木质纤维原料蒸汽爆破、定向酶解分离和乙醇发酵的方法

1.一种木质纤维原料蒸汽爆破、定向酶解分离和乙醇发酵的方法，其特征是采用备料、蒸汽爆破、木聚糖定向酶解、固液分离、纤维素深度酶解、木糖兼气乙醇发酵和葡萄糖厌氧乙醇发酵的方法，其具体步骤如下：
a.将秸秆或草类原料切割成3～5cm片段进行蒸汽爆破，装料系数65～75％，温度
195～205℃，保温时间60～180秒；
b.第一轮木聚糖定向酶解：中和浆料的pH值为4.5～5.2，调节总固形物浓度为3.0～
5.0％(w/v)，加入木聚糖酶10～20U/g浆料、纤维素酶1.0～2.0FPU/g浆料和β-葡萄糖苷酶5～10U/g浆料，反应温度48～50℃，搅拌速率120～150rpm，反应48～50h，固液分离得到酶解液I和酶解渣I；
c.第二轮纤维素深度酶解：调节酶解渣I的总固形物浓度至10～15％(w/v)，pH4.5～
5.2，加入纤维素酶15～20FPU/g纤维素和β-葡萄糖苷酶30～40IU/g纤维素，控制反应温度48～50℃，搅拌速率100～150rpm，反应48～50h，固液分离得到酶解液II和酶解渣II；
d.浓缩酶解液I至木糖浓度≥30.0g/L，接入活化后的休哈塔假丝酵母至细胞浓度OD600nm≥15.0，在兼气条件下发酵12～14h，回用酵母；
e.浓缩酶解液II至葡萄糖浓度≥150.0g/L，接入活化后的酿酒酵母至细胞浓度OD600nm≥15.0，在厌氧条件下发酵16～18h，回用酵母。

木质纤维原料蒸汽爆破、定向酶解分离和乙醇发酵的方法\n一、技术领域\n[0001] 本发明属于生物化学中的生物质原料酶解和生物转化技术领域，特别涉及木质纤维原料经蒸汽爆破预处理、木聚糖定向酶解、木糖发酵和葡萄糖发酵制取燃料乙醇的方法。\n二、背景技术\n[0002] 木质纤维原料中的纤维素和木聚糖可通过生物酶解生成葡萄糖和木糖，再经微生物发酵就能够生产出众多的生物基平台化合物，如燃料乙醇、有机酸和多元醇等。在众多的木质纤维原料中，农林废弃物秸秆和草类中富含葡萄糖基和木糖基，且产量巨大、价格低廉，是当前生物质原料开发的重点。\n[0003] 在秸秆和草类天然原料中，纤维素、木聚糖和木质素通过复杂的化学和物理粘结作用形成紧密的复合体，形成了酶解利用的障碍，必须采取一定的预处理工艺破坏其天然结构，充分地暴露纤维素与木聚糖大分子，降低它们的聚合度，进而提高酶解效率。目前，蒸汽爆破法是木质纤维原料的主流预处理技术之一，尤其适合于秸秆和草类原料。\n[0004] 在木质纤维原料经过蒸汽爆破预处理和直接酶解得到的糖液中，葡萄糖和木糖分别占总糖物质60％以上和35％。葡萄糖乙醇发酵的菌株——酿酒酵母及生产工艺十分成熟，与之相比，木糖发酵的菌种稀少，目前仅有休哈塔假丝酵母和毕赤树干酵母等少数几个菌株，而且它们的工业生产性能远不及酿酒酵母。这些用于木糖发酵的菌株，在发酵过程中对糖和发酵产物，如乙醇的耐受能力较低，木糖的利用受到葡萄糖的抑制，在木糖发酵的过程中还需要控制精确的限制性供氧措施。由于这两类糖的发酵菌株和发酵工艺条件不同，严重地制约了木质纤维原料酶解液己糖、戊糖同步发酵技术的工业化放大，存在着如发酵设备的制造和运行成本高、风耗大、工艺控制复杂、产率低等诸多不足，形成了工业化生产的瓶颈。\n三、发明内容\n[0005] 本发明的目的是针对木质纤维原料的组成和结构特点，根据蒸汽爆破和木聚糖酶解的技术原理，提供一种低化学品消耗和环境亲和的木质纤维原料蒸汽爆破、定向酶解分离和发酵木糖的方法，尤其是适用于木糖和葡萄糖的乙醇发酵。\n[0006] 在木质纤维原料中，葡萄糖基作为主要的糖组分约占总糖物质的60％以上，而木糖一般在35％左右。