一种反刍动物复合微生态制剂及其应用

暂无

一种反刍动物复合微生态制剂及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于微生物发酵及微生态制剂技术领域，具体涉及包含多种益生菌的针对反刍动物的复合微生态制剂及其制备方法和应用。\n背景技术\n[0002] 针对反刍动物（牛、羊）疾病的预防和治疗，目前国内外兽医临床主要采用的是在饲料中添加抗生素和化学合成药物来进行治疗。由于反刍动物拥有特殊的消化生理结构，其瘤胃是一个天然发酵罐，分布有成千上万种有益微生物和纤毛虫，长期使用抗生素和化学合成药物会导致机体正常菌群失调，易导致二重感染，另外，抗生素还会在畜产品（肉、奶、皮毛等）中产生残留，进而通过食物链进入人体内，威胁人类健康。世界各国饲料行业对抗生素禁用和限用的呼声越来越高，并禁用了一批毒性较大和残留较大的药物，因此，改变养殖观念，以提高动物机体免疫力为先，“预防为主，防重于治”，并开发应用无毒无药残的新型绿色饲料添加剂成为必然趋势。\n[0003] 微生态制剂由益生菌经工业化发酵制备得到，其包含多种有益微生物及其代谢产物，可直接饲喂动物，通过维持肠道内微生态平衡而发挥作用，具有防病、增强机体免疫力、促进生长、增加体重等多种功能，是一种多功能、无毒无害、无残留、不污染环境的绿色饲料添加剂。\n[0004] 目前，市场上的微生态制剂主要存在以下问题：\n[0005] （1）主要针对单胃动物，不适宜于反刍动物复杂多变的瘤胃内环境，所含各种益生菌对胃酸和胆碱耐受性不良，活菌数量少，在消化道内难以保持活性；\n[0006] （2）缺乏益生菌间拮抗性的测试和研究，往往只是将各种菌株进行简单的复配，未充分考虑到菌种协同和拮抗效应，配比不科学，影响实际应用效果；\n[0007] （3）缺乏菌株毒性测试，存在潜在的食用安全隐患；\n[0008] （4）缺乏针对反刍动物免疫增强作用的应用效果检测数据，尤其是针对反刍动物特有常见疾病（如口蹄疫）的免疫防御效果，实际免疫促进效果有待考察；\n[0009] （5）涉及菌株种类较多，发酵工序复杂，费时费力。\n[0010] 综上所述，开发一种针对反刍动物的耐酸耐胆盐、各益生菌间无拮抗性、安全性好且具有良好促生长以及免疫增强效果的微生态制剂十分必要。\n发明内容\n[0011] 针对现有微生态制剂存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种反刍动物复合微生态制剂及其应用。该复合微生态制剂所含菌株耐酸耐胆碱性强、相互之间无拮抗性、安全性好，制备工艺简单，成品活菌含量高，可显著提高反刍动物生产性能和免疫力。\n[0012] 本发明的技术方案如下：\n[0013] 一种反刍动物复合微生态制剂，其制备方法如下：将枯草芽胞杆菌CGMCC1.257、嗜酸乳杆菌LB-1、植物乳杆菌WZ47-1、啤酒酵母CGMCC2.597和产朊假丝酵母CGMCC2.1180分别经液体一级种子培养和液体二级培养后得到二级菌种，再取所述嗜酸乳杆菌LB-1、植物乳杆菌WZ47-1、啤酒酵母CGMCC2.597和产朊假丝酵母CGMCC2.1180的二级菌种分别按体积质量比5%的接种量接种至固体混合发酵培养基，混匀，于32~35℃发酵6h，然后按相同的接种量接种所述枯草芽胞杆菌CGMCC1.257的二级菌种，混匀，继续发酵42h，取发酵物于\n4~8℃真空密封保存，即得复合微生态制剂成品；所述固体混合发酵培养基所含成分按重量百分数计为：麸皮60%，豆粕25%，玉米粉15%；所述复合微生态制剂的活菌含量分别为：枯\n8\n草芽胞杆菌CGMCC1.257和植物乳杆菌WZ47-1不低于10cfu/g，嗜酸乳杆菌LB-1不低于\n7 6\n10cfu/g、啤酒酵母CGMCC2.597和产朊假丝酵母CGMCC2.1180不低于10cfu/g。\n[0014] 其进一步的技术方案为：\n[0015] 所述枯草芽胞杆菌CGMCC1.257的液体一级种子培养和液体二级培养方法如下：\n挑取营养琼脂斜面上生长的菌种接种于20~30ml营养肉汤培养基，于34~37℃，180 r/min振荡培养18~24h，得到一级种子液；再取10~25ml该一级种子液接种于200~250ml营养肉汤培基中继续振荡培养18~24h，得到二级菌种。