一种龙眼开花调控基因DlWRKY25及其调控蛋白与应用

1.一种龙眼开花调控基因DlWRKY25，其核苷酸cDNA序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述龙眼开花调控基因表达的调控蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2
所示。
3.含如权利要求1所述龙眼开花调控基因的载体。
4.含如权利要求3所述载体的工程菌。
5.如权利要求1所述龙眼开花调控基因在促进植株开花方面的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：将权利要求4所述工程菌侵染植株，获得促进
开花的转基因植株。

一种龙眼开花调控基因DlWRKY25及其调控蛋白与应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种龙眼开花调控基因及其应用。\n背景技术\n[0002] 龙眼(Dimocarpus longana Lour.)是我国热区重要的经济果树之一，在我国具有\n2000多年的栽培历史。龙眼的栽培品种花芽分化具有季节性，并且需要低温诱导，在我国主\n产区，如广东的粤西地区和海南等，由于不具备龙眼成花所需的低温，常常需要用KClO3来\n催花，但这种方法存在较大的局限性，如受品种、环境等因素的制约。对龙眼成花机理的研\n究是解决这一问题的根本途径，查阅相关文献，龙眼成花的研究大多处在生理生化水平，其\n分子机理研究报道较少。\n[0003] 作为高等植物中一类重要的转录调控因子，该基因家族因含有高度保守的WRKY结\n构域而得名，其结构域分别是N‑端核心序列WRKYGQK与C‑端的锌指结构。根据其结构域的数\n目及锌指结构序列的特点，WRKY蛋白通常被划分为3个主要类型。目前研究表明，WRKY基因\n家族大部分成员参与植物的生长发育以及不同的逆境胁迫响应过程。因其能特异结合位于\n下游基因启动子区的顺式作用元件，从而对植物的生长发育、胁迫应答和激素信号转导产\n生影响。WRKY基因的研究主要集中在其对各种逆境胁迫的响应，与成花相关的研究较少。成\n花时间的遗传调控和成花相关基因的鉴定和阐明，对缩短童期及提高果树产量等都有重要\n意义。尽管目前已有研究表明WRKY在植物开花中起一定作用，比如，FvWRKY71能够促进开花\n和增加分枝。在长光照下，过表达WRKY25导致拟南芥提前开花。MdWRKY35可能通过响应不同\n的逆境胁迫进而参与不同的成花过程。但WRKY具体如何影响成花过程，目前尚不完全清楚。\n发明内容\n[0004] 本发明目的在于提供一种龙眼开花调控基因及其表达的蛋白与应用。\n[0005] 本发明目的按如下技术方案实现：\n[0006] 一种龙眼开花调控基因DlWRKY25，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。\n[0007] 一种龙眼开花调控蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。\n[0008] 本发明还提供了含有前述编码基因的载体。\n[0009] 本发明还提供了含有前述载体的工程菌。\n[0010] 本发明进一步提供了前述基因在促进植株开花方面的应用。\n[0011] 进一步地，所述应用为将所述工程菌侵染植株，获得促进开花的转基因植株。\n[0012] 本发明具有如下有益效果：\n[0013] 本发明对DlWRKY25基因进行克隆、亚细胞定位分析、转基因功能分析，同时通过\nqRT‑PCR对DlWRKY25基因在不同器官、花器官发育过程的表达规律进行研究，解析了\nDlWRKY25基因的功能；明确其在龙眼成花过程中的作用，为利用分子辅助加快早晚熟龙眼\n新品种的培育奠定基础。\n[0014] 本发明龙眼DlWRKY25基因的开放阅读框(open reading frame，ORF)全长为\n1038bp，编码345个氨基酸，具有典型的WRKY结构域和锌指结构，属于III型WRKY蛋白。qRT‑\nPCR结果表明，该基因具有组织表达特异性，在茎中相对表达量较高、果皮和幼果器官中次\n之。\n[0015] 烟草表皮细胞瞬时表达结果显示，荧光信号主要集中在细胞核，DlWRKY25编码的\n蛋白定位于细胞核。\n[0016] 转基因拟南芥结果表明，作为典型的转录因子，龙眼DlWRKY25正调控植物成花；过\n表达DlWRKY25基因的拟南芥植株相对于野生型都能表现出不同程度的早花表型，野生型植\n株26天左右开花，而转基因株系在16‑18天开花。\n[0017] DlWRKY25在‘四季蜜’龙眼成花诱导早期呈下调表达，T1时期仅为T2时期的5倍，而\n在′石硖′龙眼成花诱导过程中DlWRKY52的表达水平未出现显著性差异表达。\n[0018] 本发明为深入探究龙眼DlWRKY25基因在其生长发育过程中的分子生物学功能研\n究奠定了良好的基础。\n附图说明\n[0019] 图1为龙眼DlWRKY25基因PCR扩增图。\n[0020] 图2为不同物种(阿月浑子，Pistacia vera，XP_031278909.1；橡胶，Hevea \nbrasiliensis，XP_021670644.1)间WRKY蛋白序列比对图。