如果能将葡萄糖基和木糖基分离后再进行单独发酵，就可以大幅度地减少耗气量，显著降低木糖发酵的负荷，成倍提高葡萄糖乙醇发酵的浓度，进而提升设备的整体利用效率，降低生产成本，是缓解木质纤维原料酶解液己糖、戊糖同步发酵技术生产瓶颈的有效措施。\n[0007] 木质纤维原料中木糖基和葡萄糖基的分离，可采用碱抽提或稀酸水解木聚糖的方法，而采用蒸汽爆破结合木聚糖酶定向酶解的方法是一种基于酶工程的现代生物加工技术，可大大减少对酸、碱化学品的消耗，并且能够显著提高发酵工序的经济效益，具有工艺简单和环境亲和的优势。\n[0008] 本发明的具体技术解决方案如下：\n[0009] 一种木质纤维原料蒸汽爆破、定向酶解分离和乙醇发酵的方法，其特征是采用备料、蒸汽爆破、木聚糖定向酶解、固液分离、纤维素深度酶解、木糖兼气乙醇发酵和葡萄糖厌氧乙醇发酵的方法，其具体步骤如下：\n[0010] a.将秸秆或草类原料切割成3～5cm片段进行蒸汽爆破，装料系数65～75％，温度195～205℃，保温时间60～180秒；\n[0011] b.第一轮木聚糖定向酶解：中和浆料的pH值为4.5～5.2，调节总固形物浓度为3.0～5.0％(w/v)，加入木聚糖酶10～20U/g浆料、纤维素酶1.0～2.0FPU/g浆料和β-葡萄糖苷酶5～10U/g浆料，反应温度48～50℃，搅拌速率120～150rpm，反应48～\n50h，固液分离得到酶解液I和酶解渣I；\n[0012] c.第二轮纤维素深度酶解：调节酶解渣I的总固形物浓度至10～15％(w/v)，pH4.5～5.2，加入纤维素酶15～20FPU/g纤维素和β-葡萄糖苷酶30～40IU/g纤维素，控制反应温度48～50℃，搅拌速率100～150rpm，反应48～50h，固液分离得到酶解液II和酶解渣II；\n[0013] d.浓缩酶解液I至木糖浓度≥30.0g/L，加入休哈塔假丝酵母在兼气条件下发酵\n12～14h，回用酵母；\n[0014] e.浓缩酶解液II至葡萄糖浓度≥150.0g/L，加入酿酒酵母在厌氧条件下发酵发酵16～18h，回用酵母。\n四、附图说明\n[0015] 图1为木质纤维原料蒸汽爆破、定向酶解分离和乙醇发酵的流程简图；\n[0016] 图2为秸秆原料经蒸汽爆破预处理前后，采用不同方式酶解的总糖物质得率效果比较。酶解的条件为：原料的总固形浓度3.0～5.0％(w/v)，pH4.8～5.2。总酶用量：木聚糖酶40～80U/g木糖基、纤维素酶15～20FPU/g葡萄糖基和β-葡萄糖苷酶30～40U/g葡萄糖基。反应温度48～52℃，搅拌速率100～150rpm，反应48～50h。其中：\n[0017] 柱状图1表示未经蒸汽爆破的秸秆粉(0.2mm～0.5mm)直接添加木聚糖酶、葡萄糖酶和纤维素酶进行一步法酶解的结果；\n[0018] 柱状图2表示蒸汽爆破秸秆添加木聚糖酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶进行一步法酶解的结果；\n[0019] 柱状图3表示蒸汽爆破秸秆加入木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和少量纤维素酶进行两步法酶解的第一轮定向酶解的结果；\n[0020] 柱状图4表示3的酶解渣再加入纤维素酶和β-葡萄糖苷酶进行两步法酶解的第二轮深度酶解的结果；\n[0021] 柱状图(3+4)表示3和4两步法酶解的累计结果。\n[0022] 图3为酶的组合方式对蒸汽爆破秸秆定向酶解效果的影响。酶解条件为：原料总固形浓度为3.0～5.0％(w/v)，pH4.8～5.2，反应温度48～50℃，搅拌速率100～150rpm，反应48～50h。总酶用量为：木聚糖酶10～20U/g浆料、纤维素酶5～20FPU/g浆料和β-葡萄糖苷酶10～40U/g浆料。其中，横座标表示酶的组合方式，X为木聚糖酶；BG为β-葡萄糖苷酶；C为纤维素酶。