\n[0016] 所述嗜酸乳杆菌LB-1和植物乳杆菌WZ47-1的液体一级种子培养和液体二级培养方法如下：分别挑取MRS斜面上生长的嗜酸乳杆菌LB-1和植物乳杆菌WZ47-1并接种于20~30mlMRS肉汤培养基，于34~37℃，180 r/min振荡培养24~48h，得到一级种子液；再取10~25ml各菌株的一级种子液分别接种于200~250mlMRS肉汤培养基中继续振荡培养\n24~48h，得到二级菌种。\n[0017] 所述啤酒酵母CGMCC2.597和产朊假丝酵母CGMCC2.1180的液体一级种子培养和液体二级培养方法如下：分别挑取孟加拉红培养基斜面上生长的啤酒酵母CGMCC2.597和产朊假丝酵母CGMCC2.1180并接种于20~30ml麦芽汁培养基，于28~36℃，180 r/min振荡培养24~30h，得到一级种子液；再取15~30ml各菌株的一级种子液分别接种于200~250ml麦芽汁培养基，继续振荡培养24~36h，得到二级菌种。\n[0018] 所述二级菌种的活菌含量均为108 cfu/ml。\n[0019] 所述固体发酵培养的温度为34~35℃。\n[0020] 本发明还提供一种上述反刍动物复合微生态制剂在提高反刍动物生产性能和免疫力上的应用，是将所述复合微生态制剂作为饲料添加剂按照每头40~45g的量添加到反刍动物基础日粮中进行饲喂。\n[0021] 本发明的有益技术效果如下：\n[0022] 本发明针对反刍动物特有的生理消化特点，提供一种专门针对反刍动物的复合微生态制剂，与现有市售 微生态制剂相比，具有以下突出优点：\n[0023] （1）本发明所含菌株对酸性和胆盐的耐受性好，适宜于反刍动物复杂多变的瘤胃内环境，可保证在消化道内的有效活菌数量。\n[0024] （2）本发明充分考虑到菌种间的协同和拮抗效应，选用相互之间完全无拮抗性的五株益生菌，通过科学配比可起到协同增效作用。\n[0025] （3）本发明所选菌株菌为“饲料添加剂品种目录（2008年）”中规定的菌株，且经过毒性测试证明其无毒无害，安全性好。\n[0026] （4）本发明采固体混合发酵的制备方法，预先筛选出最佳混合发酵培养条件，将五株菌置于同一固体发酵培养基进行同时发酵，避免了各菌株分别单独发酵的繁琐工序，操作简便，制备工艺简单，成品活菌含量高。\n[0027] （5）养殖生产实践证明：本发明复合微生态制剂可显著提高反刍动物的综合生产性能，促生长效果明显；同时能有效增强机体淋巴细胞和吞噬细胞活性，进而增强机体免疫力和抗病力，符合“预防为主，防重于治”的现代养殖理念，具有广阔的应用前景。\n具体实施方式\n[0028] 以下通过实施例对本发明进行具体说明。\n[0029] 本发明实施例所使用生物材料如下：\n[0030] 嗜酸乳杆菌LB-1和植物乳杆菌WZ47-1均由本申请人所在的内蒙古农业大学兽医学院预防教研室微生物实验中心分离、鉴定和真空冷冻干燥保藏，并已在下述非专利文献公开：嗜酸乳杆菌LB-1 （2005年内蒙古农业大学硕士学位论文《奶牛微生态制剂的研制》，作者：王美秀），植物乳杆菌WZ47-1（2006年内蒙古农业大学博士学位论文《内蒙古牧区传统乳制品中乳杆菌生物学特性及其益生作用的研究》，作者：周雨霞），以下分别简称嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌；枯草芽孢杆菌CGMCC1.257、啤酒酵母CGMCC2.597、产朊假丝酵母CGMCC2.1180均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），并由本申请人所在实验中心（同上）真空冷冻干燥保藏，以下分别简称枯草芽孢杆菌、啤酒酵母、产朊假丝酵母；致病性大肠杆菌CVCC2059购自中国兽医药品监察所，致病性金黄色葡萄球菌CVCC2086购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），以下分别简称大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。\n[0031] 营养肉汤、麦芽汁培养基、孟加拉红培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；营养琼脂，MRS肉汤、MRS琼脂、伊红美蓝培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；Kranep琼脂基础培养基：牛肉膏1g、蛋白胨10g、甘露醇10g、氯化钠75g、酚红0.025、琼脂15g、蒸馏水\n1000ml，pH值7.5，121℃高压灭菌15min。