左侧框部分表示WRKYGQK氨基酸\n序列，右侧框部分表示C2H2锌指结构基序。\n[0021] 图3为龙眼DlWRKY25与GenBank中相似序列的进化树分析图。\n[0022] 图4为DlWRKY25在龙眼不同组织中的相对表达量示意图。不同字母靶标表示差异\n达到显著水平。\n[0023] 图5为DlWRKY25在2种龙眼品种成花诱导过程中的表达模式图。不同字母靶标表示\n差异达到显著水平。T1代表休眠期，T2代表花分生组织出现时期(“红点”)，T3代表花器官形\n成时期。\n[0024] 图6为DlWRKY25蛋白在烟草中的亚细胞定位图。GFP：绿色荧光蛋白；Chloroplast：\n叶绿体自发荧光；Bright：明场；Merged：2种荧光与明场融合；标尺为10μm。\n[0025] 图7为DlWRKY25转基因拟南芥成花表型图。\n具体实施方式\n[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。\n[0027] 实施例1目的基因的克隆\n[0028] 1材料和方法\n[0029] 1.1植物材料来源\n[0030] 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所龙眼种质圃中3组长势和树龄(9年龄)\n一致的具有不断成花习性的′四季蜜′龙眼和正常成花主栽品种′石硖′龙眼。\n[0031] 1.2取样目的与部位\n[0032] 成花诱导表达分析取样部位：三个成花诱导时期的顶芽，分别为T1休眠期(顶芽未\n萌动，水分含量很少，硬度高)；T2″红点″时期(顶芽开始萌动发育成花序，芽轴伸长，基部的\n腋芽明显膨大，变为红色，俗称″红点″)；T3第1花序时期，(顶芽完全发育成花序，未开花)。\n[0033] 组织表达分析取样部位：取′四季蜜′龙眼的花、花芽、叶、果皮、果肉、根、种子、茎\n和幼果(花后60d整果)等器官。\n[0034] 所有的试验设3次重复，取样后立即放入液氮速冻并转入‑80℃冰箱中保存、备用。\n[0035] 1.3 DlWRKY25基因序列的克隆及生物信息分析\n[0036] 从龙眼基因组数据库(NCBI Sequence Read Archive，SRA315202)中获得\nDlWRKY25基因(Dlo_011410.1)的碱基序列和氨基酸序列信息。利用Primer Premier 5.0根\n据DlWRKY25基因的ORF序列设计引物W25‑S和W25‑A(表1)，委托天一辉远生物科技有限公司\n(广州)合成。用北京华越洋生物公司的植物RNA提取试剂盒提取‘四季蜜’龙眼叶片的RNA，\n采用Takara公司的PrimeScript RT‑PCR试剂盒，具体操作步骤参照说明书，反转录cDNA作\n为模板，进行PCR扩增克隆DlWRKY25基因。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃\n退火30s，72℃延伸60s，35个循环(变性‑延伸)；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物进行切\n胶回收和纯化连接到pMD18‑T载体上，转化DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，挑取阳性单\n克隆送天一辉远生物科技有限公司(广州)进行测序。\n[0037] 利用在线软件SMART程序(http：//smart.emblheidelberg.de/)预测蛋白结构域，\n利用ExPASy(http：//expasy.org/tools/)分析蛋白的等电点和分子量。根据克隆所得的\ncDNA序列，利用BLASTp对氨基酸序列进行同源性对比，同时利用MEGA 5软件进行氨基酸序\n列同源性分析及系统发育分析，构建Neighbor‑Joining进化树，1000次重复，其它均为默认\n设置。\n[0038] 1.4表达分析\n[0039] 根据克隆所得的DlWRKY25基因序列设计qRT‑PCR引物qW25‑S和qW25‑A(表1)，并在\nNCBI里利用BLASTn检验以确保引物的特异性。以龙眼的Actin基因(Dlo_028674)为内参基\n因，具体引物序列见表1。\n[0040] 表1所用引物信息\n[0041]\n[0042] qRT‑PCR反应所用仪器为Roche的LightCycler 480，PCR反应酶为Takara公司的\nSYBR Green Master Mix。反应体系为20mL，其中模板cDNA 40ng，上、下游引物各250nM，\nSYBR Green Master Mix 10μL，其余用ddH2O补齐。反应程序：94℃预变性5min；94℃10s，59\n‑ΔΔCt\n℃20s，72℃30s，40个循环后作熔解曲线(95→65℃，0.1℃/s)。利用2 计算DlWRKY52基\n因的相对表达量。所有样品进行3次重复，均设阴性对照。采用Excel软件进行平均数统计，\n以SPSS软件进行单因素方差分析目的基因在不同组织和材料里的变化的差异显著性(P＜\n0.05)，并使用SigmaPlot 12.5软件作图。