一种液体复合微生物肥料的制备方法

1.一种液体复合微生物肥料的制备方法，步骤如下：(1)以啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)为菌株，分别接种三角烧瓶制备二级液体菌种；(2)按重量份将土豆1-10份、红糖1-10份、葡萄糖1-5份、蛋白胨0.1-2份、硫酸镁0.01-0.2份、硫酸锰0.01-0.2份、磷酸氢二钾0.01-1份、氯化钠0.1-2份混合，加洁净的水69.6-96.8份溶解，热处理方法进行灭菌，作为培养基；(3)在上述培养基中先接种啤酒酵母的二级液体菌种，28-32℃培养16～24小时，然后再接种植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的二级液体菌种的1∶1体积比混合液，在34-37℃继续培养24～30小时，pH值降至3.5-4.5即可；接种总量为0.5-4重量份；(4)将步骤(3)的产物无菌分装，制得液体复合微生物肥料。
2.如权利要求1所述的液体复合微生物肥料的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的热处理是在115-126℃的温度下进行的，灭菌时间为25-120分钟。
3.如权利要求1所述的液体复合微生物肥料的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的土豆为洗净去皮切成丁的土豆碎块。
4.如权利要求1所述的液体复合微生物肥料的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的菌种组合重量比为，啤酒酵母∶植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌＝0.5～1∶1∶1。

一种液体复合微生物肥料的制备方法\n(一)技术领域本发明涉及一种液体复合微生物肥料的制备方法，属于农业生物技术领域。\n(二)背景技术在保障农业增产的诸多措施中，施用化学肥料具有举足轻重和不可替代的重要作用。化学肥料的大量使用提高了作物的产量，也造成土壤中硝酸盐、亚硝酸盐的大量积累，农产品中有害化学物质残留量增加，使农产品质量下降，安全性降低。同时，土壤中积累的硝酸盐、亚硝酸盐的流失，污染了水源，对生态环境造成极大的破坏。我国目前单位面积化肥用量已处于世界前列，并仍有增长的趋势。因此，寻求使用高效微生物肥料，提高化肥利用效率，减少化肥使用量，促进无公害农产品生产，是当今我国农业生产的迫切需求。\n农作物病虫害是影响产量的重要因素，我国每年由病虫害造成的经济损失达15％-20％。因此，有效控制病虫害非常重要。长期以来，化学农药是我国农业防治病虫害的主要手段。但化学农药的过量施用甚至是滥用，在防治农作物病虫害的同时，各种病虫的抗(耐)药性大大增强，从而形成了恶性循环，不但污染了环境，农药的残留还严重影响了农产品的安全性。因此，寻求新的病虫害生物防治措施，高效防治各种植物病虫害，减少使用化学农药，降低农产品中农药的残留，是农业生产中目前急需解决的又一难题。\n(三)发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种液体复合微生物肥料的制备方法。\n本发明的液体复合微生物肥料的制备是利用土豆、红糖、葡萄糖等原料，微生物菌种选自啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae，菌种编号CGMCC2.610；植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，菌种编号CGMCC1.103；嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，菌种编号CGMCC 1.1854三种益生菌组合。通过微生物发酵来制备液体复合微生物肥料。上述3种益生菌菌株均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。本产品的活性成分即为上述3种益生菌组合。\n本发明的液体复合微生物肥料的制备方法，步骤如下：(1)以啤酒酵母、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌为菌株，分别接种三角烧瓶制备二级液体菌种。