一种操纵磁珠分离目标分子的方法

1.一种利用磁珠将目标分子从溶液中分离的方法，包括如下步骤：
（1）结合：将磁珠、含有目标分子的溶液和结合缓冲液置于容器中混合，将所述容器置于磁场的磁力范围中且使所述容器中的磁珠所受磁场力的方向和/或大小处于连续变化状态，以使所述容器中的所有物质相互间充分接触，磁珠与目标分子结合形成复合物；去除杂质，保留复合物在所述容器中；
（2）洗涤：向所述容器中加入洗涤缓冲液，使洗涤缓冲液与所述复合物混合，将所述容器置于磁场的磁力范围中且使所述容器中的磁珠所受磁场力的方向和/或大小处于连续变化状态，以使所述容器中的所有物质相互间充分接触；去除杂质，保留复合物在所述容器中；
（3）洗脱：向所述容器中加入洗脱缓冲液，使洗脱缓冲液与所述复合物混合，将所述容器置于磁场的磁力范围中且使所述容器中的磁珠所受磁场力的方向和/或大小处于连续变化状态，以使所述容器中的所有物质相互间充分接触；再将所述容器脱离磁场，孵育，以使所述磁珠与所述目标分子分离，收集目标分子；所述步骤（1）、（2）或（3）中，所述使磁珠所受磁场力的方向和/或大小处于连续变化状态的方法为
使所述容器与所述磁场相对运动，其中产生磁场的磁铁是永磁铁；
所述使所述容器与所述磁场相对运动的方法为所述容器在相对的两排磁铁之间做运动；所述容器为由若干个单独的管连接而成的排管，且所述排管呈一条直线；所述排管中各单独的管在同一时刻所受磁场力均一致；使所述排管中各单独的管在同一时刻所受磁场力均一致的方法为：每排磁铁均由若干个长方体状永磁铁依次连接而成，永磁铁连接方向呈直线且垂直于永磁铁自身的N极与S极连线方向，相邻的两个永磁铁的磁极方向相反；
两排磁铁之间相对的两个永磁铁边缘连线呈矩形或正方形，且相对的两个永磁铁的磁极相同；排管与两排磁铁均保持平行，每个长方体状永磁铁沿其自身N极与S极连线方向的切面的宽度等于每个单管沿磁铁的N极与S极连线方向的切面的最宽处的宽度；且排管在两排磁铁的非边缘效应区域运动，所述边缘效应是每排磁铁的两端产生的边缘效应；
所述1）、2）或3）中，所述运动为匀速圆周运动，是排管沿两排磁铁连线的水平面做匀速圆周运动；所述匀速圆周运动的速度为15rpm-30rpm；
所述目标分子为DNA、RNA、碳水化合物或蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述匀速圆周运动的速度为15rpm、19rpm 、23rpm或30rpm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述由若干个单独的管连接而成的排管为八连排离心管。

一种操纵磁珠分离目标分子的方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种操纵磁珠分离目标分子的方法。\n背景技术\n[0002] 大量的生物实验及临床诊断离不开样品制备，而生物分子的提取及纯化技术在样品制备中有着广泛应用。随着相关技术的发展，临床诊断及生物实验所处理的样品数量也越来越大。\n[0003] 磁珠操纵是样品制备常用的一种技术。目前磁珠混匀及分离技术，主要有两类：一类是通过磁棒和磁套的相对运动实现磁珠收集、释放、转移，进而完成生物分子的提取。这种方法所采用的机械结构相对复杂，存在实现自动化成本高的问题，并且磁套作为耗材，价格较高。同时，由于磁套与样品充分接触，存在污染样品的风险，且在磁珠转移过程中存在磁珠损耗的问题。此外，由于磁套的运动较为剧烈，无法保证提纯后生物分子的完整性。\n[0004] 另外一类是枪头抽吸方式，即用枪头吹吸混匀，磁铁吸附磁珠，以做磁珠分离。这种方法实现自动化的成本高，需要数个机器臂和泵，结构复杂。此外，还存在一次性处理样品数量受限于机械臂的问题。总之，需要提高效率和一次性处理样品数量等诸多因素，以满足低耗材、高效率的生物分子提取及纯化要求。\n发明内容\n[0005] 本发明的目的是提供一种操纵磁珠将目标分子从溶液中分离出来的方法，具体是一种使结合、洗涤和分离更充分，使得到的目标分子纯度和得率更高的磁珠分离方法。