\n[0032] 上述各菌株在使用时预先进行斜面菌种活化，所用斜面培养基为：MRS斜面（嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌）、营养琼脂斜面（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）、孟加拉红培养基斜面（啤酒酵母以及产朊假丝酵母）。\n[0033] 其他原料和试剂均为市售商品。\n[0034] 实施例1 菌种的特性研究\n[0035] 1.1 菌株间拮抗性试验\n[0036] 用接种针挑取保存于斜面上的枯草芽孢杆菌并在营养琼脂平板培养基上划三条平行线，然后再分别挑取嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、啤酒酵母和产朊假丝酵母在上述营养琼脂平板培养基上各划一条线，方向与上述三条平行线垂直相交，将平板置于37℃恒温培养箱中培养24～48h，观察划线相交处的菌落是否连续，以此来证明枯草芽孢杆菌与其他四株菌是否拮抗，其他菌株的拮抗性试验方法同上，其中，嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌使用MRS琼脂平板，啤酒酵母和产朊假丝酵母用孟加拉红平板。\n[0037] 试验结果：营养琼脂平板上的枯草芽孢杆菌与其他四株菌划线相交处的菌落连续，表明枯草芽孢杆菌与其它四株菌无拮抗作用；MRS琼脂平板上嗜酸乳杆菌和与其它四株菌划线相交处的菌落连续，表明嗜酸乳杆菌与其它四株菌无拮抗作用，同时，植物乳杆菌与其它四株菌划线相交处的菌落连续，表明植物乳杆菌与其它四株菌无拮抗作用；孟加拉红琼脂平板上啤酒酵母与其它四株菌划线相交处的菌落连续，表明啤酒酵母与其它四株菌无拮抗作用，同时，产朊假丝酵母与其它四株菌划线相交处的菌落连续，表明产朊假丝酵母与其它四株菌无拮抗作用。\n[0038] 1.2 菌株安全性检测\n[0039] 采用急性毒性试验（小鼠腹腔注射法）：取40只小白鼠，随机分成8组，每组5只，一组作为对照组，其余七组作为试验组，对照组小白鼠腹腔注射生理盐水0.2ml，试验组小白鼠腹腔分别注射枯草芽孢杆菌菌液、嗜酸乳杆菌菌液、植物乳杆菌菌液、啤酒酵母菌液和\n9\n产朊假丝酵母菌液（用麦氏比浊管作对比调整各菌液浓度为5×10CFU/ml）0.2ml，一种菌液对应一个试验组；于室温饲养观察七天，通过小白鼠的临床表现及剖检变化，确定菌株的安全性。\n[0040] 试验结果：在试验过程中，小白鼠的各种表现均正常，试验结束后，剖检观察发现试验组小白鼠各个内脏器官与对照组相比无任何异常变化，从小白鼠腹腔中也未分离到攻击菌，证明本发明复合微生态制剂安全性好，饲喂无毒副作用。\n[0041] 1.3 耐酸性试验\n[0042] 1.3.1 不同pH值培养基的配制\n[0043] 用HCl和NaOH调节营养肉汤的pH值分别为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、8.5、7.4（对照）；调节MRS肉汤的pH值分别为2.5、3.5、4.5、5.5、7.5、8.5、6.2（对照）；调节麦芽汁培养基的pH值分别为2.5、3.5、4.5、6.5、7.5、8.5、5.6（对照）。将各pH值培养基分装到100ml三角瓶中，每瓶装50ml，高压灭菌备用。\n[0044] 1.3.2 菌液的制备\n[0045] 将斜面上的枯草芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基（pH7.4），37℃培养18～24h，置于4℃冰箱备用；将斜面上的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌分别接种于MRS肉汤培养基（pH6.2），于37℃培养48h，置于4℃冰箱备用；将斜面上的啤酒酵母和产朊假丝酵母分别接种于麦芽汁培养基（pH5.6），30℃培养36～48h，置于4℃冰箱备用。\n[0046] 1.3.3 指示菌菌悬液的制备\n[0047] 将1.3.2中制备的各菌液4000r/min离心10min ，弃上清液，将菌体沉淀悬浮于灭\n8\n菌生理盐水中，再离心洗涤1次，弃上清液，最后制成浓度为 3.0×10CFU/ml 的菌悬液（活菌计数采用平板稀释计数法），备用。