\n(2)按重量份将土豆1-10份、红糖1-10份、葡萄糖1-5份、蛋白胨0.1-2份、硫酸镁0.01-0.2份、硫酸锰0.01-0.2份、磷酸氢二钾0.01-1份、氯化钠0.1-2份混合，加洁净的水69.6-96.8份溶解，热处理方法进行灭菌，作为培养基。\n(3)在上述培养基中先接种啤酒酵母的二级液体菌种，28-32℃培养16～24小时，然后再接种植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的二级液体菌种的1∶1混合液，在34-37℃继续培养24～30小时，pH值降至3.5-4.5即可；接种总量为0.5-4重量份。\n(4)将步骤(3)的产物无菌分装，制得液体复合微生物肥料。\n优选的，步骤(2)所述的热处理是在115-126℃的温度下进行的，灭菌时间为25-120分钟。\n优选的，步骤(2)所述的土豆是洗净去皮切成丁的土豆碎块。更为优选的是≤1×1×1cm的土豆丁。\n优选的，步骤(3)所述的菌种组合重量比，啤酒酵母∶植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌＝(0.5～1)∶1∶1。\n上述步骤(1)所述的啤酒酵母、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的二级液体菌种的制备按现有技术即可。本发明实施例中给出了其中的一种可选用的具体方法。\n本发明方法制备的液体复合微生物肥料为酸性棕色液体，活菌含量10亿/mL左右。适用于稀释后喷洒于植物茎叶表面或稀释后浇施于植株根部土壤。\n本发明首次以啤酒酵母及植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌为菌株，利用土豆、红糖、葡萄糖、蛋白胨等原料，通过分批混合接种发酵，在无菌条件下进行分装，制备复合微生物肥料，所生产的复合微生物肥料益生菌含量高，可作为土壤微生物改良剂，也可喷洒于植株表面。该菌剂能够促进植物生长，提高肥料利用率，增强植株的抗逆性和抗病能力，效果优良。\n(四)具体实施方式实施例1：啤酒酵母的二级液体菌种的制备，具体操作步骤如下：A.斜面菌种(固体)将土豆去皮洗净，切成小碎块，放在96.5份水中，土豆∶水＝1∶(3～5)重量比，煮沸30分钟，用滤布过滤，滤液加水稀释至原来的体积。再加葡萄糖2份，琼脂1.5份，自然pH值，分装至试管，15磅灭菌20分钟。划线接种啤酒酵母菌株，28～32℃培养。以上均为重量份。\nB.二级菌种(液体)培养基配方同斜面，但不加琼脂，自然pH值，500ml三角烧瓶分装并塞棉塞，15磅灭菌20分钟，接种上述斜面菌种的菌悬液3～5％重量百分比，28～32℃，150-170rpm摇床培养。\n实施例2：植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌的二级液体菌种的制备，具体操作步骤如下：A.固体菌种蛋白胨1份，酵母粉0.5份，柠檬酸铵0.2份，葡萄糖2份，硫酸镁0.054份，牛肉膏1份，磷酸氢二钾0.2份，醋酸钠0.5份，硫酸锰0.025份，琼脂1.5份，水93.021份，自然pH值，分装至试管，15磅灭菌20分钟。分别划线接种植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌，30～37℃培养。以上均为重量份。\nB.二级菌种(液体)培养基配方同固体菌种培养基，但不加琼脂，自然pH值，500ml三角烧瓶分装并具胶塞，15磅灭菌20分钟，接种上述固体菌种的菌悬液3～5％重量百分比，30～37℃静置恒温培养。\n实施例3：液体复合微生物肥料的制备制备方法：将土豆5份、红糖5份、葡萄糖2份、蛋白胨0.5份、硫酸镁0.1份、硫酸锰0.1份、磷酸氢二钾0.1份、氯化钠0.1份混合，加洁净的水87.1份溶解，116℃通蒸汽进行灭菌，首先接种啤酒酵母二级液体菌种1份，30～32℃培养16小时，再接种植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌两种益生菌按1∶1体积比混合二级液体菌种(种子液)共2份，36～37℃继续培养26小时，pH降至3.5时收获，无菌条件下装瓶，所得复合微生物肥料为酸性棕色液体，活菌含量10亿/mL。以上均为重量份。\n实施例4：液体复合微生物肥料的制备制备方法：将土豆2份、红糖9份、葡萄糖1份、蛋白胨0.2份、硫酸镁0.01份、硫酸锰0.01份、磷酸氢二钾0.01份、氯化钠0.1份混合，加洁净的水87.67份溶解，116℃通蒸汽进行灭菌，首先接种啤酒酵母二级液体菌种0.5份，30～32℃培养20小时，再接种植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌两种益生菌按1∶1体积比混合种子液共2份，35～36℃继续培养28小时，pH降至3.7时收获，无菌条件下装瓶，所得复合微生物肥料为酸性棕色液体，活菌含量10亿/mL。