\n[0006] 本发明的利用磁珠将目标分子从溶液中分离的方法，包括如下步骤：\n[0007] (1)结合：将磁珠、含有目标分子的溶液和结合缓冲液置于容器中混合，将所述容器置于磁场的磁力范围中且使所述容器中的磁珠所受磁场力的方向和/或大小处于连续变化状态，以使所述容器中的所有物质相互间充分接触，磁珠与目标分子结合形成复合物；\n去除杂质，保留复合物在所述容器中；\n[0008] (2)洗涤：向所述容器中加入洗涤缓冲液，使洗涤缓冲液与所述复合物混合，将所述容器置于磁场的磁力范围中且使所述容器中的磁珠所受磁场力的方向和/或大小处于连续变化状态，以使所述容器中的所有物质相互间充分接触；去除杂质，保留复合物在所述容器中；\n[0009] (3)洗脱：向所述容器中加入洗脱缓冲液，使洗脱缓冲液与所述复合物混合，将所述容器置于磁场的磁力范围中且使所述容器中的磁珠所受磁场力的方向和/或大小处于连续变化状态，以使所述容器中的所有物质相互间充分接触；再将所述容器脱离磁场，孵育，以使所述磁珠与所述目标分子分离，收集目标分子。\n[0010] 上述过程中，所述步骤(1)、(2)或(3)中，所述使磁珠所受磁场力的方向和/或大小处于连续变化状态的方法具体可为如下I、II或III所示，但不排除其它的方法；\n[0011] I、使所述容器与所述磁场相对运动，其中产生磁场的磁铁是永磁铁；\n[0012] II、改变磁场力的大小和/或方向，其中产生磁场的磁铁是电磁铁；具体可以通过改变电磁铁的电流的大小，使磁力大小改变；改变电磁铁的电流方向，使N\S极改变。\n[0013] III、改变磁场力的大小和/或方向和使所述容器与所述磁场相对运动，其中产生磁场的磁铁是电磁铁。\n[0014] 上述过程中，所述使所述容器与所述磁场相对运动的方法具体可为如下1)、2)或\n3)所示：\n[0015] 1)所述容器在相对的两排磁铁之间做运动；\n[0016] 2)所述容器绕着所述磁铁运动；\n[0017] 3)所述磁铁绕着所述容器运动。\n[0018] 上述过程中，所述1)、2)或3)中，所述运动可为圆周运动、匀速运动或匀速圆周运动。\n[0019] 上述过程中，所述匀速圆周运动的速度为8rpm-75rpm，优选为12rpm-30rpm或\n15rpm-30rpm，具体为15rpm、19rpm、23rpm或30rpm。\n[0020] 如果运动速度太快会让磁珠还来不及在管内运动，又回到了原来的位置，不但不能让其在管内充分运动，还有可能会毁掉原来生物分子的完整性；如果运动速度太慢，效率又会很低并且不能让磁珠充分散开接触到液体。\n[0021] 上述过程中，所述容器在相对的两排磁铁之间做运动中，所述容器为由若干个单独的管连接而成的排管，且所述排管呈一条直线。\n[0022] 上述过程中，为了使各个管内的效果一致，最好保持所述排管中各单独的管在同一时刻所受磁场力均一致。\n[0023] 上述过程中，使所述排管中各单独的管在同一时刻所受磁场力均一致的方法具体可为如下，但不限于此方法：每排磁铁均由若干个长方体状永磁铁依次连接而成，永磁铁连接方向呈直线且垂直于永磁铁自身的N极与S极连线方向，相邻的两个永磁铁的磁极方向相反；两排磁铁之间相对的两个永磁铁边缘连线呈矩形或正方形，且相对的两个永磁铁的磁极相同；排管与两排磁铁均保持平行，每个长方体状永磁铁沿其自身N极与S极连线方向的切面的宽度等于每个单管沿磁铁的N极与S极连线方向的切面的最宽处的宽度；且排管在两排磁铁的非边缘效应区域运动，所述边缘效应是每排磁铁的两端产生的边缘效应。\n[0024] 上述过程中，所述单独的管为试管或离心管；所述由若干个单独的管连接而成的排管为八连排离心管。\n[0025] 上述过程中，所述目标分子为生物分子；或所述生物分子为DNA、RNA、碳水化合物或蛋白质。\n[0026] 本发明方法通过改变磁珠所受磁场力的大小和方向，使磁珠与目标分子更充分的结合或分离，最终获得目标分子。