一种提高银杏类黄酮含量的方法及金雀异黄素的应用

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一种提高银杏类黄酮含量的方法及金雀异黄素的应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于农业科技技术领域，特别涉及一种提高银杏类黄酮含量的方法及金雀异黄素的应用。\n背景技术\n[0002] 银杏(Ginkgo biloba L.)原产我国，银杏科银杏属，落叶乔木，雌雄异株，又称白果树、公孙树。银杏是目前世界上最古老的孑遗植物，有着“活化石”之称。科学家早在上世纪70年代已研究证明银杏叶提取物对心脑血管疾病非常好的治疗效果，自此银杏的药用价值被人们广泛关注，如今银杏已经成为国际药用植物研究开发的热点之一。其中银杏类黄酮化合物是治疗老年性痴呆症的首选天然药物，对高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、心血管疾病等也有十分显著的治疗效果。此外，黄酮类化合物广泛分布于植物界，具有很多的生物学功能，如调节植物生长，保护植物免受紫外线，抗氧化活性，抗衰老，抵御致病菌侵袭，影响植物的生殖力和花粉的萌发。虽然银杏类黄酮类化合物具有重要的药理和生理活性，但是在银杏体内含量低，不易提取，所以提高银杏叶类黄酮含量从而提高银杏的抗性已经成为研究重点。\n[0003] 金雀异黄素(Genistein,GNT)又称为染料木黄酮或染料木素，是一种大豆体内天然存在的异黄酮类物质，还是酪氨酸蛋白激酶的抑制剂，被用来研究细胞G蛋白信号的转导。金雀异黄酮及其糖苷具有弱雌激素样活性，具有良好的抗癌、抗氧化和抑制过氧化氢生成、预防中老年骨质疏松症、改善女性更年期综合症和心血管疾病、增加抗氧化酶活性等作用，广泛用作营养食品补充剂。\n[0004] 近年来众多研究表明GNT可以促进畜禽类的生长，提高泌乳或产蛋性能，提高繁殖力和增强机体免疫力，可以促进蟠桃果实着色，提高蟠桃糖酸比，促进苹果果实着色和桃果实着色，增加葡萄果实花青苷积累等。但是对于GNT在植物类黄酮方面的研究，未有任何相关报道。\n发明内容\n[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种提高银杏类黄酮含量的方法及金雀异黄素的应用，解决了银杏叶片类黄酮含量极低的问题，提供了一种操作简便，成本低，可以高效提高银杏类黄酮含量方法。\n[0006] 本发明第一方面提供了一种提高银杏类黄酮含量的方法，其步骤包括：用金雀异黄素处理银杏。\n[0007] 本发明第二方面提供了金雀异黄素在提高植物类黄酮含量中的应用。\n[0008] 本发明的有益效果是：①本发明通过对银杏施加金雀异黄素，改变了银杏体内生理代谢水平，促进银杏光合作用，从而促进类黄酮积累，提高银杏类黄酮含量，提高银杏的药用和经济价值，且操作简便，成本低廉。\n[0009] ②经金雀异黄素处理的叶片，类黄酮、花青素含量、可溶性糖含量、叶绿素含量显著提高，抗氧化酶活性、苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶及查尔酮异构酶活性明显增强，因此不仅提高类黄酮含量，还大大提高了植物的抗性，从而提高植物产量和品质，具有良好的推广应用前景。\n具体实施方式\n[0010] 本发明第一方面提供了一种提高银杏类黄酮含量的方法，其步骤包括：用金雀异黄素处理银杏。对银杏施加金雀异黄素，改变了银杏体内生理代谢水平、促进银杏光合作用，从而促进类黄酮积累，提高银杏类黄酮含量，且植物的花青素含量、可溶性糖含量、叶绿素含量显著提高，抗氧化酶活性、苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶及查尔酮异构酶活性明显增强。\n[0011] 优选的，所述金雀异黄素配制为金雀异黄素的水溶液后处理银杏，所述金雀异黄素浓度为50-150μmol/L。