\n[0023] 图4为纤维素酶的添加量对木聚糖酶定向酶解效果的影响。酶解条件为：原料总固形浓度为3.0～5.0％(w/v)，pH4.8～5.2，反应温度48～50℃，搅拌速率100～150rpm，反应48～50h。木聚糖酶10～20U/g浆料和β-葡萄糖苷酶5～10U/g浆料。其中，横座标表示纤维素酶的添加量(FPU/g浆料)。\n[0024] 图5为蒸汽爆破秸秆的固形物浓度对木聚糖定向酶解的影响规律。酶解条件为：\npH4.8～5.2，反应温度48～50℃，搅拌速率100～150rpm，反应48～50h。加入木聚糖酶\n10～20U/g浆料、纤维素酶1.0～2.0FPU/g浆料和β-β-葡萄糖苷酶5～10U/g浆料。\n横座标表示蒸汽爆破秸秆的总固形物浓度(％，w/v)。\n五、具体实施方式\n[0025] 将秸秆和草类原料风干后采用旋切装置切断成3～5cm长度储存备用。\n[0026] 在间歇式全自动蒸汽爆破装置中加入切断后的秸秆或草类原料，采用自然堆积法装填以保证蒸汽加热的均匀性，控制体积装填系数为65～75％。密封后通入蒸汽直接加热物料至温度为195～205℃，采用蒸汽保温60～180秒后，通过自控系统快速开启自动喷放阀进行爆破排放得到浆料。浆料干重得率达到原料的80％以上，其中葡萄糖基的收率高于\n85％以上，占浆料干重43.0～45.0％，木糖基的收率达到60％以上，占浆料干重的12.0～\n15.0％。\n[0027] 采用Ca(OH)2或氨水中和浆料至pH 4.5～5.2，调节总固形物浓度至3.0～5.0％(w/v)，加入木聚糖酶10～20U/g浆料、纤维素酶1.0～2.0FPU/g浆料和β-葡萄糖苷酶\n5～10U/g浆料，控制反应温度为48～50℃，搅拌转速为100～150rpm进行第一轮木聚糖定向酶解。反应48～50h后，采用离心法(5000rpm离心15min)或袋滤法分离酶解体系后得到酶解液I和酶解残渣I。在酶解液I中，木糖的收率占浆料中木糖基的65.0％以上，葡萄糖的收率占浆料中葡萄糖基的25.0％以下。\n[0028] 在酶解残渣I中加入适量的水，调节总固形物浓度至10～15(w/v)和pH4.5～\n5.2，再加入纤维素酶15～20FPIU/g纤维素和β-葡萄糖苷酶30～40IU/g纤维素，控制反应温度48～50℃，搅拌速率100～150rpm进行第二轮深度酶解。反应48～60h后，采用离心法(5000rpm离心15min)或袋滤分离可酶解体系得到酶解液II和酶解残渣II。在酶解液II中，葡萄糖的收率约占浆料中葡萄糖基的50.0％。\n[0029] 采用真空减压法浓缩酶解液I至木糖浓度≥30.0g/L，接入活化后的休哈塔假丝酵母至细胞浓度OD600nm≥15.0，在兼气条件下发酵12～14h，采用离心法在3000rpm的条件下离心5～10min以回用酵母再发酵。糖利用率≥90.0％，乙醇得率达到理论得率的\n85.0％以上。\n[0030] 采用真空减压法浓缩酶解液II至葡萄糖浓度≥150.0g/L，接入活化后的酿酒酵母至细胞浓度OD600nm≥15.0，在厌氧条件下发酵16～18h，采用离心法在3000rpm的条件下离心5～10min以回用酵母再发酵。糖利用率≥95.0％，乙醇得率达到理论得率的\n92.0％以上。\n[0031] 由附图2可知，采用蒸汽爆破预处理方法可以显著地提高秸秆中木聚糖和纤维素的酶解收率。在相同的木聚糖酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶用量下，采用一步酶解法，未处理的秸秆的木聚糖和纤维素的酶解收率仅为14.2％和24.1％，而蒸汽爆破后它们的酶解收率可分别达到80.6％和67.8％，因此蒸汽爆破预处理对于木质纤维原料中木聚糖和纤维素酶解的促进作用十分显著。