\n[0043] 实施例2亚细胞定位分析\n[0044] 根据克隆所得的DlWRKY25基因序列设计引物(去除终止子)(表1)，扩增DlWRKY25\n的ORF全长，PCR反应程序如上。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测、纯化后连接pMD18‑T载\n体上，转化DH5α。挑取单菌落，经PCR检测后提质粒测序。然后将测序正确的目的基因与表达\n载体pBWA(V)HS‑osgfp进行连接。将酶连后的质粒转入大肠杆菌DH5α，阳性检测后挑选正确\n的菌株测序，然后提取得到pBWA(V)HS‑DlWRKY25‑osgfp质粒。接着利用电转化法将构建成\n功的质粒转入农杆菌LB4404，28℃培养2d后，刮去农杆菌菌块接种于YEB培养基中，170r/\nmin 1h，4000r/min离心4min，去上清收集菌液，并用10nmol/L MgCl2悬浮液重悬菌体，调\nD600为0.6左右。挑选生长状况良好的烟草植株，用去针头的1mL的注射器吸取制备好的菌\n液，从烟草叶片背面进行注射，标记后对其进行2d弱光培养，培养完成后，剪取被注射的烟\n草叶片制备成玻片，在激光共聚焦显微镜下进行观察与拍照。\n[0045] 实施例3过表达载体构建及转基因拟南芥功能验证\n[0046] 使用特异PCR引物OEW25‑S/OEW25‑A(表1)，以龙眼cDNA为模板，进行PCR扩增。该引\n物5′端分别加有BamH I酶切位点，反引物5′端分别加有Sac I酶切位点。获得的PCR产物与\npMD19‑T载体连接并进行测序。最后，提取测序正确的质粒，用BamHI和Sac I分别双酶切\npBI121和测序正确的质粒，通过T4 DNA连接酶构建含有DlWRKY25目标基因的植物表达载\n体，并命名为pBI121‑DlWRKY25。通过液氮冻融法将所构建的过量表达载体pBI121‑\nDlWRKY25转入农杆菌菌株GV3101，参照文献(Clough，Steven J，Bent，et al.Floral dip：a \nsimplified method for Agrobacterium‑mediated transformation of Arabidopsis \nthaliana.[J].Plant Journal，1998(16)，735‑743.)，通过农杆菌花絮侵染法将DlWRKY25\n基因转入野生型拟南芥，获得T0代种子。在含30ug/ml的MS固体培养基上筛选阳性拟南芥，\n同时用pBI121质粒特异引物检测阳性转基因拟南芥幼苗。将T3代转基因植株分别和野生型\n在相同环境中培养，并比较它们的开花表型。\n[0047] 实施例4结果与分析\n[0048] 1、DlWRKY25基因的克隆及生物信息学分析\n[0049] 以龙眼cDNA为模板，用W25‑S/W25‑A(表1)引物扩增出1000bp左右的片段(图1)。测\n序结果显示。该片段与龙眼(′红核子′)基因组数据库中的目的序列(Dlo_001658.1)完全一\n致，大小为1038bp，编码345个氨基酸，其分子量为38.65kDa，理论等电点为5.93。根据龙眼\nWRKY家族基因组的定位信息，命名为DlWRKY25。氨基酸序列分析表明，DlWRKY25含有1个\nWRKY结构域及C2CH型锌指结构(C‑X7‑C‑X23‑HXC)，属于WRKY家族中的Group III(图2)。\n[0050] 利用BLASTp对D1WRKY25的氨基酸序列进行同源性检索，然后利用MEGA 6.0软件构\n建系统进化树(图3)。结果表明，与单子叶植物的WRKY亲缘关系较远，比如玉米(Zea mays)\n的ZmWRKY70(ACG28802.1)。\n[0051] 2、DlWRKY25基因组织表达特性分析\n[0052] qRT‑PCR结果表明DlWRKY25基因在被检测的9种龙眼组织中都有表达，其中在茎中\n表达最高，在果皮和幼果次之(图4)。\n[0053] 3、DlWRKY25基因在花器官发育过程中的表达模式\n[0054] 利用qRT‑PCR技术，我们分析了DlWRKY25在′四季蜜′和′石硖′龙眼3个成花阶段的\n表达。结果表明，DlWRKY25在‘四季蜜’龙眼成花诱导早期呈下调表达，T1时期仅为T2时期的\n1/5。而在′石硖′龙眼成花诱导过程中DlWRKY25的表达水平未出现显著性差异表达(图5)。\n[0055] 4、DIWRKY25基因的亚细胞定位分析\n[0056] 为检测DlWRKY25蛋白在细胞中的定位，本发明构建了含有增强型绿色荧光蛋白\n(GFP)的融合蛋白表达载体(35S：D1WRKY25‑GFP)，转化烟草进行顺势表达，并用激光共聚焦\n显微镜进行观察。如图6所示，在480nm波长的激化下，35S：D1WRKY25‑GFP只在细胞核里观察\n到荧光信号，细胞质和细胞膜中均无GFP信号，而35S：GFP对照组则在整个细胞中都能观察\n到GFP信号，没有明确的定位。该结果表明，DlWRKY25蛋白定位于细胞核上。\n[0057] 5、转DIWRKY25基因的拟南芥表型分析\n[0058] 结果显示，过表达DlWRKY25基因的拟南芥植株相对于野生型都能表现出不同程度\n的早花表型，野生型植株26天左右开花，而转基因株系在16‑18天开花(图7)，说明DlWRKY25\n基因过量表达会显著促进植物开花。