一定范围内随着喷施金雀异黄素浓度的增高，银杏叶片中的类黄酮含量呈上升趋势，而银杏叶花青素、苯丙氨酸解氨酶含量呈现先上升后下降的趋势，50-\n150μmol/L的浓度范围内各个参数均较佳，更加有利于银杏光合作用及体内生理代谢。\n[0012] 更加优选的，所述金雀异黄素水溶液中含有增溶剂。所述增溶剂可增加金雀异黄素在水溶液中的溶解度，分散更加均匀，有利于植物对金雀异黄素的吸收。\n[0013] 进一步优选的，所述增溶剂为吐温，所述吐温占金雀异黄素水溶液的体积百分比为0.05-0.2％。\n[0014] 优选的，所述处理的方法为在银杏发芽一个月后将金雀异黄素喷布于银杏叶片表面。施用金雀异黄素的最佳时机为银杏发芽一个月后，此时对银杏作用的效果更加显著。\n[0015] 更加优选的，所述金雀异黄素的用量为1-5μmol。\n[0016] 本发明第二方面提供了金雀异黄素在提高植物类黄酮含量中的应用。\n[0017] 优选的，所述植物为银杏。\n[0018] 更加优选的，所述应用的步骤包括：在银杏发芽一个月后，将金雀异黄素配制为金雀异黄素的水溶液后喷布于银杏叶片表面，所述金雀异黄素浓度为50-150μmol/L，所述金雀异黄素水溶液中含体积百分比为0.05-0.2％的吐温。\n[0019] 下面将结合实施例对本发明提供的一种提高银杏类黄酮含量的方法及金雀异黄素的应用予以进一步说明。\n[0020] 实施例1\n[0021] 1测试方法\n[0022] 本实施例中各测定方法如下，实施案例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。\n[0023] 1.1银杏叶绿素含量测定\n[0024] 按照下列方法进行叶绿素a，叶绿素b含量的测定。取3g鲜叶、打孔取样、研磨、加入\n80％丙酮浸提，定容后在663nm和645nm波长下测量，根据C(mg·L-1)＝20.31 OD 645+8.04 OD 663，(OD为分光值)计算叶绿素浓度。最后用公式：Y(mg·dm-2)＝[浓度(mg·L-1)×提取\n2\n液总量(mL)/[叶面积(dm)×100]换算成叶绿素含量。进行3次重复测定，取平均值。\n[0025] 1.2花青素含量的测定\n[0026] 利用分光光度法对叶片花青素的含量进行测定，进行3次重复测定，取平均值。\n[0027] 1.3银杏可溶性糖含量的测定\n[0028] 采用蒽酮比色法测定可溶性糖，四组处理分别称量10g银杏叶烘干，取1g烘干后的叶片用10ml乙醇溶液研磨成匀浆，静置30min后，4500rpm离心15min，取上清液3ml到25ml容量瓶加水定容。然后取1ml稀释液加入5ml蒽酮试剂，煮沸10min，冷却后在620nm测定吸光值。\n[0029] 1.4银杏苯丙氨酸解氨酶活性的测定\n[0030] 用紫外分光光度法测定银杏苯丙氨酸解氨酶活性，取2.0g新鲜银杏叶片，加入3ml硼酸缓冲液和0.5g PVP，研磨，10 000rpm离心15min，取上清。取0.5mL苯丙氨酸溶液加入\n0.5ml上清液。然后加入10ml蒸馏水，在40℃的水浴中加热30min，再在沸水中煮5min终止反应，在290nm下测定分光光度值，以吸收变化0.01所需酶量作为一个酶活性单位(U)。进行3次重复测定，取平均值。\n[0031] 1.5银杏类黄酮含量的测定\n[0032] 紫外分光光度法测定提取物中总黄酮含量，称取银杏鲜叶1.0g后烘干，加\n10ml70％乙醇浸泡、抽滤，重复三次。合并滤液，定容至50ml待测。吸取5ml 100ug/L芦丁溶液、30％乙醇10ml、0.7ml 5％NaNO2、混匀后加入0.7ml 10％AlCl3。5min后加5ml 40％NaOH，\n30％乙醇定容25ml。35℃水浴10min后，510nm波长测定吸光度。以芦丁为标样，类黄酮含量以百分比表示。