具体来说，可分别采取如下四种方式来改变磁珠所受磁场力的大小和方向：1)磁铁固定，而磁珠体系运动；2)磁珠体系固定，而磁铁运动；3)磁珠体系和磁铁都运动；4)采用电磁铁变换磁力大小和方向。\n[0027] 所述磁铁可以是电磁铁，也可以是永磁铁。\n[0028] 所述永磁铁主要是用来提供磁场，并通过调节与样品之间的距离和方向以控制磁珠的运动，从而改变磁珠体系所受的磁场力大小和方向。\n[0029] 所述电磁铁主要是通过调节自身电流大小和方向，并结合调节与样品之间的距离和方向，从而改变磁珠体系所受的磁场力大小和方向。\n[0030] 本发明方法中，使磁珠受磁场力的大小和方向改变的作用具体如下：\n[0031] 1、结合：使装有磁珠体系的容器相对于磁铁的距离和/或位置处于连续变化状态，使磁珠在变化的磁场力的作用下在体系中充分运动，进而使磁珠与生物分子充分混匀和接触，形成磁珠与生物分子的复合物。\n[0032] 2、洗涤：容器贴近磁铁一段时间，去除多余液体后，将洗涤液加入结合好的磁珠中，使装有磁珠体系的容器相对于磁铁的距离和/或位置处于连续变化状态，使磁珠在变化的磁场力的作用下在体系中充分运动，进而使复合物与洗涤液充分混匀和充分接触，从而使其得到充分洗涤。\n[0033] 3、洗脱：容器贴近磁铁一段时间，去除多余液体后，将洗脱液加入洗涤好的磁珠中，使装有磁珠体系的容器相对于磁铁的距离和/或位置处于连续变化状态，控制磁珠在洗脱液中运动，使磁珠在变化的磁场力的作用下在体系中充分运动，使复合物与洗脱液充分混匀和接触，从而利于洗脱，从而得到高浓度、高纯度的目标分子。\n[0034] 本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：\n[0035] 1)由于离心管采用较慢的运动速度，目标生物分子所受的剪切力较小，且不易产生气泡，保证提纯后的生物分子完整性。\n[0036] 2)操纵过程中无液体外溅现象，降低了交叉污染可能性。\n[0037] 3)混匀过程无其它实验耗材介入，在降低成本的同时减少了可能的污染。\n[0038] 4)可将多个样品至于磁场中进行混匀，提高了生物分子提取及纯化的通量。\n[0039] 5)仅需要调节磁铁与磁珠体系的相对位置，或变换电磁铁的磁力大小，运动相对简单，故易于实现自动化，且成本低。\n[0040] 6)不需要特殊容器，仅需要普通耗材，实用性非常强\n[0041] 7)整个过程不进行磁珠转移，降低了磁珠损耗。\n[0042] 实验证明，本发明方法的生物分子提取得率高于传统抽吸方式，并且多管间的一致性比传统抽吸方式好。因此，本发明方法在生物分子的样品制备领域将有广阔的应用前景。\n附图说明\n[0043] 图1为本发明实施例一的示意图。\n[0044] 图2为本发明实施例一的示意图。\n[0045] 图3为本发明实施例二的示意图。\n[0046] 图4为本发明实施例二的示意图。\n[0047] 图5为本发明实施例三的示意图。\n[0048] 图6为本发明实施例三的示意图。\n[0049] 图7为本发明实施例三的示意图。\n具体实施方式\n[0050] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。\n[0051] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。\n[0052] 附图中，各标记如下：1、磁珠体系；2、磁铁。\n[0053] 下述实施例中的缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱液TB、磁珠悬液B均为磁珠法基因组DNA提取试剂盒中产品。磁珠法基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为DP329。\n[0054] 实验中各步骤需要加入的溶液的种类及用量根据磁珠法基因组DNA提取试剂盒的说明书进行操作。