在木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的基础上添加少量的纤维素酶可以提高木聚糖定向酶解的收率。在第一轮定向酶解过程中，木糖基的酶解收率最高可达到66.5.％，而葡萄糖基的酶解收率仅为24.8％；在第二轮深度酶解过程中，葡萄糖基的酶解收率达到50.5％，葡萄糖基两轮酶解的总收率达到75.3％，较一步法的67.8％提高近11.1％。这说明，一是纤维素酶和木聚糖酶对木聚糖和纤维素的酶解可以产生相互促进的作用，二是采用两轮酶解工艺，不仅可以通过定向酶解选择性地分离出大部分的木糖基，也有利于后续纤维素的深度酶解，提高了葡萄糖的酶解收率。\n[0032] 由附图3可知，单独使用木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶不能有效地酶解木聚糖，添加纤维素酶可以显著提高木糖基的酶解收率。\n[0033] 由附图4可知，在木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的基础上再添加少量的纤维素酶可以显著地提高蒸汽爆破秸秆中木糖基的酶解收率。当纤维素酶的添加量在2.0U/g浆料时，可将木糖基的酶解收率由49.5％提高至66.5％，提高幅度达到34.％，同时葡萄糖基的酶解收率可控制在24.5％以内。超过该添加量对木糖基酶解收率的促进作用较小，但却会导致葡萄糖基酶解收率的迅速上升，影响定向酶解的效果。因此，适宜的纤维素添加量为\n1.0～2.0U/g浆料。\n[0034] 由附图5可知，当总固形物浓度高于5.0～6.0％(w/v)时，蒸汽爆破秸秆中木糖基的酶解收率呈明显下降的趋势，从技术经济的角度考虑蒸汽爆破-定向酶解分离木糖的酶解总固形物浓度取3.0～5.0％(w/v)为宜。\n[0035] 所述的木质纤维原料中的葡萄糖基(纤维素)和木糖基(木聚糖)的分析测定及酶解收率的计算方法均采用美国能源部国家可再生能源实验室的标准方法(A.SLUITER，B.HAMES，R.RUIZ，C.SCARLATA，J.SLUITER，D.TEMPLETON，and D.CROCKER.Laboratory Technical Report NREL/TP-510-42618，2008)。\n[0036] 所述木聚糖酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的酶活力测定方法采用国际纯化学与应用化学联合会的测定方法(GHOSE，T.K.and BISARIA V.S.，(1987)Pure &Appl.Chem.，\n59(12)，1739-1752；GHOSE，T.K.and BISARIA V.S.，(1987)Pure &Appl.Chem.，59(2)，\n257-268)；\n[0037] 所述酶解液中的葡萄糖、木糖和乙醇的测定均采用高效液相色谱(HPLC)分析，色谱仪的系统和操作条件为：Agilent 1200色谱仪及工作站，糖柱Bio-RadAminex HPX-87H，柱温55℃，流动相为0.5mmol/L H2SO4，流速0.6mL/min，检测器为差示折光检测器(RID)。\n[0038] 有益效果：由于采用了蒸汽爆破和二次酶解的技术工艺，尤其是在木聚糖酶中引入了β-葡萄糖苷酶和少量的纤维素酶，显著地提高了木质纤维原料中木糖定向酶解和分离的效果，使原料中木糖基与葡萄糖基的酶解收率的比例超过65％和25％，同时促进了纤维素的酶解，使葡萄糖基的酶解总收率提高10％以上，为木质纤维原料中木糖和葡萄糖的有效分离及高效乙醇发酵提供了一种低化学品消耗和环境亲和的技术方法，可以显著地节约纤维素乙醇发酵的生产成本。