\n[0048] 1.3.4 测定方法\n[0049] 取1.3.3制备的枯草芽孢杆菌菌悬液1ml接种到不同pH值营养肉汤培养基中，于\n37℃静置培养4h，取样，采用平板稀释计数法活菌计数，以对照组的活菌数为对照计算存活率。\n[0050] 取1.3.3制备的嗜酸乳杆菌菌悬液1ml接种到不同pH值MRS肉汤培养基中，于\n37℃静置培养4h，取样，计数及对照设置同上；植物乳杆菌耐酸性试验测定方法同嗜酸乳杆菌耐酸性试验。\n[0051] 取1.3.3制备的啤酒酵母菌菌悬液1ml接种到不同pH值的麦芽汁培养基中，于\n30℃静置培养48h，取样，计数及对照设置同上；产朊假丝酵母耐酸性试验方法同啤酒酵母耐酸性试验。\n[0052] 试验结果：五株菌对酸均有较好的耐受性。其中啤酒酵母、枯草芽孢杆菌耐酸性最强，在pH3.0的液体培养基中静置培养4h后，存活率为分别为66.4%、60.4%；其次为产朊假丝酵母，在pH3.0的液体培养基中静置培养4h后，存活率为56.6%；再次为嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌，在pH 3.0的液体培养基中静置培养4h后，存活率分别为64.3%、54.1%。\n[0053] 1.4 耐胆盐试验\n[0054] 1.4.1 不同胆盐浓度培养基的配制\n[0055] 配制营养肉汤、MRS肉汤、麦芽汁培养基，向上述各种液体培养基中加入牛胆盐，使其质量浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%（W/V），以不加牛胆盐为对照组，将各胆盐浓度培养基分装到100ml三角瓶中，每瓶装50ml，高压灭菌备用。\n[0056] 1.4.2 测定方法\n[0057] 取1.3.3制备的枯草芽孢杆菌菌悬液1ml，接种到不同胆盐浓度的营养肉汤培养基中，于37℃静置培养6h，取样，采用平板稀释计数法活菌计数，以对照组的活菌数为对照计算存活率。\n[0058] 取1.3.3制备的嗜酸乳杆菌菌悬液液1ml接种到不同胆盐浓度的MRS肉汤培养基中，于37℃静置培养6h，计数及对照设置同上。植物乳杆菌耐胆盐试验测定方法同嗜酸乳杆菌耐胆盐试验。\n[0059] 取1.3.3制备的啤酒酵母菌菌悬液1ml接种到不同胆盐浓度的麦芽汁培养基中，于30℃静置培养6h，计数及对照设置同上。产朊假丝酵母耐胆盐试验测定方法同啤酒酵母耐胆盐试验。\n[0060] 试验结果：五株菌对胆盐均有较好的耐受力。其中枯草芽孢杆菌耐胆盐性[0061] 最强，在牛胆盐浓度为0.7%（W/V）的液体培养基中静置培养4h后，存活率为\n86.3%；植物乳杆菌和产朊假丝酵母在牛胆盐浓度为0.5%（W/V）的液体培养基中静置培养\n6h后，存活率分别为34.3%、29.2%；嗜酸乳杆菌、啤酒酵母在牛胆盐浓度为0.3%（W/V）的液体培养基中静置培养4h后，存活率分别为33.3%、27.2%。\n[0062] 以上1.3 耐酸性试验、1.4 耐胆盐试验中枯草芽孢杆菌菌落计数采用营养琼脂培养基，培养温度为37℃，培养时间为24h；嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌菌落计数采用MRS培养基，培养温度为37℃，培养时间为48h；啤酒酵母、产朊假丝酵母菌落计数采用孟加拉红培养基，培养温度为30℃，培养时间为48h。\n[0063] 1.5 病原菌拮抗试验\n[0064] 1.5.1 试验菌菌悬液的制备\n[0065] 试验菌枯草芽孢杆菌在营养肉汤液体培养基中于37℃、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌在MRS液体培养基中于37℃、啤酒酵母和产朊假丝酵母在麦芽汁液体培养基中于30℃分别培养 2 代，4℃保存备用。\n[0066] 1.5.2 指示菌菌悬液的制备\n[0067] 将指示菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别于营养肉汤培养基中37℃培养 24h 。\n然后， 4000rpm 离心 10min ，弃上清液，菌体悬浮于灭菌生理盐水中，再离心洗涤 1次，最\n8\n后制成浓度为 3.0 ×10CFU/mL 的菌悬液，备用。