\n[0055] 下述实施例1、2、3、4使用的PCR产物是相同的同一批PCR产物，实施例5使用的是另一批PCR产物。PCR产物中均含有与磁珠结合的DNA(即待分离的DNA)。\n[0056] 实施例1、利用磁珠将目标分子从溶液中分离的方法-容器绕着磁铁运动[0057] 一个离心管与一块磁铁为一组，磁铁固定，离心管围绕着磁铁做匀速圆周运动。磁铁为单块永磁铁，单块永磁铁为长方体状(图1和2)。离心管在运动过程中均处在磁铁产生的磁场的磁力范围内。\n[0058] 一、结合\n[0059] 1、制备体系：\n[0060] 1)向3组离心管的各管中加入40μL的PCR产物；\n[0061] 2)再向各管中加入10μL缓冲液GD；\n[0062] 3)向各管中加入110μL PW和20μL无水乙醇的混合液，涡旋混匀；\n[0063] 4)三组离心管中分别加入5μL、10μL或15μL磁珠悬液B；\n[0064] 2、结合操作\n[0065] 将单个离心管以15rpm的速度绕永磁铁做匀速圆周运动(如图1、2所示)，在此过程中磁珠与目标分子充分接触而形成复合物，运动2至3分钟后，靠近磁铁停下，停留30秒后复合物被磁铁吸附到容器的管壁上，用移液枪将液体移走，保留复合物；\n[0066] 二、洗涤\n[0067] 1、第一次洗涤\n[0068] 向步骤一得到的装有复合物的离心管中加入200μL缓冲液GD，将离心管以15rpm的速度绕永磁铁做匀速圆周运动，在此过程中磁珠与缓冲液GD充分接触，运动2至3分钟后，靠近磁铁停下，停留30秒后复合物被磁铁吸附到管壁上，用移液枪将液体移走，保留复合物；\n[0069] 2、第二次洗涤\n[0070] 向步骤1的离心管中加入200μL漂洗液PW，将离心管以15rpm的速度绕永磁铁做匀速圆周运动，运动2至3分钟后，靠近磁铁停下，停留30秒后复合物被磁铁吸附到耗材的管壁上，用移液枪将液体移走，保留复合物；室温晾干5分钟。\n[0071] 三、洗脱\n[0072] 向步骤二的离心管中加入50～100μL的洗脱液TB，将离心管以15rpm的速度绕永磁铁做匀速圆周运动，运动2至3分钟后，将离心管移开磁场(即离开磁场的磁力范围)，再将离心管置于56℃孵育10分钟。再将离心管靠近磁铁停下，停留30秒后，磁珠被磁铁吸附到管壁上，而目标分子存在分离缓冲液中(即为目标分子溶液)，将目标分子溶液转移至新管。\n[0073] 四、回收量的检测方法\n[0074] 方法：用分光光度计进行核酸浓度测试，测试前注意需要用Tip头将核酸混匀。\n[0075] 实施例2、利用磁珠将目标分子从溶液中分离的方法-磁铁绕着容器运动[0076] 方法与实施例1基本相同，不同的是在结合、洗涤和洗脱步骤中，离心管与永磁铁的相对运动方式不同，具体为：永磁铁以15rpm的速度绕离心管做匀速圆周运动(如图3、4所示)。具体为：一个离心管与一块磁铁为一组，离心管固定，磁铁围绕着离心管做匀速圆周运动。磁铁为单块永磁铁，单块永磁铁为长方体状(图3和4)。磁铁在运动过程中需保证离心管处在磁铁产生的磁力的范围内。\n[0077] 实施例3、利用磁珠将目标分子从溶液中分离的方法-容器在两排磁铁之间运动[0078] 方法与实施例1基本相同，不同的是在结合、洗涤和洗脱步骤中，离心管与永磁铁的相对运动方式不同，具体如下：\n[0079] 两排相对且平行的永磁铁和一排离心管为一组。一排离心管由8个单独的离心管呈一条直线连接而成的。两排相对的磁铁位置固定，八个离心管作为一个整体在两排磁铁之间以15rpm的速度做匀速圆周运动(图5、6、7)。匀速圆周运动可通过现有技术实现，如将八个离心管置于一个相应的转子中，转子由电机驱动进行匀速圆周运动，从而八个离心管也做匀速圆周运动，在整个运动过程中，八个离心管与转子的相对位置是不变的。一排离心管在运动过程中均处在两排磁铁产生的磁力范围内。\n[0080] 磁铁为永磁铁，单块磁铁为长方体状；每排磁铁是由同样大小的单块永磁铁依次紧挨着排列而成。