一种人重组分泌型内皮抑素蛋白及其制备方法和应用

1.一种人重组分泌型内皮抑素蛋白，其特征是，可通过下述方法制得：
(1)从新鲜胎肝组织抽提总RNA；
(2)利用内皮抑素互补DNA(cDNA)序列，设计上下游引物P1、P2，其中在上游加 入EcoR I酶切位点，下游加入Not I酶切位点；
(3)以上述抽提的总RNA为模板，进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，获得内皮抑 素cDNA；
(4)通过凝胶电泳、质粒抽提、离心法回收内皮抑素cDNA；
(5)以上述回收的cDNA，与克隆质粒(pGEM-T)连接，转化大肠杆菌JM109。
(6)以P1、P2为引物进行PCR扩增，筛选扩增阳性的含内皮抑素基因的克隆，抽提 质粒DNA，测序鉴定；
(7)以常规方法利用限制性内切酶EcoR I、Not I双酶切含内皮抑素(endostatin) 基因的克隆质粒(pGEM-endostatin)，实现与pGAPZαA酵母表达质粒的连接；
(8)取步骤7的连接产物转化大肠杆菌JM109，筛选含内皮抑素(endostatin)基 因的阳性重组表达载体工程菌，抽提质粒DNA，测序鉴定；
(9)以限制性内切酶Avr II单酶切含endostatin基因的重组酵母表达质粒pGAPZα A-endostatin，0.8％琼脂糖电泳回收完全线性化的质粒DNA，与酵母菌GS115的感 受态菌液混合进行电转化；
(10)利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选重组阳性表达酵母菌；
(11)取上述重组阳性表达酵母菌经Sepharose G25和肝素亲和层析柱过柱分离、纯 化，制得内皮抑素(endostatin)表达蛋白，即人重组分泌型内皮抑素蛋白，分子 量约为：32KD，包括至少183个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的人重组分泌型内皮抑素蛋白，其特征在于，所述逆转录多聚酶 链反应(RT-PCR)，扩增内皮抑素cDNA所用引物P1、P2为：
P1：5’T GGT  GAA TTC CAC AGC CAC CGC GAC TT 3’
            EcoR I
P2：5’TAA  TGC GGC CGC CTT GGA GGC AGT CAT G 3’
            Not I
3.根据权利要求1所述的人重组分泌型内皮抑素蛋白，其特征在于，所述逆转录多聚 酶链反应(RT-PCR)的反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，65℃退火1 分钟，72℃延伸1分钟；进行35个循环后，72℃延伸5分钟。
4.根据权利要求1所述的人重组分泌型内皮抑素蛋白，其特征在于，所述酵母菌表达 载体是pGAPZαA质粒DNA。
5.一种如权利要求1所述的人重组分泌型内皮抑素蛋白的制备方法，包括如下顺序的 步骤：
(一)内皮抑素基因的克隆：
①引物设计：
根据内皮抑素互补DNA(cDNA)序列，设计上下游引物P1、P2及限制性内切酶位点， 其中在上游加入EcoR I酶切位点，下游加入Not I酶切位点
P1：5’T GGT  GAA TTC  CAC AGC CAC  CGC GAC TT 3’
             EcoR I
P2：5’TAA  TGC GGC CGC CTT GGA GGC AGT CAT G 3’
             Not I
②胎肝组织总RNA的抽提：
取液氮冻存之新鲜胎肝0.75g，迅速加入Trizol试剂7.5ml，研磨至液体澄清后， 加入等体积氯仿/异戊醇12000rpm 10分钟离心，吸取上清，以无水乙醇沉淀后，溶于 50μl DEPC处理的水中，-20℃保存备用；
③内皮抑素(endostatin)cDNA的制备：
采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增endostatin基因，先以抽提的总RNA为模 板，进行逆转录反应，扩增cDNA第一链，反应体系为：
RNA模板                         18μl
5×缓冲液                       10μl