\n[0033] 1.6银杏抗氧化酶活性的测定\n[0034] 采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，以抑制NBT光化学还原的50％为一个酶活性单位(U)；采用愈创木酚显色法测定过氧化物酶(POD)活性，以每分钟内470nm下的光密度(D470nm)变化0.1为一个酶活性单位(U)；\n[0035] 采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性，以1min内A240降低0.1为一个酶活性单位(U)；利用APX在H2O2存在的条件下使抗坏血酸量减少的原理测定酶活性，紫外－可见分光光度计上读取290nm处吸光光度值在3分钟内每15秒中的变化。计算每分钟内每毫克蛋白转化的抗坏血酸量，为一个酶活性单位(U)。\n[0036] 2实验过程及结果\n[0037] 2.1实验过程\n[0038] 1)植物材料的获得\n[0039] 本发明的试验材料为1年生银杏实生苗，品种为“家佛手”。栽培基质为河沙与腐殖土按1：2配比混合基质，花盆(直径25cm，高35cm)，每盆一株，置于温室中，光照12h/d，相对湿度60-70％。每周每盆用100ml的液体化肥(含有0.36g N，0.12g P，0.14g K)浇灌。\n[0040] 2)实验处理\n[0041] 本发明在银杏苗长出四个叶片时，设置0(对照组)，50，100和150μmol/L四个浓度梯度的GNT水溶液，且水溶液中含有体积比为0.1％的吐温。喷洒银杏苗，每个处理设3个小区，每个小区设3次重复，共选取长势相同的36株银杏苗。每月一次，每次20ml，连续喷洒三月。喷施的时候，所有叶片及其正反面都要喷到。GNT处理完4周后开始采样测试。\n[0042] 2.2实验结果\n[0043] 2.2.1GNT对叶绿素含量的影响\n[0044] 采用本实施例1.1部分所述测试步骤，测得的GNT对叶绿素含量的影响结果见表1。\n[0045] 表1 GNT对银杏叶叶绿素含量的影响\n[0046]\n[0047] 注：同一列中不同字母代表在p<5％水平上差异显著。\n[0048] 由表1所示，100、150μmol/L GNT处理均能提高叶绿素a、叶绿素b的含量。100μmol/L GNT处理的叶绿素a、叶绿素b含量均为最高值，分别为1.386、0.647mg/g FW，分别显著高于对照组45.58％、34.51％，且P<0.05具有统计学意义。叶绿素a+b的变化幅度与叶绿素a、叶绿素b的含量的变化一致。叶绿素a/b的含量均大于1，且无显著性差异。\n[0049] 2.2.2 GNT对可溶性糖含量的的影响\n[0050] 采用本实施例1.3部分所述测试步骤，测得的GNT对可溶性糖含量的影响结果见表\n2。\n[0051] 表2 GNT对银杏叶可溶性糖、可滴定算含量的影响\n[0052]\n[0053] 注：同一列中不同字母代表在p<5％水平上差异显著。\n[0054] 表2所示可溶性糖含量测定结果表明，50、100、150μmol/L GNT处理的可溶性糖含量均高于对照组，比对照组分别高出：20.04％、10.11％、15.27％。表明喷施GNT对银杏叶片积累碳水化合物有一定的促进作用。\n[0055] 2.2.3 GNT对类黄酮含量及花青素含量的影响\n[0056] 采用本实施例1.2、1.5部分所述测试步骤，测得的GNT对类黄酮含量及花青素含量的影响结果见表3。\n[0057] 表3 GNT对银杏叶类黄酮、花青素含量的影响\n[0058]\n[0059]\n[0060] 注：同一项目中不同字母代表在p<5％水平上差异显著。\n[0061] 由表3所示结果可见，随着喷施GNT浓度的增高，银杏叶片中的类黄酮含量呈上升趋势。喷施150μmol/L GNT测得类黄酮含量平均值为159.74mg.100.g-1FW，显著高出对照组\n20.88％，且P<0.05具有统计学意义，由此得出结论，对银杏叶面喷施GNT有利于银杏叶类黄酮含量的增加。100、150μmol/L GNT处理的花青素含量分别为0.395、0.350mg 100g-1FW，比对照组分别高出27.01％、12.54％。由此可见GNT在一定的浓度范围有利于银杏叶花青素含量的增加。