\n[0081] 为了保证八个离心管中各管在同一时刻的受力一致性(即各管所受磁场力的大小和方向一致)，按照如下方式设置磁铁结构、且使八个离心管按照如下方式运动：\n[0082] 将单块磁铁依次紧挨着排列成一排，单块磁铁排列方向呈直线且垂直于单块磁铁自身的N极与S极连线方向，相邻的两个单块磁铁的磁极方向相反；两排磁铁之间相对的两个单块磁铁边缘连线呈矩形，且相对的两个单块磁铁的磁极相同；无论在排管的起始放置时刻还是在排管的运动过程中，均保持排管与两排磁铁相对平行；每个长方体状永磁铁沿其自身N极与S极连线方向的切面的宽度等于每个单管沿磁铁的N极与S极连线方向的切面的最宽处的宽度；还要使排管在两排磁铁间的非边缘效应区域运动(以避免两排磁铁的两端产生的边缘效应使管的受力不均)，所述边缘效应是指每排磁铁的两端产生的边缘效应。\n[0083] 如此设置的两排磁铁在非边缘效应区域内，沿着与磁铁平行的方向上各点的磁场强度虽然不完全相同(一般两块磁铁的相连处的磁场强度要强于磁铁的非连接处)，但由于每个管的纵切面的最宽处与磁铁的纵切面的宽度是相等的，所以无论排管运动到哪，其在同一时刻各管的受力情况是相同的。\n[0084] 避免上述边缘效应可通过现有技术实现，具体可如每排磁铁的单块磁铁数目远多于排管中各单管的数目，且使排管在每排磁铁的中间区域运动，而不接近每排磁铁的两端。\n[0085] 如此设置，就保证了八个离心管中各管在同一时刻所受的磁场力大小和方向均相同，从而保证了管间一致性。\n[0086] 另外，实验表明，当每排磁铁中各单块磁铁互相间隔一段距离时，各离心管中的磁珠的分散度明显不同，说明此种情况下各管在同一时刻所受磁场强度不一样，因此，管间一致性不如上述紧挨着放置好。\n[0087] 实验还表明，当每排磁铁中相邻的两个单块磁铁的磁极方向相同时，各离心管中的磁珠的分散度明显不同，说明此种情况下各管在同一时刻所受磁场强度不一样，因此，管间一致性不如上述相邻磁铁磁极方向相反放置好。\n[0088] 上述实施例中均设了3组实验，实际应用中可以根据需求有N(N≥1)组同样的反应，提高效率。\n[0089] 实施例4、对照(传统方式)\n[0090] 1、向3组离心管排管的各管中加入40μL的PCR产物(与实施例1-3中所述PCR产物相同，为同批)\n[0091] 2、再向各管中加入10μL缓冲液GD；\n[0092] 3、向各管中加入110μL PW和20μL无水乙醇的混合液，涡旋混匀；\n[0093] 4、三组离心管中分别加入5μL、10μL、15μL磁珠悬液B；\n[0094] 5、将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体；\n[0095] 6、将离心管从磁力架上取下来，加入200μL漂洗液GD，涡旋混匀。\n[0096] 7、将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体。\n[0097] 8、加入200μL漂洗液PW，涡旋混匀。\n[0098] 9、将离心管放置于磁力架上静置30秒，待磁珠完全吸附时小心去除液体，室温晾干5分钟。\n[0099] 10、加入50～100μL的洗脱液TB，按照步骤5的方式混匀，56℃孵育10分钟。\n[0100] 11、将离心管贴近磁铁30秒，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至新管，并进行测量。\n[0101] 结果如表1所示。\n[0102] 表1、产物回收结果\n[0103] \n[0104] 从表中可以看出，无论加入磁珠的量是多少，本发明方法的得率均高于传统抽吸方法的得率，并且管间一致性比传统抽吸方式好。\n[0105] 实施例5、不同运动速度\n[0106] 方法：与实施例3中所述相同；不同的是匀速圆周运动的速度为23rpm和30rpm。\n[0107] 结果：如表2所示。\n[0108] 表2、产物回收结果\n[0109]