一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用

1.一种重组枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法，其特征是：
培养基组成：种子培养基g/L：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；发酵罐发酵培养基g/L：葡萄糖40，酵母粉10，二水合柠檬酸三钠0.11，(NH4)2HPO4 6,KH2PO4 5，MgSO4·7H2O 1.5，ZnSO4·7H2O 0.03，MnCl2·4H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.02；发酵罐补料培养基g/L：葡萄糖
600，酵母粉10，(NH4)2HPO4 6，KH2PO4 5；
发酵罐培养条件：5L发酵罐装液量2L,转速600rpm，用30％v/v NH4OH和1M H2SO4控制pH为6.8，温度40℃，采取葡萄糖浓度限制补料策略使发酵液葡萄糖浓度保持在10-15g/L；
其中所述的重组枯草芽孢杆菌的制备方法如下：
(1)构建重组质粒pMA5-sat：以合成的sat全基因片段DNA为模板，根据sat基因的特异性设计引物，P1：5’-ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC-3’BamHI；P2：5’-
GGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC-3’MluI；扩增条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，30s，35个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环；PCR扩增体系：合成的sat全基因片段DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix4μL，10×Ex Taq Buffer5μL，灭菌的双蒸水38μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL，扩增sat基因，大小为525bp；将基因sat连接表达载体pMA5，得到重组质粒pMA5-sat；
(2)重组质粒pMA5-sat-zwf的构建：以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，根据NCBI中提供的Bacillus subtilis 168的zwf基因序列，用Primer 5.0软件设计引物P3：AGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC、P4：ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA，并在其上下游引入酶切位点BamH I和Mlu I；以Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，克隆出基因片段；PCR产物经胶回收后得到zwf基因片段和pMA5通过BamH I与Mlu I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-zwf；再设计引物P5：AGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC、P6：
ACCGGGTACCTTATATGTTCCACCAGTG，并在其上下游引入酶切位点EcoR V和Kpn I；以质粒pMA5-zwf为模板克隆出带启动子HpaII的基因片段HpaII-zwf；基因片段HpaII-zwf和步骤(1)所述载体pMA5-sat通过EcoR V与Kpn I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-sat-zwf；
(3)重组枯草芽孢杆菌重组菌的获得：步骤(2)获得的所述载体用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证正确，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf。

一种新型抗性质粒的构建及其在核黄素生产菌中的运用\n技术领域\n[0001] 构建重组质粒pMA5-sat表达NTC抗性基因和运用抗性质粒表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf提高核黄素产量属于基因工程领域。\n背景技术\n[0002] 诺瓦丝菌素Norseothricin(NTC)是一种链丝菌素Streptothricin类抗生素，能够抑制蛋白质的合成和正确编码。NTC被广泛运用于细菌、真菌、酵母、植物细胞等的抗性筛选，是一种对阳性筛选子没有副作用的一种抗生素。并且，NTC易溶于水，并且在4℃水溶液中可稳定保存2年。实验证实，由基因sat编码的链丝菌素乙酰基转移酶，能够乙酰化NTC的β-赖氨酸的β-氨基，使NTC失活。\n[0003] 实验室前期选育了一株核黄素高产菌Bacillus subtilis RF1，多次实验证明该菌株对于氨苄霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素等都有抗性，所以对于该菌株的抗性筛造成了困难。但是，通过实验证明该菌株不能够在浓度为20mg/L的NTC抗性培养基中生长。于是，我们考虑构建一种新型的抗性筛选质粒。而质粒pMA5作为一种稳定的穿梭质粒，被广泛运用于枯草芽孢杆菌的表达系统中。所以，我们尝试将抗性基因sat整合到质粒pMA5上构建出一种能够抗NTC抗生素的新型的抗性质粒。\n[0004] 核黄素是一种维生素，又称维生素B2，是人和动物体必需的维生素之一，为黄素酶类辅酶的组成部分，在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，参与机体组织呼吸链电子传递及氧化还原反应，在呼吸和生物氧化中起着重要作用，是生命活动中不可缺少的维生素。其中，在枯草芽孢杆菌中，核黄素的合成以GTP和核酮糖-5-磷酸(P5P)为前体物经过7步酶催化反应得到，并且整个过程可以总结为下列反应方程式：3P5P+Gly+14ATP+2NADPH+2C1→riboflavin+3NADH+2formate。所以核黄素的过量合成存在两个假说的瓶颈：一是前体物GTP和核酮糖-5-磷酸的有限供应；二是催化合成过程的酶的有限供应和活性。