寡脱氧胸腺嘧啶Oligo(dT)         2.5μl(150ng)
二硫苏糖醇(DTT)                 5μl(0.01M)
RNA酶抑制剂(Rnasin)             1.5μl(60U)
逆转录酶(M-MuLV)                3μl(600U)
脱氧ATP、TTP、GTP、CTP(dNTP)    10μl(0.5mM)
混匀后，37℃，1小时扩增，再置100℃5分钟终止，取逆转录反应产物25μl， 以P1、P2为引物，PCR扩增内皮抑素(endostatin)cDNA，反应体系为：
逆转录(RT)反应产物              25μl
10×缓冲液                      10μl
P1                              2.5μl(0.5μM)
P2                              2.5μl(0.5μM)
脱氧ATP、TTP、GTP、CTP(dNTP)    8μl(0.2μM)
耐热高保真DNA多聚酶(pfu Taq酶)  1μl(5u)
补足双蒸水至                    100μl
反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃，延伸 1分钟；进行35个循环后，72℃延伸5分钟；
不加逆转录(RT)反应产物为阴性对照；
④内皮抑素(endostatin)cDNA的回收：
RT-PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，切下550bp的目的DNA条带，经25℃、 -20℃反复冻融后，置于质粒抽提盒微粒中，10000rpm离心5分钟后，收取滤过液体， 加入2倍体积无水乙醇，置于-20℃，30分钟后，12000rpm 4℃条件下离心10分钟， 沉淀即为纯化的目的DNA；
⑤内皮抑素(endostatin)基因的T-A克隆：
将1-2μl回收的cDNA中加入dATP和Taq酶及10×缓冲液各1μl，补足双蒸水至 10μl，72℃条件下，延伸15分钟加A尾，并纯化回收cDNA；取此种目的基因DNA及 pGEM-T载体各1μl，加入T4连接酶1μl，10×缓冲液1μl及双蒸水6μl，4℃条件下， 16-18小时，完成T-A配对；
⑥重组克隆的筛选、鉴定：
常规制备大肠杆菌JM109感受态，取2μl步骤⑤制备的连接产物，以CaCl2法转化 大肠杆菌JM109感受态，转化产物涂布于含200mg/ml x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖)40μl及20mg/ml IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)4μl的LA板中，随机 挑选8个白色单菌落。37℃活化12小时后，抽提质粒DNA，以P1、P2为引物进行PCR 扩增，挑选扩增阳性的克隆，抽提质粒DNA，测序鉴定；
(二)内皮抑素(endostatin)基因的表达
①pGAPZαA酵母表达质粒的扩增、提取：
大肠杆菌JM109按常规活化后制备感受态，取pGAPZαA质粒DNA 1μl，常规CaCl2 法转化JM109，将转化后的JM109菌液涂布于含25μg/ml Zeocin的低盐LB平板中， 18-22小时后取单菌落，扩增，并以质粒抽提试剂盒抽提质粒；
上述低盐LB平板的配方为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％， pH7.5；
②内皮抑素(endostatin)基因的亚克隆：
限制性内切酶Not I、EcoR I分别双酶切含endostatin基因的克隆质粒 (pGEM-endostatin)和空表达载体pGAPZαA，经0.8％琼脂糖电泳，分别回收约550bp 的目的DNA和3kb的表达载体DNA凝胶块于1.5ml管中，-20℃、25℃反复冻融三次后， 置于质粒抽提盒微粒中，10000rpm离心5分钟后，收取滤过液体，加入2倍体积无水 乙醇，置于-20℃ 30分钟后，12000rpm 4℃条件下，离心10分钟，沉淀DNA加入1ml75％ 乙醇漂洗，12000rpm 4℃条件下，离心10分钟，弃上清；将回收的目的DNA和表达载 体DNA一起溶于8μl双蒸水中，加入1μl T4连接酶及2μl 5×缓冲液，室温连接16-18 小时后，取连接产物10μl转化JM109，并涂布于含25μg/ml Zeocin的低盐LB平板中， 同时以转化不含endostatin基因的pGAPZαA质粒作为空白对照；