\n[0068] 1.5.3 抑菌性的测定\n[0069] 本试验采用牛津杯定量扩散法。在灭菌平皿内加入10mL 2%的灭菌琼脂，冷凝后\n8\n放入灭菌的牛津杯，将含菌数为 3.0 ×10CFU/mL 的200??L 指示菌菌悬液加入到15mL 温度为50℃的指示菌生长培养基中，迅速混合均匀，倒入平皿；冷凝后用无菌镊子取出牛津杯，加100??L待测试验菌菌悬液于孔内，室温扩展 3～5h，37℃培养12～15h ，测抑菌圈直径，并设重复，取抑菌圈直径的平均值。\n[0070] 试验结果：抑菌性试验结果表明，五株菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，其中枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌的抑菌作用较强，啤酒酵母和产朊假丝酵母抑菌作用较弱。\n[0071] 实施例2 复合微生态制剂的制备\n[0072] 2.1 菌种的液体一级种子培养和液体二级培养\n[0073] 枯草芽胞杆菌：挑取营养琼脂斜面上生长的菌种接种于装有20ml营养肉汤的三角瓶中，于37℃，180 r/min振荡培养24h，得到一级种子液；再取10ml该一级种子液接种\n8\n于装有200ml营养肉汤的三角瓶中，继续振荡培养36h至活菌含量为10cfu/ml，得到二级菌种。\n[0074] 嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌：分别挑取MRS斜面上生长的嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌并接种于装有20mlMRS肉汤的三角瓶中，于37℃，180 r/min振荡培养24~48h，得到一级种子液；再取10ml各菌株的一级种子液分别接种于装有200ml MRS肉汤的三角瓶中继续振荡\n8\n培养24h至活菌含量为10cfu/ml，得到二级菌种。\n[0075] 啤酒酵母和产朊假丝酵母：分别挑取孟加拉红培养基斜面上生长的啤酒酵母和产朊假丝酵母并接种于装有20 ml麦芽汁培养基的三角瓶中，于30℃，180 r/min振荡培养\n30h，得到一级种子液；再取15ml各菌株的一级种子液分别接种于200 ml麦芽汁培养基，继\n8\n续振荡培养24h至活菌含量为10cfu/ml，得到二级菌种。\n[0076] 2.2 最佳混合发酵温度的确定\n[0077] 将2.1制备的二级菌种，均以体积质量比5%的接种量接种于固体混合发酵培养基（其成分为：麸皮60g，豆粕25g，玉米粉15g，发酵前处理过程：将各种固体培养基成分混匀，加入60 ml水搅拌均匀），再按上述比例依次加入各种菌的二级菌种搅匀，分成五份，分别在\n32.0℃、33.0℃、34.0℃、34.5℃、35.0℃的条件下发酵30h，测定发酵物中各种菌的活菌数。\n[0078] 枯草芽孢杆菌活菌计数采用营养琼脂；嗜酸乳杆菌菌液和植物乳杆菌活菌计数采用MRS培养基；啤酒酵母和产朊假丝酵母活菌计数采用孟加拉红培养基。\n[0079] 试验结果：活菌计数结果表明，在32~35℃时活菌数较高，最优选地，温度为\n10\n34.5℃时活菌数最高，达到1.525×10 cfu/g，因此为固体混合发酵的最佳温度。\n[0080] 2.3 固体混合发酵培养和复合微生态制剂的保存\n[0081] 取2.1制备的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、啤酒酵母和产朊假丝酵母的二级菌种分别按照体积质量比5%的接种量接种于固体混合发酵培养基（其成分为：麸皮60g，豆粕25g，玉米粉15g，发酵前处理过程：将各种固体培养基成分混匀，加入60 ml水搅拌均匀），再按上述比例依次加入各种菌的二级菌种搅匀发酵，于34.5℃发酵6h，再按相同的接种量接种\n2.1中制备的枯草芽孢杆菌二级菌种，混匀，继续发酵24h，发酵完毕，取发酵物装入真空密封袋，于4℃保存，即得复合微生态制剂成品。\n[0082] 应用实施例\n[0083] 饲喂试验：\n[0084] 挑选120头体重在16.55~40.1kg，3~4月龄的蒙古羔羊，随机分成两个组，每组60只，一组为试验组，一组为对照组；试验组按照每头40克（湿重）的量将实施例2 2.3所制