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是葡萄糖进入磷酸戊糖途的一个关键酶，课题组对前期选育的原始菌Bacillus subtilis RF1的磷酸戊糖途径的关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶进行加强表达以提高磷酸戊糖通量，一方面获得更高水平的前体物核酮糖-5-磷酸的积累，另一方面也提高了核黄素合成所需NADPH的剂量。从而提高核黄素的产量。\n发明内容\n[0005] 本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了链丝菌素因乙酰基转移酶基因sat，构建重组抗性表达载体pMA5-sat，并将其转化Bacillus subtilis RF1，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat，并且重组菌能够在NTC抗性平板上稳定地生长。实验结果表明，重组质粒能够在宿主菌中正常表达抗性基因sat，使NTC抗生素失活，从而构建出一种新型的NTC抗生素抗性质粒。\n[0006] 首次运用抗性质粒pMA5-sat在核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1加强表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf,并成功提高了核黄素产量，说明重组质粒pMA5-sat能够有效的用于枯草芽孢杆菌的改造。\n[0007] 本发明的技术方案：\n[0008] (1)抗性质粒pMA5-sat的构建：\n[0009] 以上海生工公司合成的sat全基因片段DNA为模板，根据sat基因的特异性设计引物，P1：5’-ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC-3’(BamHI)；P2：5’-\nGGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC-3’(MluI)；扩增条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，30s，35个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，\n10min，一个循环。PCR扩增体系：合成的sat全基因片段DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水38μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL，扩增sat基因，大小为525bp。将基因sat连接表达载体pMA5，得到重组质粒pMA5-sat，通过转化大肠杆菌感受态转入大肠杆菌E.coli JM109中，在含氨苄霉素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，并送样至生工测序正确，得到重组菌E.coli JM109/pMA5-sat；\n[0010] (2)抗性质粒pMA5-sat转化Bacillus subtilis RF1：\n[0011] 从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat，用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证正确，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat。\n[0012] (3)表达载体的构建pMA5-sat-zwf：\n[0013] 以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，根据NCBI中提供的Bacillus  subtilis  168的zwf基因序列，用Primer  5.0软件设计引物P3：\nAGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC、P4：ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA,并在其上下游引入酶切位点BamH I和Mlu I。以Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，克隆出基因片段。PCR产物经胶回收后得到zwf基因片段，连接克隆载体pMD-18T，转化E.coli JM109，阳性转化子经酶切验证后，由上海生工生物有限公司测序，并将重组质粒命名为T-zwf。载体T-zwf和pMA5通过BamH I与MluI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-zwf。再设计引物P5：\nAGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC、P6：ACCGGGTACCTTATATGTTCCACCAGTG，并在其上下游引入酶切位点EcoR V和Kpn I。以质粒pMA5-zwf为模板克隆出带启动子HpaII的基因片段HpaII-zwf。基因片段HpaII-zwf和载体pMA5-sat通过EcoR V与Kpn I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-sat-zwf。\n[0014] (4)表达载体pMA5-sat-zwf转化Bacillus subtilis RF1：\n[0015] 从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat-zwf中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat-zwf，用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证正确，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf。\n[0016] 用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法：\n[0017] 出发菌株：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1和Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf；\n[0018] 培养基组成：种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。