③内皮抑素(endostatin)亚克隆的筛选、鉴定：
从Zeocin低盐LB平板中挑选单克隆，接种于含Zeocin的低盐LB培养基中，37℃ 避光培养，抽提质粒DNA，分别以酶切、PCR法筛选上述含endostatin基因的阳性重组 菌，抽提质粒DNA，测序鉴定；
上述低盐LB培养基的配方为：酵母提取物0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，pH7.5；
④酵母菌GS115的感受态制备：
取毕赤酵母菌GS115菌种10μl，接种于2ml YPD培养基中，30℃摇床振荡12-16 小时后，取GS115菌液100μl，接种于100mlYPD中，30℃振荡培养12-16小时；当菌 液OD600为1.3～1.5时，取出，2500rpm 4℃离心7分钟，沉淀以200μl的1M D-山梨 醇重悬，置冰浴中；
上述YPD培养基配方为：酵母抽提物1％，胰蛋白胨2％，D-葡萄糖2％；
⑤电转化实验：
以限制性内切酶Avr II单酶切含endostatin基因的重组酵母表达质粒pGAPZα A-endostatin，以前述方法，用0.8％琼脂糖电泳回收完全线性化的质粒DNA，溶于10 μl双蒸水中；取GS115感受态菌液80μl与10μl线性化质粒DNA混合，冰浴5分钟 后，加入0.2cm规格的电转杯，以电转仪，1500V电压电击，立即加入1ml的1M山梨 醇溶液，转移至一无菌管中，30℃静置1-2小时后，分别取50、100、200、400μl涂 布于含100μg/ml Zeocin的YPDS板上，30℃避光培养三天后，同时以不含endostatin 的空质粒pGAPZαA电转化GS115作对照，挑取单克隆至1ml YPD中，30℃振荡培养至对 数生长期，-20℃冻存；
上述YPDS平板的配方为：酵母提取物1％，胰蛋白胨2％，D-葡萄糖2％，山梨醇1M， 琼脂2％；
⑥SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选阳性表达菌：
电转后的单克隆冻存菌10μl经活化后，以1∶100接种于100ml YPD培养液中， 30℃振荡培养，每隔24小时取菌液5ml，高速离心后去菌体沉淀，将上清分装，-20℃ 保存待测；电泳前，取500μl培养上清，加入2倍体积无水乙醇，-20℃ 30分 钟，12000rpm离心5分钟，沉淀浓缩蛋白，蛋白浓缩后溶于20μl 6×载样缓冲液中，100 ℃3分钟变性后，上样于12％聚丙烯酰胺凝胶，50mA电泳；
⑦endostatin表达蛋白的纯化：
取2L步骤⑥筛选的重组阳性酵母菌及2L转化空载体pGAPZαA的酵母菌第4天培养 上清，分别经8000rpm离心15分钟后，去除沉淀，上清经超滤20倍浓缩，Sepharose G25 柱先经50mM NaCl 10mM Tris.Cl平衡后，将浓缩液上样，经Sepharose G25过柱后去 盐及低分子物质，收集蛋白峰，肝素亲和层析柱按说明安装后，先经50mM NaCl 10mM Tris.Cl平衡，将G25洗脱后的各波峰上样，以50mM-2M NaCl 10mM Tris.Cl梯度缓冲 液洗脱，收集到两个蛋白峰，其中1M NaCl 10mM Tris.Cl洗脱的蛋白峰即为人重组分 泌型内皮抑素蛋白，分子量约为：32KD，包括至少183个氨基酸；0.5M NaCl 10mM Tris.Cl洗脱的蛋白峰为非目的蛋白。
6.权利要求1-5中任意一种所述的人重组分泌型内皮抑素蛋白在制备治疗眼部新 生血管性疾病的药中的应用。
7.根据权利要求6所述的人重组分泌型内皮抑素蛋白在制备治疗角膜新生血管性 疾病的药中的应用。
8.根据权利要求7所述的人重组分泌型内皮抑素蛋白在制备治疗角膜新生血管性 疾病的药中，所使用的有效浓度为40μg/ml-60μg/ml。
9.根据权利要求8所述的人重组分泌型内皮抑素蛋白在制备治疗角膜新生血管性 疾病的药中，特别适用的范围是哺乳类。

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