2.2.4GNT对苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶及查尔酮异构酶活性的影响[0062] 采用本实施例1.4部分所述测试步骤，测得的GNT对苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶及查尔酮异构酶活性的影响结果见表4。\n[0063] 表4 GNT对银杏叶苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶及查尔酮异构酶活性的影响[0064]\n[0065] 注：同一列中不同字母代表在p<5％水平上差异显著。\n[0066] 由表4可见，随着喷施GNT浓度的增高，银杏叶片中的苯丙氨酸解氨酶含量呈先上升后下降趋势。100μmol/L的GNT处理的苯丙氨酸解氨酶含量最高，为344.592U mg-1，显著超出对照组(267.15)28.99％且P<0.05具有统计学意义。150μmol/L的GNT处理的苯丙氨酸解氨酶活性显著减弱，与喷施100μmol/L的GNT降低了3.44％。结果显示，在一定浓度范围内，对银杏叶面喷施GNT可以提高银杏叶苯丙氨酸解氨酶的活性。而随着喷施GNT浓度的增高，银杏叶片中的查尔酮合成酶、查尔酮异构酶含量呈上升趋势。\n[0067] 2.2.5 GNT对抗氧化酶活性的影响\n[0068] 采用本实施例1.6部分所述测试步骤，测得的GNT对抗氧化酶活性的影响结果见表\n5。\n[0069] 表5 GNT对银杏叶抗氧化酶活性的影响\n[0070]\n[0071] 注：同一列中不同字母代表在p<5％水平上差异显著。\n[0072] 由表5可见，随着喷施GNT浓度的增高，银杏叶片中的超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT活性呈上升趋势。喷施150μmol/L GNT测得SOD活性平均值为4.37U/mg，显著高出对照组89.17％(P<0.05)，测得CAT活性平均值为84.42U/mg，显著高出对照组33.76％(P<\n0.05)，由此得出结论，对银杏叶面喷施GNT有利于提高SOD和CAT的活性。随着喷施GNT浓度的增高，银杏叶片中抗坏血酸过氧化物酶APX和过氧化物酶POD的活性先上升后下降。100μmol/L的GNT处理的活性最高，为70.46U/mg和1.61U/mg，显著超出对照组54.17％和75.0％(P<0.05)。150μmol/L的GNT处理的APX和POD活性显著减弱，与喷施100μmol/L的GNT降低了\n3.0％和8.69％。结果显示，在一定浓度范围内，对银杏叶面喷施GNT可以提高银杏叶APX和POD活性的活性。\n[0073] 实施例2\n[0074] 1测试方法\n[0075] 本实施例所用测试方法与实施1相同。\n[0076] 2实验过程及结果\n[0077] 2.1实验过程\n[0078] 1)植物材料的获得\n[0079] 本发明的试验材料为1年生银杏实生苗，品种为“家佛手”。栽培基质为河沙与腐殖土按1：2配比混合基质，花盆(直径25cm，高35cm)，每盆一株，置于温室中，光照12h/d，相对湿度60-70％。每周每盆用100ml的液体化肥(含有0.36g N，0.12g P，0.14g K)浇灌。\n[0080] 3)实验处理\n[0081] 本发明在银杏苗长出四个叶片时，设置0(对照)，50，100和150μmol/L四个浓度梯度的GNT水溶液喷洒银杏苗，且水溶液中含有体积比为0.2％的吐温。每个处理设3个小区，每个小区设3次重复，共选取长势相同的36株银杏苗。每月一次，每次20ml，连续喷洒三月。\n喷施的时候，所有叶片及其正反面都要喷到。\n[0082] GNT处理完4周后开始采样测试。\n[0083] 2.2实验结果\n[0084] 2.2.1 GNT对类黄酮含量及花青素含量的影响\n[0085] 采用本实施例1部分所述测试方法，测得的GNT对类黄酮含量及花青素含量的影响结果见表6。\n[0086] 表6 GNT对银杏叶类黄酮、花青素含量的影响\n[0087]\n[0088] 注：同一列中不同字母代表在p<5％水平上差异显著。