。取大豆Williams82 二片真叶期幼苗20株，同时期的转基因大豆幼苗\n62株（其中株系1的12株，株系2的3株，株系3a的14株，株系3b的17株，株系4a的14株，株系4b的2株），用砂纸分别摩擦每个三出复叶中的一片单叶，并在摩擦处涂抹接种含有大豆花叶病毒的缓冲液。接种后3天、7天、14天时，观察各株的情况：Williams 82的20株14天时全部发病，叶片出现明显皱缩；各转基因株系在14天时未发现病症。28天时非转基因植株全部出现2或3级症状（7/20，2级症状；13/20，3级症状）（根据《转基因大豆环境安全检测技术规范》，下同），叶片出现显著皱缩、起泡症状；大部分转基因植株无病症（50/62，0级），少部分转基因植株叶片出现轻度皱缩（12/62，1级）。35天时所有非转基因植株病症转为3或4级（16/20，3级症状；4/20，4级症状），部分叶片严重皱缩、碎裂；所有转基因植株病症加重不显著，染病株数有所增加，叶片未出现严重皱缩现象（34/62，0级；\n20/62，1级；8/62，2级）（见表4，附图7、8、9、10）。\n[0097] 表4 抗花叶病毒病检测\n[0098] \n[0099] 3.在T1代转基因植株和受体基因型植株中，接种大豆花叶病毒前后植株中病毒含量检测\n[0100] 大豆植株中病毒水平检测：在接种大豆花叶病毒后的第14天和28天，分别按单株取抗病性检测实验中的转基因和Williams82对照植株叶片1片/株，每个叶片分别取约\n100mg，采用Trizol（Invitrogen公司，货号15596026）法提取总RNA，按照试剂说明书进行提取。\n[0101] 以上步提取得到的总RNA为模板、OligodT为引物，进行反转录，得到cDNA。取1μg总RNA（根据不同样品浓度，约2～10μl）置于0.2ml PCR管中，加入1μl 0.5μg/μl的OligodT反转录引物并混匀，70℃水浴10分钟，使用M-MLV反转录酶（Invitrogen公司，货号28025-013）按照试剂说明书进行反转录，得到cDNA。。\n[0102] 使用针对大豆花叶病毒衣壳蛋白（cp）、外源基因Gm-RSMV3的序列设计特异PCR引物，序列如下：cp-f：GCACCAGCAGTAGCAAAGG（序列12），cp-r：TCAAGCAAGTGGTCCAAGC（序 列 13），产 物 154bp；rsmv3-f：GTTGTAGACCTCAGAGCCTTACCT（序 列 14），rsmv3-r：\nCGTTCTCCACCATCAAATCCT（序列15），产物186bp。\n[0103] 并 以 大 豆 actin1 基 因（引 物 序 列：上 游 Gm-act5（序 列 16），\n5’-ACATTGTTCTTAGTGGTGGCTC-3’；下游Gm-act3（序列17）：5’-CTGGAAGGTGCTGAGGGAT-3’，产物173bp）为内参，做real-time qPCR，检测Gm-RSMV3基因、大豆花叶病毒在不同植株中的表达水平，以及基因表达丰度与大豆花叶病毒发病之间的关系。在每个0.2ml PCR管中，分别加入1μl 稀释的反转录产物，上下游引物（2.5μM）各1μl（同时以actin1基因为阳性对照，同种材料总RNA为基因组DNA污染对照，非转基因大豆总RNA反转录产物为阴性对照，水为空白对照），2X SYBR green预混液10μl，PCR用水加至终体积20μl，放入荧光实时定量PCR仪中，用仪器预设的程序运行，同时检测各样品的激发光。程序运行结束后，运行仪器自带的分析软件，应用ΔΔCt法，得到病毒RNA在不同植株中的相对表达丰度。结果表明，接种SMV的第14天和28天，在Williams82中的SMV病毒含量大大高于在Gm-RSMV3转基因植株中的含量（附图2）。\n[0104] 序列表\n[0105] <110> 东北师范大学\n[0106] <120> 一种植物抗病基因及其应用\n[0107] <130> 1\n[0108] <160> 17\n[0109] <170> PatentIn version 3.5\n[0110] <210> 1\n[0111] <211> 1785\n[0112] <212> DNA\n[0113] <213> Glycine max\n[0114] <400> 1\n[0115] atgctagctg atcgttaccc ccaccaagga aagacatgga ttggagctgt gaatccaaac 60[0116] ttccgagaga caagccttcg gatcagatac atttcagcca tgtactggtc catcactacc 120[0117] atgaccactg taggttatgg tgacctccac gctgtcaaca ccatagaaat gatcttcatt 180[0118] attttctaca tgctctttaa ccttggccta actgcttact tgattggtaa catgacaaat 240[0119] cttgttgttg aaggaactcg ccgtaccatg gagtttagaa atagcattga ggcagcatca 300[0120] aattttgtgt gccgaaatcg gttgcctcca aggttaaaag agcagatctt ggcttacatg 360[0121] tgcttaagat ttaaggcaga gagcttgaac cagcatcagc ttattgaaca gcttccgaag 420[0122] tcgatttgca aaagcatctg ccagcatttg ttttttgcaa ctgtagagaa agtctatctt 480[0123] ttcaaaggcg tctcaaaaga aattattttg tccctggttg caaaaatgaa ggcagaatac 540[0124] ataccaccca gagaggatgt tatcatgcaa aatgaagcac cagatgatgt ttacataata 600[0125] gtctctggcg aagcggagat cctcgatact gaaacggaga aagaaagaat tttagggact 660[0126] ctacatactg gggaaatgtt tggagagttt ggtgcacttt gttgtagacc tcagagcctt 