发酵罐发酵培养基(g/L):葡萄糖40，酵母粉10，二水合柠檬酸三钠0.11，(NH4)2HPO46,KH2PO45,MgSO4·7H2O \n1.5,ZnSO4·7H2O 0.03,MnCl2·4H2O 0.05,FeSO4·7H2O 0.02。发酵罐补料培养基(g/L)：葡萄糖600，酵母粉10，(NH4)2HPO46，KH2PO45。\n[0019] 发酵罐培养条件：5L发酵罐装液量2L,转速600rpm，用30％(v/v)NH4OH和1M H2SO4控制pH为6.8，温度40℃,采取葡萄糖浓度限制补料策略使发酵液葡萄糖浓度保持在10-\n15g/L。用生物传感分析仪(SBA-40C山东，中国)测定发酵液中残余葡萄糖的含量。\n[0020] 本发明的有益效果：构建出一种新型的抗性质粒，可用于宿主菌的抗性筛选，为宿主菌表达外源基因提供了条件。运用抗性质粒在核黄素生产菌Bacillus subtilis RF1中加强表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，有效地增强了细胞内磷酸戊糖途径的通量，为核黄素的合成提供了充足的前体物和辅酶NADPH供应。对重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf进行发酵分析，多次发酵罐结果表明重组菌发酵60h核黄素产量达到12.01g/L，比原始菌的9.22g/L提高了30.3％。\n具体实施方式\n[0021] 实施例1：抗性质粒pMA5-sat的构建：\n[0022] 以上海生工公司合成的sat全基因片段DNA为模板，根据sat基因的特异性设计引物，P1：5’-ACCGGGATCCATGAAAATTTCGGTGATC-3’(BamHI)；P2：5’-\nGGCACGCGTTTAGGCGTCATCCTGTGCTCC-3’(MluI)；扩增条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，58℃退火，1min，72℃延伸，30s，35个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，\n10min，一个循环。PCR扩增体系：合成的sat全基因片段DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水38μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL，扩增sat基因，大小为525bp。将基因sat连接表达载体pMA5，得到重组质粒pMA5-sat，通过转化大肠杆菌感受态转入大肠杆菌E.coli JM109中，在含氨苄霉素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，并送样至生工测序正确，得到重组菌E.coli JM109/pMA5-sat；\n[0023] 实施例2：抗性质粒pMA5-sat转化Bacillus subtilis RF1：\n[0024] 从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat，用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证正确，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat。\n[0025] 实施例3：表达载体的构建pMA5-sat-zwf：\n[0026] 以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，根据NCBI中提供的Bacillus  subtilis  168的zwf基因序列，用Primer  5.0软件设计引物P3：\nAGGCGGATCCGTGAAAACAAACCAACAACC、P4：ACCGACGCGTTTATATGTTCCACCAGTGTA,并在其上下游引入酶切位点BamH I和Mlu I。以Bacillus subtilis RF1基因组DNA为模板，克隆出基因片段。PCR产物经胶回收后得到zwf基因片段，连接克隆载体pMD-18T，转化E.coli JM109，阳性转化子经酶切验证后，由上海生工生物有限公司测序，并将重组质粒命名为T-zwf。载体T-zwf和pMA5通过BamH I与Mlu I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-zwf。再设计引物P5：\nAGGCGATATCGTAAGCTAGACAAAAC、P6：ACCGGGTACCTTATATGTTCCACCAGTG，并在其上下游引入酶切位点EcoR V和Kpn I。以质粒pMA5-zwf为模板克隆出带启动子HpaII的基因片段HpaII-zwf。基因片段HpaII-zwf和载体pMA5-sat通过EcoR V与Kpn I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E.coli JM109，通过酶切验证，最终得到表达载体pMA5-sat-zwf。\n[0027] 实施例4：表达载体pMA5-sat-zwf转化Bacillus subtilis RF1：\n[0028] 从重组菌E.coli JM109/pMA5-sat-zwf中提取构建正确的重组质粒pMA5-sat-zwf，用改进的Spizizen法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒转化感受态枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis RF1，在含NTC抗生素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证正确，得到重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf。\n[0029] 实施例5：用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素\n[0030] 发酵条件如上本发明技术方案所述。对重组菌Bacillus subtilis RF1/pMA5-sat-zwf进行发酵分析，多次发酵罐结果表明重组菌发酵60h核黄素产量达到12.01g/L，比原始菌的9.22g/L提高了30.3％。