以上均为重量份。\n实施例5：液体复合微生物肥料的制备制备方法：将土豆9份、红糖3份、葡萄糖5份、蛋白胨1.5份、硫酸镁0.15份、硫酸锰0.15份、磷酸氢二钾0.5份、氯化钠1份混合，加洁净的水79.7份溶解，116℃通蒸汽进行灭菌，首先接种啤酒酵母二级液体菌种0.5份，28～30℃培养24小时，再接种植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌两种益生菌按1∶1体积比混合种子液共1份，34～35℃继续培养30小时，pH降至3.9时收获，无菌条件下装瓶，所得复合微生物肥料为酸性棕色液体，活菌含量10亿/mL。以上均为重量份。\n实施例6：用实施例3所生产的液体复合微生物肥料进行田间试验，2005年由山东省农业技术推广总站组织在山东临沂市河东区大棚西红柿进行喷洒试验。试验基础情况：棚长63米，宽7米，前茬作物芹菜。供试品种毛粉802。栽植密度4600株/亩。随机区组排列，小区面积33.3m2，三次重复。分别于3月23日、3月30日和4月10日喷洒液体复合微生物肥料500倍稀释液，对照为喷洒清水。\n试验结果表明，番茄喷洒复合微生物肥料后7天即表现叶色浓绿，而且生育后期调查叶片厚度有所增加，收获期番茄果实大，色泽好，单株结果数量多。收获时每处理随机取30个果实测果径并称重，复合微生物肥料处理平均果径为6.3cm，对照平均果径为5.8cm，复合微生物肥料处理平均果径比对照增加0.5m。复合微生物肥料处理平均单果重148g，对照处理为134g，复合微生物肥料处理单果重比对照增加14g。产量结果表明，复合微生物肥料处理小区平均产量225.4Kg，对照区平均产量193.2Kg，统计分析差异达显著水平。施用液体复合微生物肥料后每亩增产番茄888.0kg，增产率为23.0％(表1)表1复合微生物肥料对番茄产量的影响\n注：*为5％水平差异显著。( )内数字为比对照增加或降低的值。\n实施例7：用实施例3所生产的液体复合微生物肥料进行田间试验，2005年由山东省农业技术推广总站组织在山东淄博市张店区大棚黄瓜进行喷洒试验。试验基础情况：棚长63米，宽7米，前茬作物西红柿。供试品种津春2号。每亩施优质有机肥5000kg。设喷施复合微生物肥料和喷施清水(CK)两个处理。随机区组设计，三次重复。小区面积66.6m2。3叶1心期定植(3月18日)，于6叶1心期(5月1日)开始喷洒复合微生物肥料500倍稀释液，喷洒时间分别为5月1日、5月10日和5月20日。对照为喷洒清水。黄瓜生育后期调查发病情况，收获时分次单独计产并统计畸型瓜率，最后累计产量进行统计分析。\n结果表明，黄瓜植株喷洒复合微生物肥料后叶片颜色变为浓绿。生长后期调查，复合微生物肥料处理病株率为7.2％，清水对照为33.2％，复合微生物肥料处理比对照病株率降低26个百分点，说明复合微生物肥料能提高黄瓜植株的抗病能力。黄瓜使用复合微生物肥料后瓜条直而匀称，畸型瓜率降低22个百分点，而且口感好(品质另测定)，市场销售价格比对照高。复合微生物肥料处理小区产量比对照增加122.5kg，方差分析达显著水平，每亩增产黄瓜1225kg，增产率为25.2％，经济效益十分显著(表2)。\n表2复合微生物肥料对黄瓜产量的影响\n注：*为5％水平差异显著。( )内数字为比对照增加或降低的值。\n实施例8：用实施例3所生产的液体复合微生物肥料进行经口急性毒性试验：本试验由山东医科大学公共卫生学院毒理学研究室进行。将本发明液体复合微生物肥料原液饲喂昆明种小鼠60只，体重18-22g，雌雄各半。将小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半，禁食12h后，经口灌胃，剂量分别为40mL/kg，32mL/kg，25.6mL/kg，20.5mL/kg，16.4mL/kg，13.1mL/kg(r＝0.8)。小鼠给药后连续观察14天，记录小鼠中毒症状和死亡数，根据各组小鼠死亡率，用Bliss法计算LD50和95％可信限。结果见表3。\n表3液体复合微生物肥料原液小鼠急性毒性试验结果\n小鼠急性毒性反应：经口给受试动物后小鼠无异常现象。\n结果表明小鼠一次经口给予液体复合微生物肥料原液半数致死剂量LD50大于40mL/kg。