\n[0089] 由表6可见，随着喷施GNT浓度的增高，银杏叶片中的类黄酮含量呈上升趋势。喷施\n150μmol/L GNT测得类黄酮含量平均值为165.57mg.100.g-1FW，显著高出对照组30.14％(P<\n0.05)，由此得出结论，对银杏叶面喷施GNT有利于银杏叶类黄酮含量的增加。100、150μmol/L GNT处理的花青素含量分别为0.409、0.428mg 100g-1FW，比对照组分别高出37.25％、\n43.62％。由此可见GNT在一定的浓度范围有利于银杏叶花青素含量的增加。\n[0090] 2.2.2 GNT对苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶及查尔酮异构酶活性的影响[0091] 采用本实施例1部分所述测试方法，测得的GNT对苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶及查尔酮异构酶活性的影响结果见表7。\n[0092] 表7 GNT对银杏叶苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶及查尔酮异构酶活性的影响[0093]\n[0094]\n[0095] 注：同一列中不同字母代表在p<5％水平上差异显著。\n[0096] 由表7可见，随着喷施GNT浓度的增高，银杏叶片中的苯丙氨酸解氨酶含量呈先上升后下降趋势。100μmol/L的GNT处理的苯丙氨酸解氨酶含量最高，为350.112U/mg，显著超出对照组35.07％(P<0.05)。150μmol/L的GNT处理的苯丙氨酸解氨酶活性显著减弱，与喷施\n100μmol/L的GNT降低了6.06％。查尔酮合成酶和查尔酮异构酶的活性随着GNT浓度的增加而增高，150μmol/L的GNT处理的查尔酮合成酶和查尔酮异构酶活性分别比对照组高\n109.15％和118.17％(P<0.05)。结果显示，在一定浓度范围内，对银杏叶面喷施GNT可以提高银杏叶苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶和查尔酮异构酶的活性。\n[0097] 2.2.3 GNT对抗氧化酶活性的影响\n[0098] 采用本实施例1部分所述测试方法，测得的GNT对抗氧化酶活性的影响结果见表8。\n[0099] 表8 GNT对银杏叶抗氧化酶活性的影响\n[0100]\n[0101] 注：同一列中不同字母代表在p<5％水平上差异显著。\n[0102] 由表8可见，随着喷施GNT浓度的增高，银杏叶片中的SOD和CAT活性呈上升趋势。喷施150μmol/L GNT测得SOD活性平均值为4.19U/mg，显著高出对照组90.76％(P<0.05)，测得CAT活性平均值为86.15U/mg，显著高出对照组41.38％(P<0.05)，由此得出结论，对银杏叶面喷施GNT有利于提高SOD和CAT的活性。随着喷施GNT浓度的增高，银杏叶片中APX和POD的活性先上升后下降。100μmol/L的GNT处理的活性最高，为69.912U/mg和1.79U/mg，显著超出对照组70.96％和110.81％(P<0.05)。150μmol/L的GNT处理的APX和POD活性显著减弱，与喷施100μmol/L的GNT降低了4.25％和11.2％。结果显示，在一定浓度范围内，对银杏叶面喷施GNT可以提高银杏叶APX和POD的活性。\n[0103] 从实施例1、实施例2的测定结果可见，GNT处理可以稳定提高银杏叶中类黄酮、叶绿素、可溶性糖、花青素的含量以及苯丙氨酸解氨酶和抗氧化酶的活性。通过分析叶绿素、可溶性糖、花青素的含量以及苯丙氨酸解氨酶和抗氧化酶的活性与类黄酮含量之间的相关性，进一步证明了金雀异黄素(GNT)可以通过促进银杏光合作用从而提高银杏活性成分类黄酮含量。\n[0104] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。