720[0127] acctacagaa ccaagactct cacacagctc ctgagactca agaccaatac tcttctagaa 780[0128] gcaatgcaga ttaaaagaga agataacata caaatactca aaaattttct tcagcatttc 840[0129] aagcaggtta aggatctgag tatcaaggat ttgatggtgg agaacgtaga agaagaggac 900[0130] cctaacatgg ctgtgaactt gctaactgtg gcaagcactg gcaatgctgc ttttcttgag 960[0131] gagcttctaa gagcaggttt ggatcctgac attggagact ccaaagggaa aactccattg 1020[0132] cacatagcag catcaaatgg gcatgaaggg tgtgttaaag tcttactcaa gcatgcatgc 1080[0133] aacatgcata taaaagacat gaatggtaac actgcactat gggatgctat agcatcaaaa 1140[0134] cattactcaa tattccggat cctcttccag ctttctgctc tctctgatcc aaacatagca 1200[0135] ggcgatctca tgtgtacagc agcaaaaaga aatgaactaa cagtgatgac cgatcttcta 1260[0136] aggcaaggac taaacgttga ctccaaagat caccgtgata caactgcaat ccaaattgcc 1320[0137] atggccgaaa atcatgttgg catggttcag ttgcttgtca tgaatggtgc tgatgtctct 1380[0138] gatgtgcata accatgaatt ttgttcatcc accttaaatg aaatgctgca gaagcgtgaa 1440[0139] attgggcatc taattaatgt aactgaggtc atgctcagtg aagttgtatt aaaagggaga 1500[0140] catcaagagc aggagcacaa tggaggaaga tctaatagtg gactaaagtt tccaagggta 1560[0141] agcatatata gaggtcaccc tgtagttaga agagaaaaat gttccatgga agctgggaag 1620[0142] ctaataaggt tgcctgattc aatagaggaa ctaaaaacta ttgcaggtga aaaatttggg 1680[0143] tttgatgcaa aagatgcaat ggtgacaaat gaagaaggag ctgaaataga ctccgttgat 1740[0144] gtgatcagag ataatgacaa actttttttt tgttggataa gctga 1785[0145] <210> 2\n[0146] <211> 594\n[0147] <212> PRT\n[0148] <213> Glycine max\n[0149] <400> 2\n[0150] Met Leu Ala Asp Arg Tyr Pro His Gln Gly Lys Thr Trp Ile Gly Ala[0151] 1 5 10 15\n[0152] Val Asn Pro Asn Phe Arg Glu Thr Ser Leu Arg Ile Arg Tyr Ile Ser[0153] 20 25 30\n[0154] Ala Met Tyr Trp Ser Ile Thr Thr Met Thr Thr Val Gly Tyr Gly Asp[0155] 35 40 45\n[0156] Leu His Ala Val Asn Thr Ile Glu Met Ile Phe Ile Ile Phe Tyr Met[0157] 50 55 60\n[0158] Leu Phe Asn Leu Gly Leu Thr Ala Tyr Leu Ile Gly Asn Met Thr Asn[0159] 65 70 75 80[0160] Leu Val Val Glu Gly Thr Arg Arg Thr Met Glu Phe Arg Asn Ser Ile[0161] 85 90 95\n[0162] Glu Ala Ala Ser Asn Phe Val Cys Arg Asn Arg Leu Pro Pro Arg Leu[0163] 100 105 110\n[0164] Lys Glu Gln Ile Leu Ala Tyr Met Cys Leu Arg Phe Lys Ala Glu Ser[0165] 115 120 125\n[0166] Leu Asn Gln His Gln Leu Ile Glu Gln Leu Pro Lys Ser Ile Cys Lys[0167] 130 135 140\n[0168] Ser Ile Cys Gln His Leu Phe Phe Ala Thr Val Glu Lys Val Tyr Leu[0169] 145 150 155 160[0170] Phe Lys Gly Val Ser Lys Glu Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Lys Met[0171] 165 170 175[0172] Lys Ala Glu Tyr Ile Pro Pro Arg Glu Asp Val Ile Met Gln Asn Glu[0173] 180 185 190\n[0174] Ala Pro Asp Asp Val Tyr Ile Ile Val Ser Gly Glu Ala Glu Ile Leu[0175] 195 200 205\n[0176] Asp Thr Glu Thr Glu Lys Glu Arg Ile Leu Gly Thr Leu 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